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(1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院,江蘇南京210009;2.南京工業(yè)大學(xué)國(guó)家生化中心,江蘇南京211816)

γ-亞麻酸(γ-linolenic acid,GLA)分子式為C18H30O2,分子量為 278,它是無(wú)色油狀液體,不溶于水,易溶于石油醚、正己烷等非極性溶劑中,在高溫條件下極易氧化。 GLA是一種ω-6多不飽和脂肪酸[1-2],具有廣泛的生理活性和明顯的藥理作用。GLA可以降血脂,抗糖尿病,抗腫瘤,抗血栓性心腦血管疾病,預(yù)防和治療高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等[3]。GLA 還可增強(qiáng)人體的免疫功能,它是嬰兒不可缺少的營(yíng)養(yǎng)素之一[4]。人和哺乳動(dòng)物自身卻不能合成GLA,一般從天然植物中獲得,但遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足人們的需求。在某些藻類(lèi)和真菌中含有豐富的GLA,真菌發(fā)酵產(chǎn)GLA具有生產(chǎn)周期短、不受自然條件限制、占地面積小、產(chǎn)量穩(wěn)定和含油量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),因而現(xiàn)在利用真菌發(fā)酵生產(chǎn)亞麻酸已成為國(guó)際趨勢(shì)。1986年日本和英國(guó)就能用微生物提取亞麻酸進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn),目前我國(guó)還處于研究階段,加大力度研究微生物工業(yè)化提取亞麻酸的方法是目前研究亞麻酸的一個(gè)重要方面[5]。

GLA為胞內(nèi)產(chǎn)物,因而必須對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破壁處理,選擇合適的破壁方法可最大限度的將GLA提取出來(lái)。目前,研究者常采用的油脂提取方法主要有索氏抽提法、機(jī)械法、有機(jī)溶劑浸提法、酸熱法、超臨界CO2萃取法等[6-7]。索氏法的油脂得率最高,但耗時(shí)較長(zhǎng),用量大;超臨界CO2萃取法油脂得率較索氏法略低,油脂的脂肪酸組成及含量相近,且樣品需要量小,樣品處理能力較索氏法大為提高,但需相應(yīng)設(shè)備;有機(jī)溶劑法提取效果最差;酸熱法效果較好,操作簡(jiǎn)便,但更多用于菌株篩選。目前工業(yè)中仍以經(jīng)球磨機(jī)或高壓勻漿處理菌體后再用有機(jī)溶劑提取的方法為主,但該方法耗能高、噪聲大、并且破壁過(guò)程中容易積聚大量的熱量,易對(duì)GLA造成損失。因而,尋找一種高效、節(jié)能的GLA提取工藝顯得尤為重要。酶法破壁相對(duì)于傳統(tǒng)破壁手段具有反應(yīng)條件溫和、能耗低、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn),近年來(lái)已有許多相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道。萬(wàn)紅貴[8]等用纖維素酶和蛋白酶復(fù)合處理三孢布拉霉優(yōu)化番茄紅素提取率。根據(jù)雅致小克銀漢霉的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)特征,本文研究采用堿性木聚糖酶和堿性蛋白酶復(fù)合處理雅致小克銀漢霉的實(shí)用效果,旨在為工業(yè)化生產(chǎn)提供相應(yīng)的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雅致小克銀漢霉(Cunninghamella elegans) 本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株;堿性蛋白酶(酶活為50000u/g)、堿性木聚糖酶(酶活為35944u/mL) 諾維信中國(guó)生物技術(shù)有限公司;氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、石油醚、正己烷、乙醇 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司,分析純;去離子水 同凱兆業(yè);GLA標(biāo)準(zhǔn)品 南京奧青生物有限公司,色譜純。

JJ-1電動(dòng)攪拌器 常州國(guó)華電器有限公司;LG10-2.4A高速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠;KH2200B超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;RE-85C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海青浦滬西儀器廠;GZX-9140 MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SHB-S循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;HH-2恒溫水浴鍋 金壇市恒豐儀器廠;BS124S電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;GC112A-1氣相色譜儀 上海舜宇恒平設(shè)備有限公司;SPB-3空氣泵 北京中惠普分析技術(shù)研究所;SPH-300氫氣泵 北京中惠普分析技術(shù)研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分析方法

1.2.1.1 GLA含量測(cè)定 分別選取濃度為1、2、3、4、5mg/mL GLA標(biāo)準(zhǔn)品作為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。利用外標(biāo)法,將樣品的峰面積代入,即可得到樣品GLA的含量。

1.2.1.2 菌體含水量測(cè)定 稱(chēng)取一定量GLA濕菌絲體置入80℃烘箱中烘至恒重,計(jì)算菌體含水量。菌體含水量計(jì)算公式如下

式(1)

式中,η為含水量,M為濕菌體質(zhì)量,m為烘干后菌體質(zhì)量。

1.2.1.3 GLA提取率的計(jì)算 稱(chēng)取一定量GLA濕菌絲體置入80℃烘箱中烘至恒重,機(jī)械破碎后以石油醚作為提取劑進(jìn)行索氏提取,索提時(shí)間為8h,索提結(jié)束后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取溶劑蒸發(fā)掉,得到的油脂甲酯化后,經(jīng)氣相色譜檢測(cè),得到GLA的含量。

稱(chēng)取一定量小克銀漢霉?jié)窬z體,按照不同方法對(duì)其進(jìn)行處理后,加入適量的正己烷和乙醇提取GLA,之后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取溶劑蒸發(fā)掉,得到的油脂甲酯化后,經(jīng)氣相色譜檢測(cè),即可得到GLA的含量。由此可得到提取率的計(jì)算公式為:

提取率(%)=一定量的濕菌體經(jīng)不同方法處理后得到的GLA的量/相同量的濕菌體經(jīng)素提后得到的GLA的量×100

式(2)

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 稱(chēng)取一定量的雅致小克銀漢霉菌絲體,在一定條件下加入一定的復(fù)合酶酶進(jìn)行酶解反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后加入一定量的正己烷和乙醇提取GLA,采用氣相檢測(cè)GLA并按式(2)計(jì)算提取率,考察實(shí)驗(yàn)過(guò)程中復(fù)合酶的添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH等因素,獲得最佳的破壁工藝。

1.2.3 復(fù)合酶各因素實(shí)驗(yàn)方法

1.2.3.1 酶添加量對(duì)GLA提取的影響 稱(chēng)取0.01、0.02、0.03、0.04、0.05g復(fù)合酶(堿性蛋白酶與堿性木聚糖酶質(zhì)量比為1∶1),溶于30mL去離子水中,加入到10g雅致小克銀漢霉?jié)窬z體(含水量為η)中。對(duì)照實(shí)驗(yàn)用30mL去離子水代替。自然pH條件下,在50℃恒溫水中反應(yīng)4h后用正己烷-乙醇混合溶劑提取(V正己烷∶V乙醇=4∶1)。收集提取液,測(cè)定GLA含量,計(jì)算提取率。

1.2.3.2 酶解pH對(duì)GLA提取的影響 稱(chēng)取0.03g復(fù)合酶,溶于30mL去離子水中,加入到10g小克銀漢霉?jié)窬z體中,分別調(diào)節(jié)菌絲體pH,為7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0。在50℃恒溫水中反應(yīng)4h后用正己烷-乙醇混合溶劑提取。收集提取液,測(cè)定GLA含量,計(jì)算提取率。

1.2.3.3 酶解溫度對(duì)GLA提取的影響 稱(chēng)取0.03g復(fù)合酶,溶于30mL去離子水中,加入到10g雅致小克銀漢霉?jié)窬z體中,均調(diào)節(jié)pH為9.0。分別在35、40、45、50、55、60℃恒溫水中反應(yīng) 4h后用正己烷-乙醇混合溶劑提取。收集提取液,測(cè)定GLA含量,計(jì)算提取率。

1.2.3.4 酶解時(shí)間對(duì)GLA提取的影響 稱(chēng)取0.03g復(fù)合酶,溶于30mL去離子水中,加入到10g雅致小克銀漢霉?jié)窬z體中,均調(diào)節(jié)pH為9.0。在50℃恒溫水中反應(yīng)1、2、3、4、5、6h后用正己烷-乙醇混合溶劑提取。收集提取液,測(cè)定GLA含量,計(jì)算提取率。

表1 正交實(shí)驗(yàn)表Table 1 The orthogonal experimental design

2 結(jié)果與討論

2.1 GLA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定

由實(shí)驗(yàn)得GLA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程為Y=2112.806X-155.4546,相關(guān)系數(shù)R2=0.99726。

2.2 復(fù)合酶破壁單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 酶添加量對(duì)GLA提取的影響 由圖1可知,隨著復(fù)合酶的添加,GLA的提取率與對(duì)照相比有了明顯提高,但隨著復(fù)合酶的量增加,提取率提高的幅度越來(lái)越不明顯,出于考慮經(jīng)濟(jì)等因素,酶的添加量選擇0.03g,即相對(duì)于濕菌體來(lái)說(shuō),酶的添加量為0.3%為宜。

圖1 酶添加量對(duì)GLA提取的影響 Fig.1 Effect of addition of enzyme on GLA extraction

2.2.2 酶解pH對(duì)GLA提取的影響 由圖2可知,當(dāng)pH為9時(shí),復(fù)合酶的破壁效果最好,GLA提取率為86.2%。這是由于pH為9時(shí)復(fù)合酶的綜合活性最佳,能最大程度上破壞雅致小克銀漢霉的細(xì)胞壁,這使得萃取劑能夠很好地和胞內(nèi)的GLA接觸,將其提取出來(lái)。在其他pH范圍內(nèi),復(fù)合酶的活性受到不同程度的抑制,使得提取率有著不同幅度地下降。

圖2 酶解pH對(duì)GLA提取的影響 Fig.2 Effect of different pH on GLA extraction

2.2.3 酶解溫度對(duì)GLA提取的影響 如圖3所示,在較低溫度時(shí),提取率隨著溫度升高而升高,當(dāng)溫度超過(guò)50℃時(shí),提取率則隨著溫度升高而有所降低。這是因?yàn)樵谳^低溫度時(shí)難以發(fā)揮出復(fù)合酶的全部活力,而溫度太高又容易使復(fù)合酶變性,抑制其活性,故酶解最佳溫度選擇50℃。

圖3 酶解溫度對(duì)GLA提取的影響 Fig.3 Effect of different temperature on GLA extraction

2.2.4 酶解時(shí)間對(duì)GLA提取的影響 由圖4可知,隨著時(shí)間增加,GLA提取率有明顯地提高,但是當(dāng)酶解4h過(guò)后,隨著時(shí)間的增加,GLA的提取率則無(wú)明顯增加,綜合考慮經(jīng)濟(jì)等因素,酶解時(shí)間為4h,此時(shí)提取率達(dá)到87.3%。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)GLA提取的影響 Fig.4 Effect of enzymolysis time on GLA extraction

2.2 復(fù)合酶破壁正交實(shí)驗(yàn)

由單因素實(shí)驗(yàn)可知,酶解pH、酶解溫度、酶解時(shí)間可能會(huì)產(chǎn)生相互影響,有必要對(duì)提取工藝進(jìn)行正交優(yōu)化。在固定酶添加量的前提下,綜合考察酶解pH、酶解溫度、酶解時(shí)間等單因素,通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出最佳提取工藝。

由正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表可知,各因素對(duì)結(jié)果影響都不顯著,但正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)仍有意義。復(fù)合酶對(duì)雅致小克銀漢霉破壁的極差大小順序?yàn)镃>B>D>A,即影響破壁效果的4個(gè)因素的主次順序?yàn)槊柑砑恿俊⒚附鈖H、酶解時(shí)間、酶解溫度。表中最佳的組合為A1B2C2D2,而根據(jù)k值分析,最優(yōu)組合為A2B2C2D2。將這兩個(gè)組合實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),GLA提取率分別為77.8%和87.3%,故組合A2B2C2D2為最佳組合,即復(fù)合酶添加量為0.3%、酶解pH為9、酶解溫度為50℃、酶解時(shí)間為4h為本文最佳條件。

表2 正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表Table 2 The orthogonal experimental result

表3 方差分析Table 3 The analysis of variance

3 結(jié)論

酶破壁法具有反應(yīng)條件溫和,能耗低,環(huán)保等特點(diǎn),更適于工業(yè)化生產(chǎn),與傳統(tǒng)工藝相比,節(jié)約了成本,降低能耗,符合國(guó)家倡導(dǎo)的“低碳經(jīng)濟(jì)”等主題,具有積極的意義。

本文通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn),得到最佳的復(fù)合酶破壁工藝條件為:復(fù)合酶添加量為0.3%、酶解pH為9、酶解溫度為50℃、酶解時(shí)間為4h,在此條件下GLA提取率達(dá)到87.3%。上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可為GLA工業(yè)化生產(chǎn)起一定的參考作用。

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