, ，*, , ,聶登,

(1.貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550000;2.貴州省建材產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，貴州貴陽(yáng) 550002;3.貴州省冶金化工研究所，貴州貴陽(yáng) 550002)

從植物中提取的天然黃酮及總酚類(lèi)化合物安全無(wú)毒,且具有較強(qiáng)的自由基清除能力,能幫助人類(lèi)防治衰老、癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病,現(xiàn)已獲得醫(yī)藥食品界越來(lái)越多的青睞[1]。

辣椒渣為干紅辣椒經(jīng)色素和辣椒堿類(lèi)物質(zhì)提取后的殘余物,其中含有大量黃酮及總酚類(lèi)化合物,具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,目前已有一些研究對(duì)辣椒渣中該類(lèi)成分進(jìn)行了分離提取,并驗(yàn)證了其生理活性[2-5]。閃式提取是根據(jù)組織破碎原理設(shè)計(jì)而成的一種新型輔助提取技術(shù)[6],其高速轉(zhuǎn)動(dòng)的刀頭可產(chǎn)生機(jī)械剪切力、渦流負(fù)壓及相當(dāng)于超聲波1/60的振動(dòng)力,能夠迅速實(shí)現(xiàn)植物組織的破碎和有效成分的溶出,具有短時(shí)高效、條件溫和及操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)[7],現(xiàn)已廣泛地應(yīng)用于天然有效成分的提取,如三七蘆頭皂苷、黃芪多糖、甘草葉黃酮及茶葉兒茶素等[8-12]。本實(shí)驗(yàn)首次采用閃式提取技術(shù)從辣椒渣中提取黃酮及總酚類(lèi)化合物,以正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得出最佳工藝條件,并采用HPLC法對(duì)提取物進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

辣椒渣 干紅辣椒以閃式提取技術(shù)提盡色素和辣椒堿類(lèi)物質(zhì)后的殘余物;石油醚、甲醇、乙醇、丙酮及乙酸乙酯 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;槲皮素標(biāo)品、咖啡酸標(biāo)品 貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司。

閃式提取控制器JHBE-20A 河南金鼐科技發(fā)展有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-3000 上海亞榮生化儀器廠;722紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司;高效液相色譜儀L3000 北京普源精電科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃酮及總酚的閃式提取工藝流程 辣椒渣→脫脂→干燥→過(guò)篩(40目)→按料液比1∶15加入有機(jī)溶劑→閃式提取→減壓回收溶劑→黃酮及總酚提取物

1.2.2 最佳提取工藝參數(shù)的確定 在單因素實(shí)驗(yàn)中,依次改變閃提過(guò)程的提取溶劑、甲醇濃度、閃提轉(zhuǎn)速和閃提時(shí)間,以黃酮及總酚的得率作為考察指標(biāo)進(jìn)行分析研究。并選取甲醇濃度,閃提轉(zhuǎn)速和閃提時(shí)間三個(gè)因素為研究對(duì)象。采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn),以綜合評(píng)分法優(yōu)化辣椒殘?jiān)悬S酮及總酚的提取工藝條件。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and Levels of orthogonal experiment

1.2.3 黃酮及總酚得率的測(cè)定 采用分光光度法測(cè)定目標(biāo)物質(zhì)含量,其中黃酮得率:以蘆丁當(dāng)量(Rutin Equivalent,RE/g)表示,采用AlCl3-HAC-NaAC比色法測(cè)定[13-14];總酚得率:以沒(méi)食子酸當(dāng)量(Gallic Acid Equivalent,GAE/g)表示,采用Folin-Cioealteu比色法測(cè)定[15]。

1.2.4 辣椒渣甲醇提取物的HPLC分析 以甲醇為溶劑在閃提轉(zhuǎn)速4400r/min,閃提時(shí)間150s下對(duì)辣椒渣進(jìn)行提取,得到的提取物按0.002g/mL的比例稀釋于甲醇中,過(guò)0.45μm的微孔,4℃下冷藏備用。色譜條件:Agilent TC-C18(250mm×4.6mm,5μm);流動(dòng)相A-乙腈,流動(dòng)相B-0.1%磷酸水溶液;流速1.0mL/min;梯度洗脫條件:0～20min,流動(dòng)相A 10%～15%,20～30min,流動(dòng)相A 15%～25%,30～42min,流動(dòng)相A 25%～40%,42～45min,流動(dòng)相A 40%～10%;檢測(cè)波長(zhǎng)327nm;進(jìn)樣量20μL;柱溫30℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 提取溶劑對(duì)黃酮及總酚得率的影響 閃提過(guò)程中控制閃提轉(zhuǎn)速3300r/min,閃提時(shí)間180s,設(shè)置不同的提取溶劑。提取溶劑對(duì)黃酮及總酚的得率影響見(jiàn)表2。由表2知,黃酮及總酚的得率均隨提取溶劑的極性增大而增大,當(dāng)以甲醇為溶劑時(shí),二者得率均達(dá)到最大值,說(shuō)明辣椒渣中黃酮及總酚類(lèi)物質(zhì)的極性較大。因此,本實(shí)驗(yàn)條件下,最適宜的提取溶劑為甲醇。

表2 不同溶劑對(duì)黃酮及總酚得率的影響Table 2 Influence of solvents on extraction yield of flavonoid and total phenol

2.1.2 甲醇濃度對(duì)黃酮及總酚得率的影響 閃提過(guò)程中控制閃提轉(zhuǎn)速3300r/min,閃提時(shí)間180s,設(shè)置不同濃度的甲醇溶液為提取溶劑。不同甲醇濃度對(duì)黃酮及總酚的得率影響見(jiàn)圖1。由圖1知,黃酮及總酚的得率隨甲醇濃度升高都呈先增大后減小的趨勢(shì),當(dāng)甲醇濃度為60%時(shí)二者得率均達(dá)到最大值。辣椒主要含黃酮醇、槲皮素等黃酮和咖啡酸、綠原酸等多酚[16],它們屬于極性物質(zhì)。當(dāng)甲醇濃度較低時(shí),溶液極性較大,易溶解辣椒渣中糖苷類(lèi)物質(zhì),對(duì)黃酮及總酚的溶解度不高。逐步提高甲醇濃度能使溶液極性與目標(biāo)產(chǎn)物的極性接近,有利于其溶解,但在濃度過(guò)高的甲醇溶液中,一些色素類(lèi)雜質(zhì)會(huì)與其競(jìng)爭(zhēng)同甲醇-水分子的結(jié)合,降低黃酮及總酚的得率。因此,本實(shí)驗(yàn)條件下,最適宜的甲醇濃度為60%。

圖1 甲醇濃度對(duì)黃酮及總酚得率的影響 Fig.1 Influence of methanol concentration on extraction yield of flavonoid and total phenol

2.1.3 閃提轉(zhuǎn)速對(duì)黃酮及總酚得率的影響 閃提過(guò)程中控制甲醇濃度60%,閃提時(shí)間180s,設(shè)置不同的閃提轉(zhuǎn)速。不同閃提轉(zhuǎn)速對(duì)黃酮及總酚的得率影響見(jiàn)圖2。由圖2知,隨著閃提轉(zhuǎn)速的增加,黃酮及總酚得率都先增大后減小。其他條件不變,適當(dāng)提高閃提轉(zhuǎn)速,可促進(jìn)有效成分的溶出與擴(kuò)散。當(dāng)閃提轉(zhuǎn)速達(dá)到3300r/min后,再繼續(xù)提高閃提轉(zhuǎn)速,黃酮及總酚的得率卻逐漸減小,可能的原因?yàn)?在過(guò)高的閃提轉(zhuǎn)速下,刀頭劇烈攪拌粉碎,使辣椒渣中有效成分的粒徑減小,一方面會(huì)引起表面能的增大而被吸附在固體表面不易溶解;另一方面細(xì)微粒子會(huì)互相粘結(jié),無(wú)法分離,兩方面原因都會(huì)導(dǎo)致黃酮及總酚的得率降低。因此,本實(shí)驗(yàn)條件下,最適宜的閃提轉(zhuǎn)速為3300r/min。

圖2 閃提轉(zhuǎn)速對(duì)黃酮及總酚得率的影響 Fig.2 Influence of rotation on extraction yield of flavonoid and total phenol

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Result of orthogonal test

2.1.4 閃提時(shí)間對(duì)黃酮及總酚得率的影響 閃提過(guò)程中控制甲醇濃度60%,閃提轉(zhuǎn)速3300r/min,設(shè)置不同的閃提時(shí)間。不同閃提時(shí)間對(duì)黃酮及總酚的得率影響見(jiàn)圖3。由圖3知,黃酮及總酚的得率隨閃提時(shí)間的延長(zhǎng)先增大后緩慢減小。其他條件不變,延長(zhǎng)閃提時(shí)間有利于目標(biāo)產(chǎn)物的充分溶出,提高得率。但提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)造成刀頭高速轉(zhuǎn)動(dòng)的熱量囤積,體系溫度升高,一方面會(huì)引起溶劑揮發(fā),傳質(zhì)濃度梯度減小;另一方面會(huì)破壞一部分熱敏性的有效成分。因此,本實(shí)驗(yàn)條件下,最適宜的閃提時(shí)間為180s。

圖3 閃提時(shí)間對(duì)黃酮及總酚得率的影響 Fig.3 Influence of extraction time on extraction yield of flavonoids and total phenol

2.2 閃式提取辣椒渣黃酮及總酚的正交實(shí)驗(yàn)

2.2.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 以黃酮及總酚得率的綜合評(píng)分值y作為考察指標(biāo),設(shè)定黃酮及總酚的權(quán)重系數(shù)均為0.5,則各號(hào)實(shí)驗(yàn)的綜合評(píng)分值y=(100x1/3.09)×0.5+(100x2/9.66)×0.5[17]。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3,實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析見(jiàn)表4。

表4 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表Table 4 Variance analysis chart of orthogonal test

注:F0.10(2,2)=9;F0.05(2,2)=19。當(dāng)F>F0.05時(shí),因素影響極顯著(表示為**);當(dāng)F>F0.10時(shí),因素影響顯著(表示為*);當(dāng)F0.10>F時(shí),因素影響不顯著。

由表4知,閃提轉(zhuǎn)速對(duì)辣椒渣中黃酮及總酚的得率影響極為顯著,甲醇濃度對(duì)得率影響顯著,閃提時(shí)間對(duì)得率影響不顯著,各因素對(duì)得率影響的主次順序?yàn)?閃提轉(zhuǎn)速>甲醇濃度>閃提時(shí)間。取各因素最高水平組合,得到辣椒渣中黃酮及總酚的最佳閃式提取工藝組合為A1B3C2,即最佳工藝條件為:甲醇濃度50%,閃提轉(zhuǎn)速4400r/min,閃提時(shí)間150s。

2.2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 正交實(shí)驗(yàn)得到的最佳提取工藝為A1B3C2,正交表中沒(méi)有此組合,故補(bǔ)做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),取等量原料,進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn),得到黃酮及總酚的得率分別為(3.07±0.05)mgRE/g和(9.61±0.12)mgGAE/g。

2.3 HPLC分析結(jié)果

采用HPLC法分別對(duì)咖啡酸和槲皮素的混合物對(duì)照品及辣椒渣甲醇提取物進(jìn)行分析,結(jié)果如圖4:

圖4 對(duì)照品及辣椒渣甲醇提取物的HPLC色譜圖 Fig.4 HPLC chromatogram of standard and methanol extracts of capsicum residual

3 結(jié)論

閃式提取辣椒渣中黃酮及總酚的最佳工藝條件為:50%甲醇溶液、閃提轉(zhuǎn)速4400r/min及閃提時(shí)間150s,在此最佳工藝條件下,黃酮及總酚的得率分別為(3.07±0.05)mgRE/g和(9.61±0.12)mgGAE/g。采用HPLC法對(duì)提取物進(jìn)行分析,鑒定出其中含槲皮素和咖啡酸。

本實(shí)驗(yàn)采用閃式提取技術(shù)從經(jīng)色素和辣椒堿類(lèi)物質(zhì)深加工后的辣椒渣中提取高附加值的黃酮及總酚,提取過(guò)程成本低、能耗低且短時(shí)高效、簡(jiǎn)便易行,有利于促進(jìn)整個(gè)辣椒深加工過(guò)程的環(huán)?；唾Y源高效化利用,實(shí)現(xiàn)辣椒原料的綜合開(kāi)發(fā)利用。

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