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(1.江南大學教育部工業(yè)生物技術重點實驗室,江蘇無錫 214122;2.江南大學釀酒科學與工程研究室,江蘇無錫 214122)

淀粉液化芽孢桿菌能高水平分泌多種胞外酶,如淀粉酶、葡聚糖酶和蛋白酶,是一類重要的工業(yè)生產(chǎn)菌株[1-2]。淀粉液化芽孢桿菌BS5582是一株經(jīng)過人工誘變篩選高產(chǎn)蛋白酶的菌株[3]。萬巖松[4]對該菌株所產(chǎn)蛋白酶性質(zhì)進行研究,表明在啤酒麥汁糖化過程中添加其所產(chǎn)蛋白酶,有效增加氨基氮水平,能夠應用于溶解不良的麥芽或高比例輔料的啤酒釀造[5]。淀粉液化芽孢桿菌能分泌中性蛋白酶和堿性蛋白酶[6],鑒定菌株BS5582蛋白酶酶系組成,能更好地理解這些蛋白酶之間可能存在的協(xié)同作用機制,在實際應用中具有重要意義。

基于凝膠電泳的酶譜分析是一種快速分離分析混合樣品中不同性質(zhì)的酶,包括蛋白酶、纖維蛋白溶解酶[7]和木聚糖酶[8],此外也能夠快速檢測蛋白酶抑制劑[9-10]。其中,蛋白酶的酶譜分析是通過非變性SDS-PAGE電泳分離蛋白酶,并將凝膠浸沒在蛋白底物(明膠或酪蛋白)中使蛋白酶水解底物,通過染色顯示蛋白水解條帶,即形成蛋白酶酶譜,也稱為substrate-SDS-PAGE[10]。Fernando L. Garcia-Carreno[10]分析該方法檢測蛋白酶的靈敏度,同時還能夠檢測到濃度低至12ng的蛋白酶抑制劑。而Sung Goo Park[7]將該方法結合雙向電泳的酶譜方法檢測了枯草芽孢桿菌的纖維蛋白水解酶。蛋白酶酶譜還可用于分析純化后的蛋白酶的純度和種類[11]。朱美娟[12]報道了應用該方法研究金線魚消化道不同部位蛋白酶的活力分布規(guī)律及不同體重對蛋白酶活力分布的影響,為金線魚消化道蛋白酶的回收、純化及應用提供理論依據(jù)。為了采用酶譜方法能夠快速鑒定蛋白酶,Daniel Pan[13]改進了蛋白酶酶譜方法,增加蛋白酶轉印步驟,可實現(xiàn)蛋白酶的酶譜分析及鑒定。

質(zhì)譜技術能夠快速鑒定蛋白質(zhì),將各種蛋白質(zhì)與序列數(shù)據(jù)庫聯(lián)系起來,成為鑒定蛋白質(zhì)及多肽的首選方法[14-15]。該方法將膠上蛋白質(zhì)經(jīng)酶解后得到一組片段,經(jīng)質(zhì)譜測定后獲得肽段的氨基酸序列,通過數(shù)據(jù)庫搜尋鑒定出該種蛋白質(zhì)[16]。該方法靈敏度高,分析迅速,已成為蛋白質(zhì)組學研究中必不可缺的關鍵技術之一。

本研究采用酶譜分析法和質(zhì)譜鑒定的分析手段,對BS5582產(chǎn)蛋白酶進行分析和鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

淀粉液化芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)BS5582 本研究室保藏菌株;種子培養(yǎng)基(g/L) 蛋白胨10.00,牛肉膏5.00,NaCl 5.00,pH7.0;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) 玉米粉50.00,豆餅粉40.00,KH2PO43.00,Na2HPO4·12H2O 6.00,(NH4)2SO42.00,MgSO41.80,CaCl20.75,pH6.0。

回轉式恒溫調(diào)速搖瓶柜 上海福瑪設備有限公司;Powerpac Basic蛋白電泳儀 美國Bio-Rad公司;Ultraflextreme串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀 德國Bruker公司。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 種子培養(yǎng) 接種斜面菌種1環(huán)于0.1MPa滅菌20min的種子培養(yǎng)基中,37℃、200r/min旋轉式搖床培養(yǎng)8h。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵 在250mL三角瓶中,裝入15mL發(fā)酵培養(yǎng)基,0.1MPa滅菌20min,接種量10%,于200r/min培養(yǎng),培養(yǎng)溫度35℃。

1.3 分析方法

1.3.1 蛋白酶酶活測定 根據(jù)國標GBT 23527-2009蛋白酶制劑[17],采用福林法。酶活單位定義:1.00g固體酶粉(或l.00mL液體酶)在40℃水浴,pH3.0,7.5或10.5條件下,1min水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸的酶量為一個酶活力單位,以U/g(U/mL)表示。

1.3.2 SDS-PAGE 根據(jù)蛋白質(zhì)電泳實驗技術[18]使用5%(w/v)的濃縮膠和12%(w/v)的分離膠。SDS-PAGE電泳上樣量5μL,非變性-SDS-PAGE和底物-SDS-PAGE(酶譜)電泳上樣量15μL。其中非變性-SDS-PAGE和酶譜分析法采用Scott M. Geib[19]提出的方法,樣品未經(jīng)過加熱以保證蛋白酶的活性在凝膠的兩邊加相同的樣品,電泳結束后,將凝膠切割成兩半,一半用于直接染色,即非變性-SDS-PAGE,另一半用于制作底物-SDS-PAGE(酶譜)。

1.3.3 蛋白酶酶譜分析方法 酶譜法是采用Anissa Haddar報道的方法[11]。電泳前樣品沒有經(jīng)過加熱,電泳后,將凝膠浸在含有2.5% Triton X-100的20mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.5)中,洗滌凝膠兩次以去除SDS,每次30min。然后用20mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.5)洗滌凝膠三次除去Triton X-100,每次20min。然后將凝膠浸入含1%(w/v)酪蛋白的20mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.5)中,40℃孵育3h。凝膠用染色液染色2h。最后脫色10min,凝膠上的空白水解條帶表明蛋白酶的存在。

1.3.4 質(zhì)譜分析方法 采用王鴻麗改進的質(zhì)譜兼容的膠內(nèi)酶切方法對蛋白條帶進行質(zhì)譜分析[20]。

2 結果與分析

2.1 菌株BS5582分泌的蛋白酶酶活分析

根據(jù)國標GBT 23527-2009蛋白酶酶活分析方法,使用乳酸鈉緩沖液(pH3.0)、磷酸緩沖液(pH7.5)和硼酸緩沖液(pH10.5),分別檢測菌株BS5582發(fā)酵48h的上清液在中性、酸性和堿性環(huán)境的蛋白酶酶活。結果如表1所示,BS5582發(fā)酵上清液的蛋白酶酶活在中性條件下最高,堿性條件下酶活只有中性條件下的12.56%,酸性條件下的酶活很低,表明菌株BS5582的蛋白酶在中性條件下活力最高。因此蛋白酶酶活分析以及蛋白酶酶譜分析均在pH7.5下進行。

表1 BS5582發(fā)酵上清液蛋白酶酶活Table 1 Protease activity of BS5582 fermentation supernatant

2.2 菌株BS5582發(fā)酵過程產(chǎn)蛋白酶分析

分析菌株BS5582生長與產(chǎn)胞外蛋白酶的關系,結果如圖1所示。由此可知,在菌株BS5582發(fā)酵過程中,有三個酶活高峰,分別為24h的3815.2U/mL、33h的8588.9U/mL和48h的9987.6U/mL。因此確定該菌株可能在三種不同生長時期,高效生產(chǎn)不同的胞外蛋白酶,且在現(xiàn)有發(fā)酵條件下,其產(chǎn)蛋白酶周期確定為48h。

圖1 BS5582產(chǎn)胞外蛋白酶酶活與細胞生長的關系 Fig.1 Relationship between extracellular protease activity produced by BS5582 and the cell growth

表2 蛋白酶MALDI-TOF/TOF MS/MS鑒定分析Table 2 Proteasse identified by MALDI-TOF/TOF MS/MS

當細胞開始生長,胞外蛋白酶酶活隨之增加,表明菌株BS5582存在組成型的胞外蛋白酶。當細胞培養(yǎng)24h后,菌濃迅速下降,開始產(chǎn)芽孢(圖2),培養(yǎng)基中的蛋白酶酶活迅速增加,表明此時BS5582可能快速分泌與產(chǎn)芽孢相關的胞外蛋白酶。進一步培養(yǎng),約40h之后,胞外蛋白酶酶活再次迅速增加。此時培養(yǎng)基中的細胞數(shù)持續(xù)下降,所以這一階段分泌的蛋白酶可能與細胞的裂解相關,細胞的裂解使部分胞內(nèi)的蛋白酶釋放到胞外。所以,菌株BS5582在一次生長的不同時期,可能分泌多種蛋白酶,且這些蛋白酶具有不同的生理功能。

圖2 BS5582培養(yǎng)24h的細胞形態(tài)電子顯微鏡觀察圖 Fig.2 Electron microscopy of BS5582 cell morphology at 24h

2.3 菌株BS5582分泌蛋白酶酶譜分析

為了鑒定菌株BS5582分泌的胞外蛋白酶,取發(fā)酵48h的培養(yǎng)液上清,進行非變性-SDS-PAGE和酶譜分析實驗。由于酶譜凝膠中蛋白底物的存在和樣品量少的原因,因此直接用酶譜凝膠的水解條帶進行鑒定成功率不高。所以,本次研究結合了未加底物處理的非變性-SDS-PAGE,電泳過程與酶譜分析進行平行電泳實驗,確保非變性-SDS-PAGE上的電泳條帶與酶譜分析的蛋白質(zhì)條帶一致。非變性-SDS-PAGE的蛋白質(zhì)條帶經(jīng)過考馬斯亮藍染色,并對相應的條帶進行質(zhì)譜鑒定,結果如圖3所示。圖3(A)是胞外蛋白酶的酶譜凝膠分析,表明存在五條清晰的空白水解條帶。因此切割了酶譜對應的非變性-SDS-PAGE上的蛋白條帶進行鑒定,如圖3(A)所示標記為P1、P2、P3、P4和P5為蛋白酶條帶。而胞外總蛋白的變性SDS-PAGE分析如圖3(B)所示,其中P6為實驗室前期在菌株BS5582發(fā)酵上清中純化的一種中性金屬蛋白酶[4]。

圖3 BS5582發(fā)酵上清液未經(jīng)過加熱處理的 非變性-SDS-PAGE和底物-SDS-PAGE(酶譜)分析(A) 及經(jīng)過加熱的發(fā)酵上清液的變性-SDS-PAGE(B). Fig.3 Non-denaturing-SDS-PAGE and substrate-SDS-PAGE (zymography)(A)of not heat-treated fermentation supernatant and denaturing-SDS-PAGE(B). of the heated fermentation supernatant from BS5582

2.4 蛋白酶酶譜條帶的質(zhì)譜鑒定

將對應于酶譜的非變性SDS-PAGE上的P1,P2、P3、P4和P5蛋白條帶和變性-SDS-PAGE上的P6用無菌手術刀割下,進行質(zhì)譜鑒定,鑒定結果如表2所示。

蛋白條帶P1和P5經(jīng)鑒定為Bacillopeptidase F(Bpr),它是一種帶有酸性等電點的絲氨酸肽鏈內(nèi)切酶[21]。但經(jīng)鑒定出蛋白條帶P1的分子量與預測分子量相差較大,可能該蛋白酶存在前體結構(pre-pro structure)。B.subtilis的所有胞外蛋白酶均在細胞質(zhì)中以前原酶(preproenzyme)的形式合成,在細胞外環(huán)境中加工成有活性的成熟酶[22]。蛋白條帶P5較P1分子量變小說明該蛋白酶可能自我剪切導致分子量變小。Carolyn A Roitsch純化出B.subtilis的Bpr的兩種形式,分子量分別為33ku和50ku,所以,Bpr呈現(xiàn)多種形式,表明其存在自溶機制[23]。Xu-Chu Wu將編碼Bpr的基因(bpf)克隆并表達,DNA序列顯示該蛋白酶是一種分子量為92ku的前體蛋白,NH2端的前30個氨基酸為信號肽,31～194氨基酸可能是前導肽。該蛋白分泌到胞外形成分子量為80ku的蛋白酶,該分子量的蛋白酶在加工過程中逐漸降解為多種有活性的形式,分子量分別為68、50和48ku,也說明Bpr存在自溶機制[24]。所以鑒定的BS5582分泌的Bpr存在多種形式可能與其自溶特性相關。Bpr具有較高的酯水解活性,能夠切開羧基側是芳香族(酪氨酸或苯丙氨酸)或疏水性氨基酸殘基(亮氨酸)的肽鍵[25]。

經(jīng)過質(zhì)譜鑒定,蛋白條帶P2和P4是一種胞外中性金屬蛋白酶(Extracellular neutral metalloprotease,Mpr),兩者分子量相差較大,而且它們與預測分子量59678u均有較大差別,這可能是由于胞外蛋白酶的成熟經(jīng)過多步加工以及存在自我剪切活性[26],所以P4可能是P2自我剪切形成的。Hiroaki Shimada研究淀粉液化芽孢桿菌來源的中性蛋白酶表明其存在一個前體結構(pre-pro structure)[26],分子量減小的胞外蛋白酶是其成熟酶的形式。有報道表明Mpr的成熟需要Bpr幫助其加工[22]。本實驗室前期分離純化了BS5582的一個胞外中性金屬蛋白酶(圖3(B)中P6),其相對分子量約為37ku[4],是經(jīng)過切除信號肽和前導肽而形成的成熟肽,其大小與P2分子量相近。這些胞外蛋白酶往往在胞內(nèi)以前體形式存在,主要是抑制蛋白酶活性從而保護宿主細胞免受蛋白酶的水解[27]。中性金屬蛋白酶能切開氨基端疏水性氨基酸殘基或者任一氨基酸殘基-Leu(-Phe及其它)之間的肽鍵。

蛋白條帶P3經(jīng)鑒定是Subtilisin Bpn’[28],是一種絲氨酸內(nèi)切酶,屬于蛋白酶第八家族,化活性中心由Ser221、His64和Asp32組成,堿性蛋白酶型的絲氨酸蛋白酶能夠切開羧基側是芳香族或疏水性氨基酸殘基的肽鍵[25]。這是一種在洗滌劑工業(yè)應用廣泛的堿性蛋白酶。

3 結論與討論

淀粉液化芽孢桿菌BS5582能高效分泌胞外蛋白酶,其在啤酒釀造中具有一定的應用價值。胞外蛋白酶酶活分析表明蛋白酶在中性條件下活力最高,其發(fā)酵過程產(chǎn)生三個酶活高峰,表明菌株可能分泌多種蛋白酶。本次研究應用蛋白酶酶譜分析和蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定相結合的方法,快速鑒定了胞外蛋白酶的復雜組成,表明該方法是一種快速鑒定多種蛋白酶的有效方法。但是蛋白酶酶譜也存在一些缺點,如非變性條件下,為了保證蛋白酶的活性,樣品沒有經(jīng)過加熱處理,蛋白樣品難以充分結合SDS,造成酶譜分析的分子量不夠準確。酶譜分析的凝膠中含有底物蛋白質(zhì),直接鑒定其條帶影響質(zhì)譜鑒定的準確性。本次酶譜分析的蛋白質(zhì)采用非變性SDS-PAGE的蛋白質(zhì)條帶進行質(zhì)譜鑒定,得到較好的鑒定結果。

本研究采用酶譜分析與質(zhì)譜的方法快速鑒定了淀粉液化芽孢桿菌BS5582的胞外蛋白酶及其多種復雜形式,包括Bacillopeptidase F、中性金屬蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶Bpn',這三種蛋白酶具有不同的偏好性酶切作用位點。Bacillopeptidase F具有較高的酯水解活性,能夠切開羧基側是芳香族(酪氨酸或苯丙氨酸)或疏水性氨基酸殘基(亮氨酸)的肽鍵;中性金屬蛋白酶能切開氨基端疏水性氨基酸殘基或者任一氨基酸殘基-Leu(-Phe及其它);枯草桿菌蛋白酶Bpn'能夠切開羧基側是芳香族或疏水性氨基酸殘基的肽鍵。在以后的實驗中可著重研究這三種蛋白酶的協(xié)同作用機制和該菌株蛋白酶的分泌機制,在實際應用中具有重要意義。

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