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(上海海洋大學(xué)上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海 201306)

微生態(tài)添加劑以其天然、綠色、無(wú)毒副作用、無(wú)殘留的優(yōu)點(diǎn)近年內(nèi)引起世界各國(guó)的關(guān)注,并逐步成為替代抗生素添加劑的主力[1]。甘露寡糖以低熱、安全、無(wú)毒,而且能改善動(dòng)物體內(nèi)微生物環(huán)境、提高動(dòng)物免疫力等特有的功效引起人們極大的興趣。在健康養(yǎng)殖的趨勢(shì)下,甘露寡糖替代抗生素的使用已成為研究熱點(diǎn),是最有研究前景的抗生素替代品之一[2-3]。甘露聚糖酶(mannanase)是一種半纖維素水解酶,是制備甘露寡糖的關(guān)鍵酶之一,其以?xún)?nèi)切方式降解甘露聚糖糖苷鍵,降解產(chǎn)物的非還原末端為甘露糖、甘露寡糖。甘露聚糖酶來(lái)源廣泛,而微生物是甘露聚糖酶的主要來(lái)源,其中利用分泌甘露聚糖酶微生物菌種制備直投式發(fā)酵劑,可以大大降低工廠制備甘露寡糖的過(guò)程,并具有降低環(huán)境污染等優(yōu)勢(shì)。

現(xiàn)在市面上主要是以魔芋作為甘露聚糖的主要來(lái)源,而目前市場(chǎng)上為數(shù)不多的寡糖類(lèi)產(chǎn)品寡糖純度只在35%～55%,而且因含單糖和淀粉類(lèi)物質(zhì)而難于保存[4]。我國(guó)是啤酒酵母生產(chǎn)大國(guó),廢棄的啤酒酵母細(xì)胞壁中同樣含有豐富的甘露聚糖,甘露聚糖占酵母細(xì)胞壁干重的40%左右[5],甘露聚糖存在于酵母細(xì)胞壁外層[6],以共價(jià)鍵形式與蛋白質(zhì)連在一起,因此又稱(chēng)之為甘露聚糖蛋白[7]。因此利用啤酒酵母中甘露聚糖,制備高純度的甘露寡糖,已經(jīng)成為近幾年的研究熱點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)室前期分離改良的枯草芽孢桿菌K-6-9在生長(zhǎng)過(guò)程中能產(chǎn)生大量的異甘露聚糖酶酶活力高達(dá)601.6U/mL[21],能將啤酒酵母細(xì)胞壁中的甘露聚糖分解成甘露寡糖。本實(shí)驗(yàn)以芽孢量為指標(biāo),將枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)K-6-9首先進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,通過(guò)培養(yǎng)基及其發(fā)酵條件的優(yōu)化研究,然后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),為該菌株后期制成直投式發(fā)酵劑提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)K-6-9由本實(shí)驗(yàn)室分離保藏;種子培養(yǎng)基和基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖5g/L、牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L、pH7.0[8];菌種、芽孢計(jì)數(shù)和保藏培養(yǎng)基 葡萄糖5g/L、牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L、瓊脂2g/L、pH7.0。

PL-202-L型電子天平 梅特勒-托多利儀器(上海)有限公司;WFZ UV-200型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼科(上海)儀器有限公司;DHG-9053A型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;SJH-4S型數(shù)控精密恒溫水浴鍋 寧波天恒儀器廠;pH S-3C酸度計(jì) 雷磁儀器廠;DKY-Ⅱ型 恒溫調(diào)速回轉(zhuǎn)式搖床 上海杜科自動(dòng)化設(shè)備有限公司;FMG(I)型臺(tái)式發(fā)酵罐 上海國(guó)強(qiáng)生化工程裝備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 活菌數(shù)和芽孢數(shù)的測(cè)定 活菌數(shù):將發(fā)酵液稀釋至10-3～10-7,然后取10μL涂布于固體培養(yǎng)基平板上,每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù),18h后計(jì)算活菌數(shù)。芽孢數(shù):將發(fā)酵液置于80℃水浴10min按照活菌的測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定[9-11]。

1.2.2 發(fā)酵液pH的測(cè)定 取發(fā)酵液直接用精密pH計(jì)測(cè)定。

1.2.3 菌種活化及種子液的配制 從冰箱中取出枯草芽孢桿菌斜面菌種,室溫靜置40min;用接種環(huán)從斜面取厚實(shí)二環(huán)菌種接種于三角瓶液體培養(yǎng)基上,37℃、160r/min搖床活化培養(yǎng)18h,此時(shí)活菌數(shù)約為108CFU/mL,芽孢量約為105CFU/mL作為種子菌液備用[12]。

1.2.4 培養(yǎng)時(shí)間的確定 50mL/250mL(以下同)的三角瓶液體培養(yǎng)基中接入2.0%枯草芽孢桿菌K-6-9原菌液,置于37℃,160r/min搖床活化培養(yǎng)24h,其間每隔3h取樣測(cè)定菌液活菌數(shù)和芽孢量確定最佳培養(yǎng)時(shí)間。

1.2.5 枯草芽孢桿菌K-6-9培養(yǎng)基成分的優(yōu)化 最佳碳源篩選:分別以含量為1%(W/V)的蔗糖、乳糖、麥芽糖、乳糖、棉籽糖、果葡糖漿等6種碳源去替換初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖,其他成分變,以葡萄糖為對(duì)照。按2%的接種量接種種子液,于160r/min、37℃條件下?lián)u瓶培養(yǎng)18h,每個(gè)處理做個(gè)3重復(fù),通過(guò)芽孢產(chǎn)量進(jìn)行對(duì)比選擇(以下同)。

最佳氮源篩選:分別以含量為1%(W/V)的牛肉膏、酵母粉、胰蛋白胨、尿素、NH4NO3、NH4Cl、等6種氮源去替換初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的魚(yú)粉蛋白胨,以魚(yú)粉蛋白胨對(duì)照。其它發(fā)酵條件同上,通過(guò)芽孢產(chǎn)量進(jìn)行對(duì)比選擇。

最佳無(wú)機(jī)鹽篩選:根據(jù)先相關(guān)文獻(xiàn)[13-16],分別以含量為 0.3%(W/V)的MnSO4、MgSO4、KH2PO4、NaCl,CaCl2等5種無(wú)機(jī)鹽去替換初始發(fā)酵培養(yǎng)基0.5%(W/V)NaCl,以0.5%(W/V)NaCl和不添加為對(duì)照。其它發(fā)酵條件同上,通過(guò)芽孢產(chǎn)量進(jìn)行對(duì)比選擇。

1.2.6 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基成分 對(duì)篩選得到的最佳碳源蔗糖(A)和最佳氮源胰蛋白胨(B)以及發(fā)酵培養(yǎng)基中促生長(zhǎng)無(wú)機(jī)鹽CaCl2(C),MgSO4(D),KH2PO4(E),進(jìn)行5因素4水平的正交實(shí)驗(yàn),考慮到碳源與氮源之間的互作,采用 L16(45)正交表確定各組分的最佳配比,共16個(gè)處理組合,每個(gè)處理做4個(gè)重復(fù)。正交實(shí)驗(yàn)各因素及水平見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels in orthogonal experiment

1.2.7 草芽孢桿菌K-6-9培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.2.7.1 最適接種量的測(cè)定 按照1%、2%、3%、4%、5%、6%的接種量將種子液分別接到50mL/250mL優(yōu)化后的發(fā)酵液中(以下同),培養(yǎng)18h,通過(guò)芽孢產(chǎn)量進(jìn)行對(duì)比選擇。

1.2.7.2 最適生長(zhǎng)pH的測(cè)定 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH設(shè)置為5.5、6.0、6.5、7.0、7.2、7.5、8.0,按照最佳接種量接入優(yōu)化后發(fā)酵液中,在37℃培養(yǎng)18h,通過(guò)芽孢產(chǎn)量進(jìn)行對(duì)比選擇。

1.2.7.3 最適生長(zhǎng)溫度的測(cè)定 溫度設(shè)置為28、32、35、37、39、42℃,按照最佳接種量接入優(yōu)化后發(fā)酵液中,在不同溫度下培養(yǎng)18h,通過(guò)芽孢產(chǎn)量進(jìn)行對(duì)比選擇。

1.2.7.4 最適轉(zhuǎn)速的測(cè)定 將枯草芽孢桿菌以合適接種量接到優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基中,搖床轉(zhuǎn)速分別調(diào)節(jié)為 120,140、160、180、200、220r/min;按照最佳接種量接入優(yōu)化后發(fā)酵液中,在最適生長(zhǎng)溫度下培養(yǎng)18h,通過(guò)芽孢產(chǎn)量進(jìn)行對(duì)比選擇。

1.2.8 擴(kuò)大培養(yǎng) 采用5L發(fā)酵罐,接種量和發(fā)酵量均和搖瓶發(fā)酵條件相同,通氣量維持在3vvm[17]。發(fā)酵條件:優(yōu)化后的最優(yōu)發(fā)酵條件相同。每2h測(cè)定細(xì)菌數(shù)和芽孢量。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

實(shí)驗(yàn)中圖表繪制采用 Microsoft Excel處理;正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方差分析應(yīng)用軟件為正交設(shè)計(jì)助手v3.1[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)時(shí)間的確定

從圖1可以看出:隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),在0～3h內(nèi)活菌數(shù)生長(zhǎng)較慢,處于停滯期;而后迅速生長(zhǎng),3～18h細(xì)菌數(shù)內(nèi)生長(zhǎng)很快,到 18h活菌數(shù)接近頂峰,即這一階段是對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,菌體數(shù)量急劇增多,活菌數(shù)迅速提高;18h以后活菌數(shù)有微降趨勢(shì),但變化不大,即K-6-9已進(jìn)入生長(zhǎng)的穩(wěn)定期。芽孢量在前9h變化不大,幾乎沒(méi)有增長(zhǎng),9～18h增長(zhǎng)迅速,18～24h芽孢產(chǎn)量趨于穩(wěn)定即進(jìn)入平臺(tái)期。故本實(shí)驗(yàn)選擇的最適合的發(fā)酵時(shí)間是18h。因此,實(shí)驗(yàn)采用接種種齡為18h,此時(shí)枯草芽孢桿菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期,既可保持高的細(xì)胞活力,又可獲得盡可能多的芽孢量。

圖1 枯草芽孢桿菌K-6-9生長(zhǎng)曲線(xiàn) Fig.1 Growth curve of Bacillus subtilis

2.2 枯草芽孢桿菌K-6-9培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

2.2.1 碳源的篩選 碳源的單因素篩選結(jié)果如圖2所示,當(dāng)蔗糖作為碳源時(shí),發(fā)酵后菌量最大,芽孢量達(dá)到1.50×106CFU/mL,其后芽孢量的大小依次為果糖>乳糖>棉籽糖>葡萄糖>麥芽糖>果葡糖漿。所以根據(jù)芽孢量數(shù)據(jù),蔗糖應(yīng)為最佳碳源。

圖2 不同碳源對(duì) K-6-9發(fā)酵液的影響 Fig.2 Effects of different carbon source on the fermentation of K-6-9

2.2.2 氮源的篩選 對(duì)氮源進(jìn)行單因素篩選,當(dāng)胰蛋白胨作為氮源時(shí),發(fā)酵后芽孢量最大,芽孢量達(dá)到1.94×106CFU/mL,其余根據(jù)芽孢量的大小依次為魚(yú)粉蛋白胨>牛肉膏>酵母粉>NH4NO3>NH4Cl>尿素(圖3)。根據(jù)芽孢量,胰蛋白胨應(yīng)為最佳氮源。

圖3 不同氮源對(duì)K-6-9發(fā)酵液的影響 Fig.3 Effects of different nitrogen sources on the fermentation of K-6-9

2.2.3 無(wú)機(jī)鹽的篩選 對(duì)枯草芽孢桿菌K-6-9進(jìn)行無(wú)機(jī)鹽單因素篩選,當(dāng)KH2PO4作為無(wú)機(jī)鹽添加時(shí),發(fā)酵后芽孢量最大,達(dá)到5.16×107CFU/mL,其余芽孢量大小依次為MgSO4>CaCl2>0.5%(W/V)NaCl>NaCl>不添加無(wú)機(jī)鹽>MnSO4(圖4)。

圖4 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)K-6-9發(fā)酵液的影響 Fig.4 Effects of different inorganic salts on the fermentation of K-6-9

綜合上述數(shù)據(jù)可以看出,KH2PO4和MgSO4、CaCl2在促進(jìn)K-6-9發(fā)酵時(shí),對(duì)芽孢量的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用,NaCl對(duì)于芽孢量影響較小,后文不再考慮。根據(jù)芽孢量,CaCl2相比較KH2PO4和MgSO4影響較小,故選取KH2PO4和MgSO4作為無(wú)機(jī)鹽。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化比培養(yǎng)基成分

通過(guò)上述碳源、氮源以及無(wú)機(jī)鹽單因素實(shí)驗(yàn)的研究,確定了液體發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽的種類(lèi)和濃度范圍。按1.2.6設(shè)計(jì)的正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基成分,確定最合適的培養(yǎng)基成分。

從表2可以看出,對(duì)枯草芽孢桿菌K-6-9生長(zhǎng)影響因素的順序?yàn)橐鹊鞍纂?蔗糖>KH2PO4>MgSO4>CaCl2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明胰蛋白胨、蔗糖、MgSO4、KH2PO4對(duì)發(fā)酵效果影響較為顯著。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析枯草芽孢桿菌K-6-9的最佳工藝組合為A3B1C1D2E3,即最佳培養(yǎng)基成分為蔗糖1.0%、胰蛋白胨0.25%、MgSO40.2%、KH2PO40.3%、CaCl20.1%、牛肉膏0.5%,芽孢產(chǎn)量為1.294×109CFU/mL。

由表3方差分析可以看出,胰蛋白胨、蔗糖、MgSO4、KH2PO4用量對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響顯著,CaCl2影響不顯著,此結(jié)果與正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的極差分析結(jié)論一致。

2.4 最佳培養(yǎng)條件的篩選

2.4.1 最佳接種量的確定 測(cè)定了1%、2%、3%、4%、5%、6%,6個(gè)接種量對(duì)芽孢量的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明接種量在一定范圍內(nèi)增大芽孢量有所增加,但過(guò)量的接種量可能導(dǎo)致培養(yǎng)基養(yǎng)分提前消耗完,降低芽孢的數(shù)量[19]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明2%的接種量為最適接種量。

表2 枯草芽孢桿菌K-6-9 最適培養(yǎng)基成分L16(45)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 L16(45)orthogonal design and results for liquid medium optimization

表3 正交結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of the results

圖5 接種量對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響 Fig.5 Effect of seed volume on spore yield

2.4.2 最佳初始pH的確定 測(cè)定了5.5、6.0、6.5、7.0、7.2、7.5、8.0,7個(gè)pH對(duì)芽孢量的影響。發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為 5.5～7.0時(shí),與芽孢量增殖呈正相關(guān):7.0～8.0 時(shí)呈負(fù)相關(guān)(圖7)。當(dāng)pH為7.0時(shí)最適于芽孢量增殖。

圖6 初始 pH 對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響 Fig.6 Effect of initial pH value of media on spore yield

2.4.3 最佳發(fā)酵溫度的確定 分別在不同溫度下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),結(jié)果表明發(fā)酵溫度為37℃最有利于芽孢量的增殖,綜上所述選擇37℃為本實(shí)驗(yàn)最佳發(fā)酵溫度。

圖7 發(fā)酵溫度對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響 Fig.7 Effect of temperature on spore yield

2.4.4 最佳轉(zhuǎn)速的確定 在所設(shè)的6個(gè)不同處理中,當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為180r/min時(shí),菌體產(chǎn)量明顯高于其他處理(圖9)。因此選擇180r/min作為本實(shí)驗(yàn)的最佳轉(zhuǎn)速。

圖8 轉(zhuǎn)速對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響 Fig.8 Effect of shaking speed on spore yield

2.5 擴(kuò)大培養(yǎng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在搖瓶的基礎(chǔ)上進(jìn)行了5L的擴(kuò)大培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9。

圖9 枯草芽孢桿菌K-6-9擴(kuò)大培養(yǎng) 在不同時(shí)間段活菌數(shù)、芽孢量和pH的變化 Fig.9 Amplification of Bacillus subtilis K-6-9 effect of fermentation time on living cell、spore yield and pH

通圖9可以看出,枯草芽孢桿菌擴(kuò)大培養(yǎng)生長(zhǎng)周期和搖瓶的時(shí)間周期有變化,可能由于通氣后加速了枯草芽孢桿菌K-6-9的生長(zhǎng),其在14h獲得了最大細(xì)菌數(shù)和芽孢量。發(fā)酵液的pH先由7.00 降低到5.83,后來(lái)逐漸上升到6.71。改良后發(fā)酵液的芽孢量為1.40×109CFU/mL相對(duì)于初始發(fā)酵培養(yǎng)基的芽孢量5.5×105CFU/mL,提高了2.55×103倍。

綜合上述實(shí)驗(yàn),得到優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:蔗糖1.0%,胰蛋白胨0.25%,牛肉膏0.5%,MgSO40.2%,KH2PO40.3%,CaCl20.1%。確定了搖瓶的最佳培養(yǎng)條件:初始 pH 7.0,裝液量為 50mL/250mL,接種量為 2%,發(fā)酵溫度為 37℃,轉(zhuǎn)速為180r/min,發(fā)酵時(shí)間為 18h。搖瓶發(fā)酵芽孢量為1.32×109CFU/mL,發(fā)酵罐通氣量為3vvm,芽孢量為1.40×109CFU/mL。

3 討論

異甘露聚糖酶生產(chǎn)菌株K-6-9在批量生產(chǎn)制備成直投式發(fā)酵劑過(guò)程中最為重要的是以芽孢量為主要質(zhì)量指標(biāo)。因此,本研究以芽孢量作為該菌株發(fā)酵條件的評(píng)判指標(biāo)。目前異甘露聚糖酶生產(chǎn)菌株發(fā)酵劑的應(yīng)用國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)多報(bào)道,多為酶活力和制備甘露寡糖的研究。如王永[20]對(duì)于產(chǎn)異甘露聚糖酶菌株的復(fù)合誘變,張聞[6]等甘露聚糖酶產(chǎn)生菌F1-5的鑒定及發(fā)酵條件研究。王紹云[21]等采用由北京博仕奧生物技術(shù)有限公司提供,酶活≥ 20萬(wàn) U/g的內(nèi)切型中性β-甘露聚糖酶對(duì)棕櫚粕進(jìn)行酶解,得到以聚合度二、三、四、五為主的MOS等,對(duì)于發(fā)酵劑的研究較少。本實(shí)驗(yàn)室分離的菌株K-6-9產(chǎn)異甘露聚糖酶的酶活性較強(qiáng),固態(tài)培養(yǎng)基酶活力最高達(dá)601.6U/mL[23]。本實(shí)驗(yàn)首次初步探討了異甘露聚糖酶K-6-9的高密度發(fā)酵,為后期制備直投式發(fā)酵劑提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

相對(duì)于其它枯草芽孢桿菌等高密度發(fā)酵,本實(shí)驗(yàn)的芽孢量相對(duì)較少。這可能由于菌株的特殊性。 搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明K-6-9生長(zhǎng)需要較好的溶氧條件,在其他發(fā)酵條件一定的情況下,培養(yǎng)基中的溶氧水平越高越有利于芽孢的產(chǎn)生。在后期的實(shí)驗(yàn)中,將進(jìn)行補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)以便進(jìn)一步優(yōu)化和提高芽孢量。

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