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(長沙理工大學(xué)食品與生物工程系,湖南長沙 410114)

酸性α-淀粉酶是指能在低酸性條件下水解淀粉的α-淀粉酶[1]。目前,市場上常用的中溫和高溫α-淀粉酶均屬中性α-淀粉酶(最適pH6.0～7.0),在酸性條件下酶活降低,不能滿足酸性條件下淀粉原料深加工工藝的要求;酸性α-淀粉酶的最適pH 為2.0～5.5,其對酸的穩(wěn)定性明顯高于中溫α-淀粉酶,能在低pH下液化淀粉,可免去淀粉原料加工過程中反復(fù)調(diào)酸的環(huán)節(jié)[2]。因此,開發(fā)耐酸性α-淀粉酶具有很大的經(jīng)濟、社會和環(huán)境效益,當(dāng)其在食品加工等行業(yè)應(yīng)用后,不僅可以革新淀粉加工生產(chǎn)工藝,降低生產(chǎn)成本,提高產(chǎn)品質(zhì)量,還能大大節(jié)約工業(yè)用糧以及水、電等寶貴資源。

自1963年日本研究者Yasuji Minoda等[3]用黑曲霉(Asperillusniger)生產(chǎn)耐酸性α-淀粉酶以來,各國都對耐酸性α-淀粉酶進行了研究。目前,丹麥、美國、日本等國家已有耐酸性α-淀粉酶的發(fā)酵產(chǎn)品,但價格昂貴難以滿足市場的需要。我國開展相關(guān)研究起步較晚,20世紀90年代時,中科院微生物研究所的科研人員研究了嗜熱真菌Thermomyoeslanuginosus產(chǎn)耐酸性α-淀粉酶的特性[4]。此后,江南大學(xué)、四川大學(xué)、南京大學(xué)等多所院校及研究所相繼開展了相關(guān)研究,主要集中在產(chǎn)耐酸性α-淀粉酶生產(chǎn)菌株的選育、發(fā)酵條件優(yōu)化和基因工程菌構(gòu)建等方面。然而,無論工程菌或從自然界篩選的菌株,均存在酶活力低、熱穩(wěn)定性差以及生產(chǎn)成本較高的問題,故至今國內(nèi)仍未實現(xiàn)其工業(yè)化生產(chǎn)。

原生質(zhì)體誘變技術(shù)是工業(yè)微生物育種的主要技術(shù),相比常規(guī)誘變育種技術(shù)具有操作簡單、誘變效果好等優(yōu)點[4-5]。目前,以原生質(zhì)體誘變技術(shù)選育高產(chǎn)酸性α-淀粉酶黑曲霉菌株的研究報告較少,本文通過對黑曲霉的原生質(zhì)體進行紫外誘變選育,獲得產(chǎn)酸性α-淀粉酶較高的優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 出發(fā)菌株 實驗室篩選、保存的黑曲霉菌株,編號為0-2-1。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基加水,滅菌后調(diào)節(jié)pH4.5。

高滲培養(yǎng)基:蛋白胨0.5g,葡萄糖1.5g,MgSO4·7H2O 0.05g,MnSO4·7H2O 0.003g,FeSO4.7H2O 0.003g,瓊脂粉2g,加入100mL 0.6mol/L NaCl溶液作為溶劑,滅菌后調(diào)節(jié)pH4.5。

低滲培養(yǎng)基:蛋白胨0.5g,葡萄糖1.5g,MgSO4.7H2O 0.05g,MnSO4.7H2O 0.003g,FeSO4.7H2O 0.003g,瓊脂粉2g,以100mL蒸餾水作溶劑,滅菌后調(diào)節(jié)pH4.5。

篩選培養(yǎng)基:蛋白胨0.5g,可溶性淀粉2g,MgSO4.7H2O 0.05g,MnSO4.7H2O 0.003g,FeSO4.7H2O 0.003g,瓊脂粉2g,以100mL蒸餾水作溶劑,滅菌后調(diào)節(jié)pH4.5。

復(fù)篩(液體)培養(yǎng)基:蛋白胨0.5g,酵母膏0.5g,2g可溶性淀粉,MgSO4.7H2O 0.05g,MnSO4.7H2O 0.003g,FeSO4.7H2O 0.003g,以100mL蒸餾水作溶劑,滅菌后調(diào)節(jié)pH4.5。

蝸牛酶、溶菌酶,生化試劑,購自上海博奧生物科技有限公司;纖維素酶,生化試劑,購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

LG10-2.4 高速離心機 北京京力離心機有限公司;LRH-250生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;SW-CJ-2F雙人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;MP-160B霉菌培養(yǎng)箱 上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司;UV-2100紫外分光光度計 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酸性α-淀粉酶活力的測定 參考文獻[5]方法稍作修改,在10mL試管中加入1mL 1%的可溶性淀粉溶液,并加入3.5mL的pH4.5的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液,40℃預(yù)熱10min。加入0.5mL發(fā)酵液,精確保溫10min。取1mL加入到4mL 0.1mol/L的HCl中終止反應(yīng),并取1mL反應(yīng)液與9mL 0.5%碘液顯色,測定OD660。

酶活定義:一個酸性α-淀粉酶單位相當(dāng)于在pH4.5,溫度40℃的條件下,1min將1mL濃度為1%的可溶性淀粉的顯藍強度降低1%所需的酶量[6-7]。

式中:D0為空白吸光值;D為主吸光值;100為系數(shù);10為反應(yīng)時間(min)

1.2.2 原生質(zhì)體的制備和再生 參考文獻[8-10],將活化好的菌種接種于PDA斜面培養(yǎng)基上,于28℃恒溫培養(yǎng)72h,用無菌水從斜面洗脫孢子至有玻璃珠的三角瓶,振蕩使孢子分散,4層紗布過濾。離心(8000r/min,10min)收集孢子,用含有0.1% β-巰基乙醇和0.01mol/L Na2EDTA的溶液懸浮,室溫下振蕩10min,離心收集孢子,無菌水洗滌,用0.9mol/L的甘露醇溶液(pH6.8)滲透壓穩(wěn)定劑將孢子濃度調(diào)整為8×105cfu/mL,加入終濃度為1%蝸牛酶、1%溶菌酶、1%纖維素酶,選置于30℃水浴酶解時間2h,涂布于低滲和高滲培養(yǎng)基,計算原生質(zhì)體制備率和再生率。

1.2.3 原生質(zhì)體紫外誘變 將制備好的原生質(zhì)體稀釋100倍,取5mL,移入直徑9cm培養(yǎng)皿內(nèi),置于距30W紫外燈30cm處的磁力攪拌器上照射[11],每30s取菌液用滲透壓穩(wěn)定劑稀釋后涂布平板,28℃避光培養(yǎng)72h。

1.2.4 初篩 固體平板透明圈法:挑選生長較好的菌落,用滅過菌的牙簽分別點接至初篩培養(yǎng)基,依次編號,28℃培養(yǎng),測量透明圈與菌落直徑比(HC值),以出發(fā)菌株的為對照[12]。

1.2.5 復(fù)篩 挑選HC值較出發(fā)菌株明顯大的8株菌接種在斜面培養(yǎng)基上,培養(yǎng)48h,接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,28℃搖瓶培養(yǎng)72h,將發(fā)酵液離心(8000r/min,15min),取上清液測定酸性α-淀粉酶酶活。

1.2.6 遺傳穩(wěn)定性測試 選取復(fù)篩所得到的酶活較高的突變株進行連續(xù)傳代,每次傳代后發(fā)酵培養(yǎng),測定酸性α-淀粉酶酶活。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 每組實驗進行3～5個平行,以其平均值±標準差報道,平均值和標準差以Microsoft Excel軟件計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體的制備與再生

通過對原生質(zhì)體制備條件的優(yōu)化[11-13],出發(fā)菌株原生質(zhì)體形成率為77.4%,再生率為44.2%。黑曲霉孢子及其原生質(zhì)體顯微形態(tài)如圖1所示,可見原生質(zhì)體和孢子均為圓形,原生質(zhì)體形態(tài)比孢子稍大,顯微鏡下顏色較淺。

圖1 黑曲霉孢子和原生質(zhì)體照片 Fig.1 Spores and protoplast photos of Aspergillus niger

2.2 原生質(zhì)體誘變

以制備好的原生質(zhì)體液進行紫外線誘變,每間隔30s取樣涂布,結(jié)果如圖2所示?？梢?紫外線照射時間為180s時,致死率達到了83.3% 。根據(jù)微生物誘變育種的規(guī)律,一般認為致死率在80%以上,誘變的效果比較好[15],但也有報道指出,致死率在70%～80%之間正向突變的誘變菌株出現(xiàn)的機會較多[17],但較低的致死率大大增加了篩選的工作量,因此選擇180s的紫外線照射劑量。

表1 原生質(zhì)體紫外誘變篩選結(jié)果Table 1 Protoplast Mutation Strains of HC ratio

表2 復(fù)篩菌株遺傳穩(wěn)定性實驗Table 2 Rescreening strain genetic stability test

圖2 紫外照射時間對原生質(zhì)體致死率的影響 Fig.2 Effect of UV irradiation time on fatal rate of protoplast

2.3 優(yōu)良菌株篩選

從再生菌株中選出56株透明圈明顯的突變株測量其HC值,得到8株HC值明顯提高的突變株,其中UV9與出發(fā)菌株透明圈的比較如圖3所示;對8株初篩的突變株搖瓶培養(yǎng),測定發(fā)酵液中粗酶的酶活進行復(fù)篩,結(jié)果如表1所示。可見,正突變株的HC值與其發(fā)酵液中酸性α-淀粉酶酶活并非嚴格的正相關(guān),這可能與其生長速度不一致有關(guān),但趨勢大體上一致。綜合初篩、復(fù)篩結(jié)果,突變株UV9、UV17、UV31性能相對較優(yōu),其酶活相對出發(fā)菌分別提高了54.9%、38.1%、42.0%,需進一步檢驗其遺傳穩(wěn)定性。

圖3 突變株UV9與出發(fā)菌株透明圈比較 Fig.3 Transparent circle comparison of the original strains and mutant strains UV9

2.4 遺傳穩(wěn)定性測試

將突變株UV9、UV17、UV31連續(xù)傳代10次,測定其產(chǎn)酶能力的穩(wěn)定性,結(jié)果如表2所示。以相對于未傳代的突變株的酶活變化率為指標,一般認為變化率保持在±5%以內(nèi)的菌株就具有較好的遺傳穩(wěn)定性[3,15]?？梢?復(fù)篩所得3株突變株均具有較好遺傳穩(wěn)定性,能保持相對穩(wěn)定的較高酸性α-淀粉酶活力。

3 結(jié)論

以產(chǎn)酸性α-淀粉酶的黑曲霉0-2-1為出發(fā)菌,制備其孢子原生質(zhì)體,選用紫外線照射180s作為誘變劑量進行紫外誘變,最終篩選得到3株酶活有較大提高的突變株UV9、UV17、UV31,其酸性α-淀粉酶活力為184.66、162.73、167.31U/mL,分別比出發(fā)菌株提高了54.9%、38.1%和42.0%,遺傳穩(wěn)定性實驗證明3株突變株傳代過程中均保持相對穩(wěn)定的較高酸性α-淀粉酶活力。實驗結(jié)果表明原生質(zhì)體誘變是選育耐酸ɑ-淀粉酶高產(chǎn)菌株行之有效的方法。

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