， ,，*， ，,，*，

(1.北京工商大學(xué)北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048;2.北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100048;3.河南中大生物工程有限公司,鄭州 451162)

β-苯乙醇,又稱(chēng)為2-苯乙醇,是一種具有持久淡雅玫瑰香氣的芳香醇類(lèi)物質(zhì),廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和煙草行業(yè)[1-2]。天然β-苯乙醇主要存在于顯花植物的花果及其提取的精油中,但因其濃度低,提取困難,目前β-苯乙醇主要還是通過(guò)化學(xué)方法進(jìn)行合成。雖然化學(xué)合成的成本低、產(chǎn)量高,但存在著環(huán)境污染嚴(yán)重,產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物等弊端,不符合現(xiàn)代消費(fèi)者崇尚“天然、安全和環(huán)?！钡木G色消費(fèi)理念[3-4]。由微生物轉(zhuǎn)化制備的香料,被稱(chēng)為天然等同香料,符合“綠色生產(chǎn)”的安全標(biāo)準(zhǔn),而且其構(gòu)型、手性單一,有助于香氣品質(zhì)的提高,是近年來(lái)天然香料制備的重要發(fā)展方向[5-6]。

國(guó)外已有部分學(xué)者通過(guò)研究釀酒酵母中氨基酸代謝來(lái)探索β-苯乙醇的微生物制備方法[7-8],而國(guó)內(nèi)還鮮有報(bào)道。在釀酒酵母中,以L-苯丙氨酸為底物,經(jīng)艾利希途徑合成β-苯乙醇,是β-苯乙醇生物轉(zhuǎn)化的快捷途徑,受到轉(zhuǎn)氨酶、脫羧酶和醇脫氫酶的調(diào)節(jié)[6,9]。Vuralhan等以苯丙氨酸、蛋氨酸和亮氨酸為唯一氮源進(jìn)行恒化器培養(yǎng),對(duì)培養(yǎng)得到的酵母細(xì)胞提取物進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)存在一種具有廣泛底物活性的脫羧酶Aro10p(EC 4.1.1.72)參與催化反應(yīng)。ARO10是編碼這種脫羧酶的基因,其轉(zhuǎn)錄情況與α-酮酸脫羧酶在恒化器中培養(yǎng)時(shí)的表達(dá)情況密切相關(guān);將除ARO10基因外的其他α-酮酸脫羧酶基因全部敲除,研究發(fā)現(xiàn)此突變株仍然表現(xiàn)出了脫羧酶活性[10-12]。因此認(rèn)為增強(qiáng)ARO10基因拷貝與表達(dá),有利于增強(qiáng)目的產(chǎn)物β-苯乙醇的產(chǎn)量。本文以S.cerevisiaeS288C為出發(fā)菌株,將脫羧酶基因ARO10進(jìn)行過(guò)量表達(dá),研究其對(duì)β-苯乙醇合成途徑的影響,為β-苯乙醇工程菌構(gòu)建與改造提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

EscherichiacoliTOP10感受態(tài)細(xì)胞 購(gòu)自北京天根公司;SaccharomycescerevisiaeS288C(ATCC 26108TM)、質(zhì)粒PYES2-G418(G418抗性) 由本實(shí)驗(yàn)室制備保藏;質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒 購(gòu)于OMEGA公司;酵母質(zhì)粒提取試劑盒 購(gòu)于北京天根生化科技有限公司;pMD19-T Simple Vector、DNA marker、Ex Taq、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶 購(gòu)于TaKaRa公司;酵母提取物、胰蛋白胨 購(gòu)于北京拜爾迪生物公司;甲醇(色譜純) 購(gòu)于Fisher公司;β-苯乙醇 為本院香精香料實(shí)驗(yàn)室制備;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基[13]、YPD種子培養(yǎng)基[13]。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):無(wú)氨基酸氮源YNB 1.8,蔗糖40,L-苯丙氨酸7,Na2HPO40.5。

1.3 方法

1.3.1ARO10基因的克隆與表達(dá)載體構(gòu)建 根據(jù)Genbank和相關(guān)文獻(xiàn)[14]中公布的S.cerevisiae3-磷酸甘油激酶基因啟動(dòng)子片段Ppgk和S.cerevisiaeAR010基因編碼序列,利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。擴(kuò)增Ppgk所用引物:PGK-F:5′-TATCAGACCGGTTATTTTAGATTCCTGACTT-3′,下劃線部分為酶切位點(diǎn)AgeI,PGK-R:5′-CGCTCGCAGCTGTGTTTTTATATTTGTTGT-3′,下劃線部分為酶切位點(diǎn)PvuII。擴(kuò)增ARO10的引物ARO10F:5′-CGAGCTCATGGCACCTGTTACAATT-3′,下劃線部分為酶切位點(diǎn)SacI;ARO10R:5′-CTCTAGACTATTTTTTATTTCTTTTAAGTGCC-3′,下劃線部分為酶切位點(diǎn)XbaI。酵母轉(zhuǎn)化子檢測(cè)所用引物:

T7F:5′-CAGCTGTAATACGACTCACTATAGGG-3′,

CYC1R:5′-AAATAAATAGGGACCTAGACTTC AGG-3′。

以S.cerevisiaeS288C 基因組為模板,Ex Taq DNA Polymerase進(jìn)行PCR反應(yīng)。25μL反應(yīng)體系如下:Ex Taq聚合酶0.3μL,基因組<1μg,上下游引物各1μL(10μmol/L),dNTP混合物4μL(2.5mmol/L),10×Ex Taq Buffer 5μL,ddH2O 至25μL;

擴(kuò)增Ppgk和ARO10基因的反應(yīng)條件分別為:94℃ 5min;94℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 40s,30 個(gè)循環(huán);72℃ 10min。

94℃ 5min;94℃ 30s,58℃ 30s,72℃ 2min,30個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。

分別將擴(kuò)增的Ppgk片段和ARO10片段連接到pMD19-T Simple質(zhì)粒,進(jìn)行測(cè)序;對(duì)可能帶有Ppgk片段和ARO10基因的質(zhì)粒pMD19-T-Ppgk、pMD19-T-ARO10進(jìn)行酶切回收。

重組質(zhì)粒pYES2-Ppgk-ARO10構(gòu)建見(jiàn)圖1。先用AgeI和PvuII分別對(duì)質(zhì)粒pMD19-T-Ppgk和pYES2-G418于37℃酶切5h。將酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離,用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段,經(jīng) T4 DNA Ligase于4℃連接過(guò)夜,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于E.coliTOP10感受態(tài)細(xì)胞,選取陽(yáng)性菌落擴(kuò)繁并進(jìn)行重組質(zhì)粒提取,得到質(zhì)粒pYES2-Ppgk。再用SacI和XbaI分別對(duì)質(zhì)粒pMD19-T-ARO10和pYES2-Ppgk進(jìn)行酶切,其余方法同上,最終得到重組質(zhì)粒pYES2-Ppgk-ARO10。

圖1 重組質(zhì)粒pYES2-Ppgk-ARO10的構(gòu)建策略 Fig.1 The construction strategy of recombinant plasmid of pYES2-Ppgk-ARO10

1.3.2 重組質(zhì)粒在釀酒酵母中的表達(dá) 利用PEG/LiAc高效酵母轉(zhuǎn)化方法將空載pYES2-Ppgk和重組表達(dá)載體pYES2-Ppgk-ARO10分別導(dǎo)入S.cerevisiaeS288C感受態(tài)細(xì)胞中,獲得的酵母轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR驗(yàn)證。將酵母陽(yáng)性克隆接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中,于30℃,200r/min,過(guò)夜振蕩培養(yǎng)。取適量菌液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,最終調(diào)至OD600=0.25,30℃繼續(xù)培養(yǎng),每隔一定時(shí)間收集發(fā)酵液。高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)發(fā)酵液中的β-苯乙醇。

1.3.3 β-苯乙醇的HPLC檢測(cè)與數(shù)據(jù)處理 準(zhǔn)確吸取0.100g β-苯乙醇并加水定容于10mL容量瓶中,制成10g/L的貯備液,再分別吸取貯備液10、30、50、70、80、100和150μL加水混勻定容于7個(gè)10mL容量瓶中制成0.01、0.03、0.05、0.07、0.08、0.10和0.15g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液,經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾裝入色譜分析瓶,HPLC檢測(cè)其峰面積,以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫軸,測(cè)得的峰面積為縱軸繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將獲得的釀酒酵母轉(zhuǎn)化子SP10發(fā)酵培養(yǎng),收集得到的發(fā)酵液8000r/min離心,取適量上清液稀釋10倍用于β-苯乙醇的HPLC檢測(cè)。檢測(cè)β-苯乙醇采用LC-20A島津液相色譜儀,檢測(cè)條件[15]為:色譜柱 RP-C18 色譜柱(4.6mm×150mm,5μm),V(甲醇)∶V(水)=50∶50作為流動(dòng)相,檢測(cè)波長(zhǎng)215nm,進(jìn)樣量10μL,流速1.0mL/min。由此測(cè)出發(fā)酵液中β-苯乙醇特征峰的峰面積,代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線,即可得出發(fā)酵液中的β-苯乙醇濃度,再利用Excel 2003對(duì)其濃度和發(fā)酵時(shí)間作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARO10基因的克隆與表達(dá)載體構(gòu)建

以S.cerevisiaeS288C基因組為模板,分別用上下游引物PGK-F,PGK-R;ARO10F,ARO10R,擴(kuò)增目的片段Ppgk和ARO10,PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)。由圖2和圖3可知,擴(kuò)增得到的單一DNA片段分別為780bp和1900bp左右,與預(yù)期大小相符。

圖2 基因Ppgk的擴(kuò)增 Fig.2 Amplification of Ppgk gene by PCR

圖3 基因ARO10的擴(kuò)增 Fig.3 Amplification of ARO10 gene by PCR

DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段,連接到pMD19-T Simple Vector,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliTOP10感受態(tài)細(xì)胞,選取陽(yáng)性菌落擴(kuò)繁并進(jìn)行酶切驗(yàn)證,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。篩選得到的轉(zhuǎn)化子均切下大小正確的條帶,且測(cè)序結(jié)果與Genbank 所公布基因序列一致。

按照1.3.1的方法構(gòu)建重組質(zhì)粒pYES2-Ppgk和pYES2-Ppgk-ARO10,將經(jīng)測(cè)序正確的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子過(guò)夜培養(yǎng),用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒pYES2-Ppgk和pYES2-Ppgk-ARO10。分別對(duì)兩種質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證,酶切鑒定見(jiàn)圖4及圖5。

圖4 質(zhì)粒pYES2-Ppgk的酶切驗(yàn)證 Fig.4 Restriction analysis of plasmid pYES2-Ppgk

圖5 質(zhì)粒pYES2-Ppgk-ARO10的酶切驗(yàn)證 Fig.5 Restriction analysis of plasmid pYES2-Ppgk-ARO10

2.2 重組釀酒酵母的篩選與鑒定

重組質(zhì)粒pYES2-Ppgk和pYES2-Ppgk-ARO10轉(zhuǎn)入釀酒酵母后,在含G418的YPD平板上進(jìn)行篩選,在G418濃度達(dá)到200μg/mL的平板上未見(jiàn)釀酒酵母S288C菌株生長(zhǎng)。

分別從轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pYES2-Ppgk和pYES2-Ppgk-ARO10的篩選平板上挑取幾個(gè)單菌落作為重組菌株,提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒,為避免假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn),分別選擇引物PGK-F/CYC1R和引物T7F/CYC1R對(duì)兩種質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增的片段大小約為1000bp和2000bp。凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖6、圖7顯示,篩選到的轉(zhuǎn)化子中均擴(kuò)增出目的基因特異性條帶,表明構(gòu)建的兩種重組質(zhì)粒均已轉(zhuǎn)化進(jìn)入釀酒酵母菌株中;陰性對(duì)照為已轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pYES2-G418的釀酒酵母S288C菌株,無(wú)目的條帶。

圖6 pYES2-Ppgk轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證 Fig.6 The detection of pYES2-Ppgk transformants by PCR

圖7 pYES2-Ppgk-ARO10轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證 Fig.7 The detection of pYES2-Ppgk-ARO10 transformants by PCR

2.3 搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)和β-苯乙醇檢測(cè)

β-苯乙醇的標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)高效液相色譜(HPLC)分析,β-苯乙醇特征峰的出峰時(shí)間約在9min. 按照1.3.3中β-苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的方法,處理和進(jìn)樣測(cè)定,以β-苯乙醇質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖8)。β-苯乙醇在0.01～0.15g/L 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系,線性回歸方程為y=2×107x-10005(R2=0.9976)。

圖8 β-苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線 Fig.8 Standard Curve of β-phenethyl alcoho

按照1.3.3中的檢測(cè)條件,對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行液相色譜分析,能夠較好的分離β-苯乙醇,并通過(guò)其峰面積與標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算其在發(fā)酵液中的濃度。由圖9可知,β-苯乙醇生成量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸積累,發(fā)酵60h時(shí)其生成量達(dá)到最高,導(dǎo)入空質(zhì)粒pYES2-Ppgk的重組菌株SP和S.cerevisiaeS288C野生菌,β-苯乙醇的生成量均為0.86g/L,轉(zhuǎn)化子SP10的β-苯乙醇的生成量為1.0g/L,相較前兩者均提高16.3%;繼續(xù)發(fā)酵到96h,由于β-苯乙醇的積累對(duì)于酵母細(xì)胞有一定的毒性作用,抑制其生長(zhǎng),且在搖瓶過(guò)程中有一些揮發(fā)損失,所以β-苯乙醇產(chǎn)量沒(méi)有再增加,而是均有小幅度的下調(diào)。結(jié)果表明,S.cerevisiaeS288C中脫羧酶是β-苯乙醇生物合成途徑的關(guān)鍵酶,增強(qiáng)脫羧酶基因ARO10的克隆及基因表達(dá),有利于提高β-苯乙醇的產(chǎn)量,為將來(lái)β-苯乙醇的釀酒酵母工程菌構(gòu)建提供了方向。

圖9 發(fā)酵時(shí)間對(duì)S. cerevisiae的β-苯乙醇合成的影響 Fig.9 The β-phenethyl alcohol content in different time

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

將PGK1啟動(dòng)子片段克隆并替換原pYES2-G418穿梭質(zhì)粒中的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,構(gòu)建新的表達(dá)載體pYES2-Ppgk;再將脫羧酶基因ARO10克隆與表達(dá)載體pYES2-Ppgk連接,構(gòu)建了釀酒酵母表達(dá)質(zhì)粒pYES2-Ppgk-ARO10。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后,LiAc/SSDNA/PEG方法轉(zhuǎn)化至S.cerevisiaeS288C中進(jìn)行表達(dá),通過(guò)基因表達(dá)、發(fā)酵產(chǎn)物測(cè)定等不同水平檢測(cè),結(jié)果表明,構(gòu)建的釀酒酵母轉(zhuǎn)化子SP10 β-苯乙醇產(chǎn)量有所提高,發(fā)酵60h時(shí),其生成量達(dá)到1.0g/L,較野生型菌株提高了16.3%。因此,PGK1啟動(dòng)子可用于穿梭質(zhì)粒的啟動(dòng)表達(dá),且新構(gòu)建的表達(dá)載體可以使脫羧酶基因ARO10在釀酒酵母中過(guò)量表達(dá);S.cerevisiaeS288C中脫羧酶Aro10p是β-苯乙醇生物合成途徑的關(guān)鍵酶,增強(qiáng)脫羧酶基因ARO10的克隆及基因表達(dá),有利于增強(qiáng)β-苯乙醇的合成代謝及目的產(chǎn)物產(chǎn)量的提高

3.2 討論

啟動(dòng)子是表達(dá)載體上不可或缺的核心元件之一,其活性強(qiáng)弱直接影響目的基因轉(zhuǎn)錄效率的高低,進(jìn)而影響基因表達(dá)水平。本研究使用的釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶PGK1基因的啟動(dòng)子為組成型強(qiáng)啟動(dòng)子,轉(zhuǎn)錄活性高,已廣泛應(yīng)用于外源基因在釀酒酵母中的表達(dá);此外,采用組成型表達(dá)的策略無(wú)需加入誘導(dǎo)劑,避免了對(duì)誘導(dǎo)物濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和溫度等條件進(jìn)行優(yōu)化的繁瑣工作,使目的基因的表達(dá)更高效方便,同時(shí)消除了誘導(dǎo)物對(duì)目的產(chǎn)物代謝途徑的影響并有利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)開(kāi)展重組菌株的代謝流量分析。

脫羧酶基因ARO10在釀酒酵母中的過(guò)量表達(dá)有利于增強(qiáng)β-苯乙醇的合成代謝及目的產(chǎn)物產(chǎn)量的提高。但其產(chǎn)量并沒(méi)有達(dá)到最理想水平,可能有幾方面的原因:一是實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件沒(méi)有進(jìn)行優(yōu)化;二是只進(jìn)行了小規(guī)模的搖瓶發(fā)酵,還未進(jìn)行發(fā)酵罐的發(fā)酵實(shí)驗(yàn),由于在發(fā)酵過(guò)程中,無(wú)法進(jìn)行補(bǔ)料和一些重要發(fā)酵參數(shù)的控制,所以在一定程度上限制了β-苯乙醇的產(chǎn)量;三是β-苯乙醇的合成代謝通路中有多種酶進(jìn)行調(diào)控,改變其中一些基因的表達(dá),對(duì)于目的產(chǎn)物的代謝流量的影響有限,本實(shí)驗(yàn)室也正在構(gòu)建氨基轉(zhuǎn)移酶ARO8基因與脫羧酶ARO10基因耦合過(guò)量表達(dá)以及副反應(yīng)途徑基因敲除的工程菌,以增強(qiáng)主反應(yīng)途徑的相關(guān)酶基因的表達(dá)及代謝流量,減弱或阻斷副產(chǎn)物支路代謝流量,為后續(xù)的研究提供了思路和技術(shù)數(shù)據(jù)的支持。

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