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(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶 400715;2.重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系,食品安全與營養(yǎng)研究所,重慶 400067)

生物氧化作用對生物有機(jī)體而言是一個重要的生理過程,但當(dāng)機(jī)體受到外界環(huán)境的不利影響或出現(xiàn)病變時,就會導(dǎo)致體內(nèi)的活性氧(ROS)及其它自由基不能被有效地清除,影響細(xì)胞活性,對機(jī)體產(chǎn)生毒害,最終導(dǎo)致衰老、腫瘤等病癥[1-2]。因此為了更好的加強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力,且從食品安全性上考慮,開發(fā)天然抗氧化劑具有非常重要的意義,現(xiàn)已成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)[3]。近年來,一些發(fā)酵乳制品,因?yàn)榫哂歇?dú)特的口感和較強(qiáng)的抗氧化活性而受到越來越多人的關(guān)注[4],而經(jīng)過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明,部分乳酸菌具有良好的抗氧化活性,如黃珊珊等[5]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌的抗氧化活性優(yōu)于保加利亞乳桿菌。張江魏等[6]通過抗亞油酸過氧化能力和清除DPPH自由基實(shí)驗(yàn),從30株乳酸菌中篩選出抗氧化活性較強(qiáng)的2種乳酸菌株。Lin等[7-8]研究了嗜酸乳桿菌清除羥自由基和抗脂質(zhì)過氧化的能力。Verena等[9]研究發(fā)現(xiàn)服用含有一定劑量乳酸菌的牛乳后乳酸菌可以保護(hù)腸道細(xì)胞DNA免受氧化損傷。青藏高原自然發(fā)酵牦牛酸奶作為藏區(qū)人民特色食品和生活必需品,以其豐富的營養(yǎng),獨(dú)特的風(fēng)味和抗氧化、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫能力等保健功能,受到了越來越多的人的關(guān)注[10]。研究表明,牦牛酸奶的保健功能與其中含有的優(yōu)勢乳酸菌有密切的關(guān)系,這些乳酸菌具有抑菌、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗衰老和抗癌等生理功能。因此,無論從營養(yǎng)保健還是安全性方面考慮,牦牛酸奶中的乳酸菌作為天然抗氧化物質(zhì)吸引了眾多學(xué)者的研究興趣,成為近年來食品研究的新興領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)菌株 將本實(shí)驗(yàn)室采至從西藏及川西青藏高原牧民家庭的10份自然發(fā)酵牦牛酸奶中分離純化得到的15株乳酸菌菌株,編號為:La1～La15;MRS培養(yǎng)基、脫脂乳培養(yǎng)基:北京索萊寶生物科技有限公司;PBS緩沖液(pH7.4)、Tris-HCl(pH8.2)、氫氧化鈉、過氧化氫(H2O2)、過氧化氫酶、抗壞血酸、三氯甲烷、鄰苯三酚、二乙三胺五乙酸、硫酸亞鐵(FeSO4)、硫代巴比妥酸(TBA)、O-菲羅啉、三氯乙酸(TCA)、亞油酸、亞油酸乳化液、二苯代苦味肼基自由基(DPPH)等試劑均為國產(chǎn)分析純。

紫外可見分光光度計-2450 SHIMADZU日本島津公司;高壓滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械廠;SW-CJ-IFD型潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;DHG-9240型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;筆型pH計 上海宇隆儀器有限公司;HZ-9211K恒溫振蕩器 太倉市科教器材廠;臺式冷凍離心機(jī) 美國SIGMA公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌株的活化培養(yǎng) 將15株已純化保存的乳酸菌株樣品分別接種于脫脂乳培養(yǎng)基中,置30℃活化培養(yǎng)24h,然后劃線接種于MRS平板,30℃培養(yǎng)48h。

1.2.2 乳酸菌無細(xì)胞提取物的制備 分別挑取活化后的15株乳酸菌株于MRS液體培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)24h,發(fā)酵液于4000×g離心15min,收集菌體,并用PBS(pH7.4)緩沖液洗滌3次,將菌數(shù)調(diào)整為1010cfu/mL,重懸于PBS中,在冰浴中超聲波破碎菌體,破碎液于4℃,12000×g離心30min,取上清液,即為所需待測樣品[6,11]。

1.2.3 乳酸菌抗氧化活性的檢測

1.2.3.1 對H2O2的耐受能力的實(shí)驗(yàn) 將活化后的菌株離心收集菌體,用PBS緩沖液洗滌,制備成108cfu/mL的菌液,在5mL H2O2濃度為0%、0.2%、0.3%、0.5%、1%的PBS溶液中分別加入0.5mL菌液,37℃處理1min,再分別加入0.2mg/mL過氧化氫酶;涂布于MRS固體培養(yǎng)基,30℃培養(yǎng)48h,計數(shù)并計算其存活率[6,11],并重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

存活率(%)=(AX-APBS)/(A0-APBS)×100

式中:AX為各濃度H2O2時計數(shù)結(jié)果;APBS為PBS計數(shù)結(jié)果;A0為不加H2O2時計數(shù)結(jié)果。

清除率(%)=[1-(A11-A10)/(A01-A00)]×100

式中:A11為含樣品和鄰苯三酚;A10為含樣品,不含鄰苯三酚;A00為不含樣品和鄰苯三酚;A01為不含樣品,含鄰苯三酚。

1.2.3.3 螯合Fe2+能力的實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[12]中的方法,略有改進(jìn)(空白對照為PBS):在0.5mL乳酸菌無細(xì)胞提取物中依次加入1%的抗壞血酸0.1mL,0.4%的FeSO40.1mL和0.2mol/L的NaOH 1mL;將混合液在30℃水浴20min,三氯乙酸沉淀蛋白,于4℃ 4500g/min離心10min;取上清液0.2mL,加入0.1%的O-菲羅啉(質(zhì)量分?jǐn)?shù))2mL,反應(yīng)10min,記錄其在510nm波長處的吸光值(A),并重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.3.4 抗脂質(zhì)過氧化能力的實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[12],用硫代巴比妥酸(TBA)法,通過檢測脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物丙二醛(MDA)的含量從而得知脂質(zhì)過氧化的情況,這是目前公認(rèn)的反映脂質(zhì)過氧化的指標(biāo)[13-15]。MDA在酸性條件下可以與TBA發(fā)生反應(yīng)生成3,5,5-三甲基惡唑2,4-二酮,在532nm波長處有吸收峰,且吸收程度與抗氧化活性呈線性關(guān)系,通過下面的公式計算出抗脂質(zhì)過氧化率(空白對照為PBS),并重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

抗脂質(zhì)過氧化率(%)=[1-A(樣品)/A(空白)]×100

1.2.3.5 清除DPPH自由基能力的實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[6,12]的方法,略作改動如下:取1mL乳酸菌無細(xì)胞提取物,加入1mL 0.2mmol/L的DPPH自由基甲醇溶液,室溫、黑暗中反應(yīng)30min;用三氯甲烷抽提反應(yīng)液,記錄其在517nm波長處的吸光值(A),并重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

DPPH自由基清除率(%)=[1-A(樣品)/A(空白)]×100

式中:A(空白):空白對照為去離子水。

1.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用IBM SPSS 19.0軟件,所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均表示為平均值±SD值,差異顯著性分析采用一維方差分析(One-Way ANOVA),顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 對H2O2的耐受能力實(shí)驗(yàn)

以0% H2O2中乳酸菌的存活率為100%計算。如圖1所示,15株乳酸菌均對H2O2有不同程度的耐受能力。當(dāng)H2O2濃度為0.2%時,乳酸菌的存活率為85%～94%之間,最高為菌株La2,達(dá)到93.5%,菌株La1和 La10的存活率也均超過93%。當(dāng)H2O2濃度為0.3%時,乳酸菌的存活率為70%～85%之間,最高為菌株La5,菌株La10和La1的存活率也均超過84%。當(dāng)H2O2濃度為0.5%時,乳酸菌的存活率45%～66%之間,最高為菌株La15,達(dá)到65.2%,菌株La1和La5的存活率也均超過62%。當(dāng)H2O2濃度達(dá)到1%時,乳酸菌的存活率為10%～33%之間。其中菌株La15存活率最高,達(dá)到32.9%;其次為菌株La6,達(dá)到30.6%;菌株La4、La10和La11也顯示了較高的耐受能力,乳酸菌的存活率分別達(dá)到了27.8%、25.9%和25.4%。

圖1 乳酸菌在不同濃度H2O2中的存活率(n=3) Fig.1 Survival of Lactobacillus in different concentrations of H2O2(n=3)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,15株乳酸菌的存活率均隨著H2O2濃度的增高而減低;當(dāng)H2O2濃度達(dá)到1%時,乳酸菌的存活率較高的菌株為La15、La6、La4、La10和La11這五株菌。

2.2 清除超氧自由基的能力實(shí)驗(yàn)

圖2 乳酸菌無細(xì)胞提取物的清除超氧自由基的能力(n=3) Fig.2 Scavenging rates of cell-free extracts of Lactobacillus against superoxide anion free radicals(n=3)

2.3 螯合Fe2+能力的實(shí)驗(yàn)

由圖3可知,15株乳酸菌均對Fe2+有一定的螯合能力,每1010個乳酸菌的無細(xì)胞提取物可螯合Fe2+的量在5.3×10-6～62.7×10-6。其中螯合能力較高的有3株菌,分別為La3、La10和La11,其中螯合能力最強(qiáng)的為La10,達(dá)62.7×10-6。

圖3 乳酸菌無細(xì)胞提取物的螯合Fe2+能力(n=3) Fig.3 The ability of Fe2+ chelating of cell-free extracts of Lactobacillus(n=3)

機(jī)體內(nèi)許多氧化過程都需要銅、鐵等金屬離子的參與,故這些過渡金屬離子是導(dǎo)致氧化損傷的一種重要原因。當(dāng)金屬離子被螯合后,便不能啟動多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化,從而減緩了脂類化合物氧化的速度,阻止其對機(jī)體生物膜和核酸的傷害。因此,對Fe2+的螯合能力對抑制氧化具有非常重要的意義。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,La3、La10和La11這三株乳酸菌對Fe2+的螯合能力優(yōu)于其他菌株,具有更強(qiáng)的抗氧化能力。這與Kai等[17]研究乳酸菌對腸黏膜的抗氧化作用時發(fā)現(xiàn)的乳酸菌菌株通過減少金屬離子和脂質(zhì)過氧化作用來提高整體抗氧化水平的,Lee等研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌的抗氧化效果是通過螯合銅離子和亞鐵離子來實(shí)現(xiàn)的[18]是一致的。

2.4 抗脂質(zhì)過氧化能力的實(shí)驗(yàn)

由圖4可知,在抗亞油酸過氧化實(shí)驗(yàn)中,15株乳酸菌對亞油酸過氧化均有不同程度的抑制作用,抑制率的范圍在5%～71%之間。其中抑制率較高的有三株菌,分別是La3、La10和La11,其中La3的抑制率最高,達(dá)到70.8%。

圖4 乳酸菌無細(xì)胞提取物的抗脂質(zhì)過氧化的能力(n=3) Fig.4 The ability of anti-lipid peroxidation of cell-free extracts of Lactobacillus(n=3)

自由基攻擊細(xì)胞膜上的多聚不飽和脂肪酸而觸發(fā)脂質(zhì)過氧化等一系列鏈?zhǔn)椒磻?yīng)叫脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。脂質(zhì)過氧化反應(yīng)在機(jī)體的新陳代謝過程中起著重要的作用,如果失調(diào),就會引起氧自由基連鎖反應(yīng),損害機(jī)體的生物膜及其功能,使細(xì)胞發(fā)生病變及纖維化,造成機(jī)體神經(jīng)、組織、器官等損傷。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,La3、La10和La11這三株乳酸菌的抗脂質(zhì)過氧化的能力優(yōu)于其他菌株,具有更強(qiáng)的抗氧化能力。

2.5 清除DPPH自由基能力的實(shí)驗(yàn)

由圖5可知,15株乳酸菌對DPPH自由基均有一定的清除作用,清除率的范圍在8%～49%之間。其中清除率較高的有3株菌,分別是La3、La10和La11,清除率最高的是La10,達(dá)到48.6%。

圖5 乳酸菌無細(xì)胞提取物清除DPPH自由基的能力(n=3) Fig.5 Scavenging rates of cell-free extracts of Lactobacillus against DPPH free radicals(n=3)

DPPH自由基是一種以氮為中心的,很穩(wěn)定的自由基,乳酸菌能清除它,說明其具有降低羥基等自由基和打斷脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng)的作用。通過檢測乳酸菌對DPPH自由基清除能力的高低可以表示其抗氧化能力的強(qiáng)弱[19]。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,La3、La10和La11這三株乳酸菌的對DPPH自由基清除能力優(yōu)于其他菌株,具有更強(qiáng)的抗氧化能力。

3 結(jié)論

在本研究的基礎(chǔ)上,我們準(zhǔn)備將篩選出的菌株La3、La10和La11做體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步驗(yàn)證其抗氧化能力,為合理利用開發(fā)乳酸菌抗氧化制劑提供理論參考。

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