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(上海海洋大學食品學院，上海 201306)

南極磷蝦是一個巨大的蛋白資源,并且被認為具有很大的藥用前景,波蘭和前蘇聯(lián)有文獻稱磷蝦為健康食品,并且用南極磷蝦來治療動脈硬化和降低血液中膽固醇的含量。在磷蝦體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了各種有用的化學物質(zhì),有幾種經(jīng)研究被認為具有商業(yè)開發(fā)的價值[1]。對于我國這樣一個自然資源相對貧乏的人口大國來講,對南極磷蝦的綜合開發(fā)利用具有重要的戰(zhàn)略意義。

抗氧化肽屬生物活性肽的一種。不僅具有多肽產(chǎn)品的營養(yǎng)作用,而且具有抗氧化和清除自由基的功能,可增強人體抗衰老、抗疾病能力。目前市場上的抗氧化劑大多為人工合成的,例如維生素C、維生素E,作用效果好,但化學合成物質(zhì)存在著安全隱患,它在清除自由基的同時也對人體的組織或器官產(chǎn)生副作用。研究表明,許多動植物的水解蛋白和氨基酸都有抗氧化性[2]。分子量在3～10ku的磷蝦多肽比天然抗氧化劑維生素E的清除自由基能力強[3]。南極磷蝦多肽不僅可以加工成營養(yǎng)補充劑,而且也可以作為制備抗氧化、抗衰老的保健品或化妝品的原料,具備廣闊的開發(fā)利用潛力[4]。因此,無副作用的生物活性肽更具優(yōu)勢。然而,南極磷蝦抗氧化多肽的生產(chǎn)缺乏技術(shù)基礎,抗氧化多肽提取耗時久、得率低、效果差、成本高,導致現(xiàn)在市場上抗氧化多肽產(chǎn)品處于初級開發(fā)階段[5]。本實驗旨在基于國內(nèi)外對抗氧化性多肽分子結(jié)構(gòu)、分子大小與抗氧化生理功能聯(lián)系的研究,達到短時、高產(chǎn)率、低成本水解出具有較強抗氧化功能的南極磷蝦多肽,為抗氧化南極磷蝦多肽產(chǎn)品的進一步開發(fā)、生產(chǎn)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

冷凍的南極磷蝦 2012年3月捕于南極FAO 48.2區(qū);中性蛋白酶 19630U/g,上海源葉生物科技有限公司;胰蛋白酶 174850U/g,上海生物技術(shù)公司;三氯化鐵 天津市博迪化工有限公司;水楊酸 天津市博迪化工有限公司;硫酸亞鐵 上海第二鋼鐵廠;DPPH自由基 Sigma公司;抗超氧陰離子自由基與產(chǎn)生超氧陰離子自由基測試盒 南京建成生物科技研究所;SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳低分子量標準蛋白質(zhì) 上海源葉生物科技有限公司;三羥甲基氨基甲烷 上海維編科貿(mào)有限公司;SDS sino-American biotechnology公司;碳酸鈉、氫氧化鈉、三氯乙酸(TCA)、四甲基乙二胺、過硫酸銨、丙烯酰胺等 國藥集團,分析純。

RO-NF-UF-4100型膜分離裝置、中空纖維式超濾組件:外壓式PS-5,內(nèi)壓式PS-10,PES-3 卷式超濾組件 上海摩速科學器材有限公司;GL-20G-II冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠;UNICO UV-2000紫外可見分光光度計 北京譜析通用儀器有限責任公司;真空冷凍干燥器 CHRIST ALPHA1-2,北京博勱行儀器有限公司;DYCZ-24D垂直板電泳槽 北京市六一儀器廠;DYY-III穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1 南極磷蝦蛋白水解物的制備 參照遲海[6]等方法,將冷凍的南極磷蝦裝入保鮮袋封口,用冷水解凍,稱取一定量解凍的南極磷蝦于Tris-緩沖液(0.05mol/L,pH7.5)中,料液比(w/v)為1∶2[3],均質(zhì)1min,加入復合酶(中性蛋白酶∶胰蛋白酶=1∶1)[7],置于45℃恒溫水浴保溫6h,酶解結(jié)束后,100℃滅酶10min。冷卻后,4℃ 11000r/min離心20min,取上清液測其抗氧化活性。

1.2.2 抗氧化能力的測定

1.2.2.1 樣品的抗超氧陰離子自由基能力 方法參照測試盒說明書。

1.2.2.2 樣品清除DPPH自由基的能力參考文獻[9] 取0.2mL待測液和1.8mL無水乙醇于10mL試管中,然后加入2.0mL濃度為0.2mmol/L的DPPH·無水乙醇溶液,手振蕩使其混合均勻,室溫下反應20min,在4℃、轉(zhuǎn)速為5000r/min離心10min,然后在517nm波長處用分光光度計測上清液的吸光值為Ai;取0.2mL待測液和1.8mL無水乙醇于10mL試管中,加入2.0mL無水乙醇,手振蕩使其混合均勻,室溫下反應20min,在4℃、轉(zhuǎn)速為5000r/min離心10min,然后在517nm波長處用分光光度計測上清液的吸光值為Aj;參比為2.0mL濃度為0.2mmol/L的DPPH·無水乙醇溶液和2.0mL無水乙醇的混合反應液,手振蕩使其混合均勻,室溫下反應20min,在4℃、轉(zhuǎn)速為5000r/min離心10min,然后在517nm波長處用分光光度計測上清液的吸光值A0。

待測液對DPPH自由基的清除率的計算公式為:

K(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100

1.2.2.3 樣品清除羥基自由基能力 在10mL試管中加入1.5mL的待測液,然后依次加入0.3mL濃度為 6mmol/L的FeSO4,1.5mL濃度為6mmol/L的水楊酸,用蒸餾水補齊至4.8mL,搖勻,最后加入0.3mL濃度為6mmol/L的H2O2啟動反應,靜置10min后于510nm處測定吸光度?？紤]到提取液本身的吸光值,做試樣空白,測出扣除試樣空白的吸光度,同時測定空白對照液的吸光度。

清除率(%)=(A0-A1+A2)/A0×100

其中:A0為未加提取液時溶液的吸光度;A1為加提取液后溶液的吸光度;A2為提取液的吸光度。

1.2.3 超濾分離 將南極磷蝦蛋白酶解液離心,取上清液,經(jīng)10ku超濾膜(PS-10中空纖維組件)截流分離,保留濃縮液;將濾液再經(jīng)5ku超濾膜(PS-5中空纖維組件)截流分離,保留濃縮液;將濾液再經(jīng)3ku超濾膜(PES-3 卷式超濾組件)截離,保留濃縮液;將濾液再經(jīng)0.5ku納濾膜(卷式組件)截離,保留濃縮液和濾液。超濾過程保持組件最大工作壓力不超過0.15MPa,納濾不要超過0.4MPa,依次制備分子量為10ku以上、5～10、3～5、0.5～3、0.5ku以下的南極磷蝦多肽溶液。然后將各部分溶液進行真空冷凍干燥,分別測定其抗氧化活性。

1.2.4 tricine-SDS-PAGE電泳 配制15.5%的分離膠、10%的夾層膠和4%的濃縮膠。制作凝膠板,先制備分離膠,聚合后,再制備夾層膠,最后制備濃縮膠,三種膠長度比例為4∶1.5∶1,上樣量:濃度為300mg/mL的樣品8、12μL,打開電源,將電壓調(diào)至30V電泳1h,待樣品進入分離膠后,將電壓調(diào)至100V,待染料前沿遷移至距硅膠框底1～1.5cm處,停止電泳,一般需要4～6h,電泳結(jié)束后,剝膠,將膠放在大培養(yǎng)皿內(nèi),用固定液固定20min,染色20～30min,漂洗。

2 結(jié)果與討論

2.1酶解條件的篩選

本實驗選用復合酶在pH7.5,溫度45℃,料液比(m/v)為1∶2的條件下,改變時間,對南極磷蝦蛋白進行酶解。采用抗氧化活性大小為指標,確定最適合的酶解時間,改變了以往國內(nèi)在活性肽生產(chǎn)工藝上先測水解度,再做常規(guī)活性測定[12]的方法。

2.1.1 清除超氧陰離子自由基能力的測定 超氧陰離子自由基是生命代謝中對生物體危害很嚴重的一種自由基,清除超氧陰離子自由基的能力是檢測樣品抗氧化性的重要指標。

圖1顯示,南極磷蝦蛋白酶解液清除超氧陰離子自由基的能力大于未經(jīng)酶解的南極磷蝦蛋白的清除能力,且在1、4h時酶解液清除超氧陰離子自由基的能力達到較大值,約為未酶解南極磷蝦蛋白的1.71倍,之后逐漸變小,但在2h時清除率下降,可能是蛋白酶解得到多肽,隨著酶解時間的增加,其肽段斷裂,產(chǎn)生氨基酸殘基,掩蓋了具有清除超氧陰離子自由基的某些氨基酸末端的活性基團或活性位點,使其清除率突然下降。因此經(jīng)1或4h酶解,可得到對超氧陰離子自由基有較強清除能力的南極磷蝦多肽。

圖1 酶解物的超氧陰離子自由基清除能力 Fig.1 The scavenging effects of zymolyte on superoxide anion free radical

2.1.2 清除DPPH自由基能力的測定 DPPH·是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基,它的穩(wěn)定性主要來自3個苯環(huán)的共振穩(wěn)定作用及空間障礙,使夾在中間的氮原子上不成對的電子不能發(fā)揮其應有的電子成對作用。作為一種穩(wěn)定的自由基,DPPH·可以捕獲其他的自由基。有自由基清除劑存在時,DPPH·的單電子被捕捉而使其顏色變淺,在最大光吸收波長處的吸光值下降,且下降程度呈線性關系,從而以評價實驗樣品的抗氧化能力[11]。

圖2表明,南極磷蝦蛋白酶解液清除DPPH自由基的能力大于未經(jīng)酶解的南極磷蝦蛋白清除能力,且在酶解6h時酶解液清除DPPH自由基的能力達到最大,為未酶解南極磷蝦蛋白的3.17倍,之后逐漸變小。因此經(jīng)6h酶解,可得到對DPPH自由基有較強清除能力的南極磷蝦多肽。

圖2 酶解物的清除DPPH·能力 Fig.2 The scavenging effects of zymolyte on DPPH·

2.1.3 清除羥基自由基能力的測定 自由基是引起人類衰老和許多疾病的重要因素,例如癌癥、多發(fā)性硬化癥、帕金森疾病、免疫系統(tǒng)疾病等,羥基自由基是人體內(nèi)最主要的自由基,其消除率是反映藥物抗氧作用的重要指標[10]。

圖3顯示,南極磷蝦蛋白酶解液清除羥基自由基的能力大于未經(jīng)酶解的南極磷蝦蛋白清除能力,且在酶解6h時酶解液清除羥基自由基的能力達到最大,為未酶解南極磷蝦蛋白的1.57倍,之后逐漸變小。因此經(jīng)6h酶解,可得到對羥基自由基有較強清除能力的南極磷蝦多肽。

圖3 酶解物的清除羥基自由基能力 Fig.3 The scavenging effects of zymolyte on hydroxyl free radical

以清除超氧陰離子自由基、DPPH自由基和羥基自由基為指標,在復合酶的最適酶解條件下,南極磷蝦蛋白經(jīng)1h或6h酶解,制得的多肽表現(xiàn)出的清除自由基的能力較強,但在確定的pH、溫度、酶量、底物的條件下,增加酶解時間,減少原料浪費,底物酶解的較充分,多肽的產(chǎn)率也增高,滿足實際生產(chǎn)的要求;蛋白酶解6h,多肽表現(xiàn)出最強的清除三種自由基的能力。對超氧陰離子自由基的清除率達到11.5%,對DPPH·的清除率達到72.7%,對羥基自由基的清除率達到84.8%。

2.2超濾分離

對分子量為10ku以上、5～10、3～5、0.5～3、0.5ku以下5部分的南極磷蝦多肽分別取相同體積8mL(濃度均為20mg/mL),進行抗氧化能力測定。

由圖4可以看出,超濾分離的樣品中,隨著分子量從大到小的變化,樣品的清除超氧陰離子自由基的能力、DPPH自由基的能力、羥基自由基的能力都是先增大后減小,在樣品濃度相同的情況下,超氧陰離子自由基清除率最低,羥基自由基清除率高于DPPH自由基清除率,但分子量在5～10ku部分的DPPH自由基清除率達到最高;分子量在5～10ku部分對DPPH自由基的清除能力、羥基自由基的清除能力、超氧陰離子清除能力都高于其他部分,對DPPH自由基的清除率達到95%,羥基自由基的清除率達到89%,超氧陰離子自由基的清除率達到53.5%。

圖4 不同分子量南極磷蝦多肽的抗氧化能力 Fig.4 The antioxidant ability of antarctic krillpolypeptide with different molecular weight

王立才[15]等人研究了小麥胚芽多肽,其抗氧化活性隨分子量的降低而升高,分子量在2ku以下肽段的生物活性較高。而南極磷蝦多肽分子量在5～10ku部分的抗氧化活性最高,取4mg測其對DPPH自由基的清除率,比李明杰[3]等人的研究結(jié)果高約28%。一般情況下,物質(zhì)的抗氧化能力與其供氫體有關,關于多肽的抗氧化活性可能與組氨酸有關[16]。

2.3tricine-SDS-PAGE電泳

圖5為取截留在5～10ku后南極磷蝦多肽tricine-SDS-PAGE電泳圖譜,結(jié)果出現(xiàn)了兩個條帶,分子量約為12250ku和4609ku,其未分布在膜的分子量范圍內(nèi),主要是不同廠家生產(chǎn)的標示相同的截留分子質(zhì)量的膜,對同一溶質(zhì)的截留率不一定相同,選擇膜不能只看分子質(zhì)量,還要根據(jù)實踐確定[17];另外,膜的壽命有限,而且在一定情況下隨著操作的選擇性不斷下降,其處理能力也不斷地、緩慢地下降。這被認為是膜分離方法的致命弱點[18]。要獲得高效的南極磷蝦抗氧化活性多肽,需對截留后樣品進一步分離純化。

圖5 5-10ku南極磷蝦多肽tricine-SDS-PAGE電泳結(jié)果 Fig.5 The tricine-SDS-PAGE electrophoresis results of antarctic krillpolypeptide of 5～10ku

3 結(jié)論

3.1選擇復合酶(中性蛋白酶∶胰蛋白酶=1∶1),在pH7.5,溫度45℃,料液比(m/v)為1∶2的條件下,酶解6h,得到具有較高抗氧化活性的南極磷蝦多肽。

3.2南極磷蝦蛋白酶解液的抗氧化能力大于未經(jīng)酶解的南極磷蝦蛋白的抗氧化能力,抗超氧陰離子清除率為1.71倍,DPPH自由基的清除率為3.17倍,羥基自由基的清除率為1.57倍。

3.3抗氧化的南極磷蝦多肽經(jīng)截流處理后,分子量在5～10ku部分表現(xiàn)出較強的抗氧化能力。對抗超氧陰離子的自由基的清除率達到53.5%,對DPPH自由基的清除率達到95%,對羥基自由基的清除率達到89%。

3.4由于超低分子量多肽,極易從凝膠上侵出,因此染色及脫色時間不宜太長,脫色后凝膠也不宜在水中浸泡保存過久,否則條帶會消失。

3.55～10ku部分的南極磷蝦多肽,對其進行tricine-SDS-PAGE電泳,結(jié)果出現(xiàn)兩個條帶。主要由分子量為12250ku和4609ku的多肽組成。

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