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(1.食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東農(nóng)業(yè)大學(xué),山東泰安 271018;2.山東省分析測試中心,山東省科學(xué)院,山東濟(jì)南 250014;3.貴州省理化測試分析研究中心,貴州省科學(xué)院,貴州貴陽 550002)

山銀花(LoniceraeConfusae)為忍冬科植物灰氈毛忍冬(LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.)、紅腺忍冬(LonicerahypoglaucaMiq.)、華南忍冬(LoniceraconfusaDC.)或黃褐毛忍冬(LonicerafulvotomentosaHsuet et S.C.Cheng)的干燥花蕾或初開的花,夏初花開放前采收、干燥[1]。山銀花具有清熱解毒和涼風(fēng)散熱的作用,是重要的飲品原料[2]。山銀花在醫(yī)藥、保健、食品等領(lǐng)域的消費(fèi)量逐年增加,市場供不應(yīng)求。通過近年來實驗研究,山銀花主要活性成分為黃酮類、有機(jī)酸、揮發(fā)油、皂苷類等多個種類化學(xué)成分[3],在褐變相關(guān)酶的作用下,干燥過程中極易發(fā)生褐變,其中不同的干燥加工工藝也可直接影響山銀花的外觀和質(zhì)量[4]。常用的干燥方法有陰干法、烘干法、微波干燥法等,通常以綠原酸、木犀草苷含量作為山銀花干燥加工方法的評價指標(biāo)[5-6]。

植物酶促褐變現(xiàn)象的產(chǎn)生主要是由于其所含的酚類化合物等在多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase,PPO)和過氧化物酶(Peroxidase,POD)的催化條件下進(jìn)行醌式化反應(yīng),再進(jìn)一步聚合生成黑色素造成的[7-8]。褐變相關(guān)酶廣泛分布于各種生物體中,它引起褐變,造成品質(zhì)降低,影響營養(yǎng)成分及利用價值。因此,干燥過程中的褐變,對產(chǎn)品外觀和活性成分的含量都有著重要影響。然而,目前針對不同干燥方法對山銀花褐變相關(guān)酶學(xué)活性及活性成分含量變化的影響尚未見報道。

本研究通過不同干燥方式處理后的山銀花酶活性及總黃酮、總酚、綠原酸、木犀草苷含量的測定,探討了干燥方式對山銀花酶活性和活性成分的影響,為選擇適宜的加工干燥方法,避免山銀花干燥過程中的褐變和活性成分損失,提高山銀花品質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山銀花 2013年6月份采自山東省臨沂市平邑縣,為灰氈毛忍冬(LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.),用不同方法進(jìn)行干燥,備用;綠原酸、木犀草苷 由山東省分析測試中心自制,純度大于99%;乙腈(色譜純) 購自美國TEDIA試劑公司;蘆丁、沒食子酸、愈創(chuàng)木酚 購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;L-dopa、TritonX-100 購自上海源葉生物有限公司;Tris、PVP 購自美國sigma公司;實驗用水 為娃哈哈純凈水。

Agilent 1120型高效液相色譜儀 美國Agilent公司;722E型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;GZX-9140數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實業(yè)有限公司;YZWZ-3型真空微波干燥儀 南京研正微波設(shè)備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 山銀花不同干燥方法 分別取10.00g鮮樣山銀花,通過不同干燥方法處理后,觀察外觀性狀及干燥后重量變化,實驗均重復(fù)三次。

1.2.1.1 陰干 將山銀花平鋪于紙上,放在室內(nèi)通風(fēng)處陰干76h,樣品恒重。

1.2.1.2 恒溫鼓風(fēng)干燥 將山銀花均勻放在電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中,35℃下鼓風(fēng)干燥處理24h,樣品恒重。

1.2.1.3 真空微波干燥 將山銀花均勻鋪在真空微波干燥箱中,設(shè)定微波功率3kW,70℃條件下干燥10min。

1.2.2 多酚氧化酶(PPO)活性測定 稱取不同干燥方法處理后樣品各1.00g,用10mL 20mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)冰浴研磨提取,其中包含3%(w/v)TritonX-100 和 1%(w/v)PVP。提取物在4℃條件下以10000×g離心10min,收集上清液作為粗酶液待測。酶學(xué)反應(yīng)以L-dopa為底物,反應(yīng)體系中包括2.95mL 5mmol/L L-dopa(20mmol/L Tris-HCl緩沖液配制)和0.05mL粗酶液。室溫下反應(yīng)20min后,紫外分光光度儀測定在475nm吸光度A的變化,以每分鐘變化0.01為1個酶活性單位。所有實驗均重復(fù)三次,結(jié)果取平均值[9]。

1.2.3 過氧化物酶(POD)活性測定 稱取不同干燥方法山銀花各1.00g,粗酶液提取方法同1.2.2,得粗酶液待測。酶學(xué)反應(yīng)以愈創(chuàng)木酚為底物,反應(yīng)體系中包括2.95mL 10mmol/L 愈創(chuàng)木酚及10mmol/L H2O2溶液(20mmol/L Tris-HCl緩沖液配制,pH 7.5)和0.03mL粗酶液。室溫下反應(yīng)20min后,紫外分光光度儀在470nm下比色,測定吸光度A值的變化,以每分鐘A470變化0.01為1個酶活性單位。所有實驗均重復(fù)三次,結(jié)果取平均值[10]。

1.2.4 總酚含量測定 精密稱取不同干燥方法處理后樣品各1.00g,加40mL 50%乙醇研磨提取后,置于50mL離心管中,超聲提取30min后,提取液在10000×g離心10min,過濾后定容250mL容量瓶中,取上清液作為待測液[11]。

測定方法:定量移取0.1mL上述提取液于5mL比色管中,加入500μL福林酚試劑,反應(yīng)3min后,加入3mL 6% Na2CO3溶液,用蒸餾水稀釋至5mL,搖勻、避光保存2h。以試劑為空白,在760nm測定吸光度值,所有實驗均重復(fù)三次,結(jié)果取平均值。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:精密稱取0.0100g沒食子酸,溶解定容于100mL的容量瓶中,得0.1mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.4、0.5mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于5mL的比色管中,使用上述測定方法測定沒食子酸標(biāo)樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 總黃酮含量測定[12]提取方法同1.2.4。

測定方法:移取0.25mL上述提取液于5mL比色管中,分別加入1.5mL 30%乙醇和0.15mL 5% NaNO2溶液,搖勻放置5min;然后加0.15mL 10% Al(NO3)3溶液,搖勻放置6min;后加入1mL 4% NaOH溶液,混勻,用30%乙醇稀釋至刻度。以試劑為空白,用1cm比色皿于510nm處測定吸光度值A(chǔ),依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出不同干燥方法中樣品黃酮含量。所有實驗均重復(fù)三次,結(jié)果取平均值。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:以蘆丁標(biāo)樣進(jìn)行總黃酮含量的測定,精確稱取0.0100g蘆丁標(biāo)樣,溶解定容于100mL的容量瓶,得0.1mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。按上述方法測定,移取標(biāo)準(zhǔn)樣品1.00、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50mL測蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 綠原酸與木犀草苷含量測定 提取方法同1.2.4,取上清液過0.45μm濾膜。采用HPLC檢測綠原酸和木犀草苷含量。色譜柱:Agilent TC C18(4.6mm×250mm,5μm);流動相:A為0.2%甲酸溶液,B為乙腈;柱溫:25℃;流速:1.0mL min-1;檢測波長:280nm;進(jìn)樣量:20μL;洗脫梯度為:0～10min,8%～10% B;10～20min,10%～15% B;20～30min,15%～15% B;30～40min,15%～25% B;40～50min,25%～30% B;50～55min,30%～100% B;55～65min,100% B。

綠原酸、木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:配制綠原酸、木犀草苷濃度分別為0.50mg/mL和0.24mg/mL的對照品混合溶液。進(jìn)樣量分別為2、4、6、8、10μL,按上述HPLC條件進(jìn)行分析。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 結(jié)果采用“SPSS 13.0”統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)相關(guān)性分析,Excel軟件繪圖制表。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同干燥方法對山銀花外觀性狀的影響

分別采用真空微波干燥、恒溫鼓風(fēng)干燥、陰干干燥方法干燥處理山銀花,樣品外觀性狀見表1。未干燥之前鮮樣外觀呈綠色,通過不同的干燥方法對其處理后外觀性狀顯現(xiàn)不同。真空微波干燥進(jìn)行速度快,干燥后呈綠色,干燥對其外觀性狀幾乎沒有影響;35℃鼓風(fēng)干燥對山銀花有一些影響,山銀花兩端有少許變?yōu)榛疑?但大部分仍保留其原綠色;陰干影響較大,山銀花外觀大部分偏灰色,少許綠色。采用三種干燥方法處理后,樣品干燥后重量(如表1)相差不大。從山銀花外觀性狀上看,真空微波干燥處理的效果最佳,其次為35℃鼓風(fēng)干燥,陰干最差。

表1 山銀花不同干燥方法的外觀性狀Table 1 External characters and dry weight of Lonicerae Confusae dried by different drying methods

2.2 不同干燥方法對山銀花相關(guān)酶活性的影響

多酚氧化酶(PPO)是一種氧化酶,在氧的參與下使酚類物質(zhì)氧化成醌,進(jìn)行一系列的脫水、聚合反應(yīng),最后形成黑褐色物質(zhì)[13-14],是造成植物褐變的最主要原因之一。不同干燥方法處理后的山銀花樣品,多酚氧化酶活性呈現(xiàn)較大差異,結(jié)果見圖1a。經(jīng)真空微波干燥處理后的樣品,高溫微波瞬間滅酶,使多酚氧化酶酶活性迅速降低,酶活力為14U,僅為未干燥處理鮮樣的30%左右;其次為恒溫鼓風(fēng)干燥樣品,多酚氧化酶酶活性為原未干燥樣品的57%,酶活力為26U;陰干處理山銀花,樣品多酚氧化酶變化不大,仍保留原樣酶活性的80%以上。

過氧化物酶(POD)在H2O2存在時能催化酚類、類黃酮的氧化和聚合,參與酚類物質(zhì)的代謝[15],可與PPO協(xié)同作用引起褐變,造成山銀花營養(yǎng)成分損失及品質(zhì)降低。不同干燥方法對山銀花中過氧化物酶剩余酶活性影響見圖1b。對過氧化物酶活性影響趨勢與多酚氧化酶基本一致,真空微波干燥后樣品過氧化物酶活性最低且僅為未干燥原樣的13%,酶活力為24.4U;鼓風(fēng)干燥后樣品剩余酶活力為108.5U,為原樣的51%左右;陰干處理過程中對酶活性影響較小,酶活力為198.3U。

由此可見,樣品真空微波干燥處理時,溫度迅速升高,蛋白質(zhì)變性,促使大部分PPO、POD被滅活,顯示低酶活性,鼓風(fēng)干燥和陰干干燥樣品由于溫度較低,失水速度較慢,PPO、POD仍保留較高酶活性。

圖1 山銀花不同干燥方法對酶活性影響 Fig.1 The changes of enzymes activities in Lonicerae Confusae dried by different drying methods

2.3 線性關(guān)系考察

通過實驗得沒食子酸標(biāo)樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線為:Y(mg/mL)=0.0624A+0.0007,其中A為吸光度值,R2=0.9995,線性范圍為:0.002～0.010mg/mL;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y(mg/mL)=1.14075A-0.01847,R2=0.9996,線性范圍為:0.02～0.09mg/mL;綠原酸含量(mg)線性回歸方程為:Y=1.55291×106X+90.13,R2=0.9994,線性范圍為:0.001～0.005mg;木犀草苷含量(mg)線性回歸方程為:Y=2.04998×106X+27.28108,R2=0.9993,線性范圍為:0.00048～0.0024mg。

2.4 不同干燥方法對山銀花活性成分的影響

經(jīng)不同方法干燥的山銀花,其主要成分基本一致,但其成分含量變化較大,活性成分含量如圖2(鮮樣各成分濃度為折合干基后含量)。在真空微波干燥后,山銀花提取液中總酚、總黃酮含量最高,分別為85.97±0.98、(230.83±1.20)mg/g;恒溫鼓風(fēng)干燥樣品,活性成分含量均較真空微波干燥后有所降低;而在自然陰干的條件下,活性成分含量依次為34.20±0.33、(65.93±2.41)mg/g,含量最低。

綠原酸等酚酸成分具有顯著的抗病毒、調(diào)節(jié)糖脂代謝等作用,木犀草苷等黃酮具有抗菌活性[16],為山銀花中重要的藥效成分。不同干燥方法處理后的山銀花,高效液相色譜圖測定其主要成分,結(jié)果如圖3。在真空微波干燥處理后,綠原酸峰面積最大,35℃恒溫鼓風(fēng)干燥峰面積有所降低,陰干處理后最小;木犀草苷峰面積于鼓風(fēng)干燥后最小。據(jù)此,真空微波干燥后,綠原酸含量最高,為(42.4±0.25)mg/g,陰干含量最低。綠原酸的分子結(jié)構(gòu)中具鄰位酚羥基是多酚的一種,易在多酚氧化酶和過氧化物酶的作用下氧化縮合成高分子有色物質(zhì),真空微波干燥中溫度瞬間升高,造成多酚氧化酶及過氧化物酶高溫失活,綠原酸損耗較少,含量最高。而陰干處理過程中,褐變相關(guān)酶活性最高,綠原酸酶解損耗較高,同時,由于干燥速度較慢,樣品長時間暴露于空氣中綠原酸被氧化,因此含量最低。木犀草苷含量與圖2b中總黃酮含量變化不盡相同,鼓風(fēng)干燥法的木犀草苷含量最低,為(0.13±0.0053)mg/g,僅為鮮樣的50%。

圖2 不同干燥方法處理后山銀花中活性成分含量 Fig.2 The dynamic changes of,total phenol,total flavonoids,chlorogenic acid and galuteolin in Lonicerae Confusae dried by different drying methods

圖3 不同干燥方法處理后山銀花高效液相色譜圖 Fig.3 HPLC chromatogram of Lonicerae Confusae dried by different drying methods

2.5 微波干燥后山銀花活性成分含量同相關(guān)酶活性的相關(guān)分析

將微波干燥方法處理后的山銀花活性成分含量同相關(guān)酶活性進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果見表2。結(jié)果顯示微波干燥處理后的山銀花樣品中總酚與PPO活性極顯著相關(guān),與POD活性顯著相關(guān)。綠原酸與PPO活性顯著相關(guān),同POD極顯著相關(guān)。PPO、POD活性與總黃酮、木犀草苷含量相關(guān)性不顯著。相關(guān)性分析結(jié)論與文獻(xiàn)記載[7-8]相一致,表明山銀花的褐變主要與其中酚類物質(zhì)相關(guān)。

表2 微波干燥樣品酶活性與活性成分含量相關(guān)系數(shù)Table 2 The correlation coefficients of enzyme activities and active component contents of Lonicerae Confusae dried by microwave drying methods

3 結(jié)論

不同干燥方法處理后的山銀花樣品中,真空微波干燥在短時間內(nèi)將褐變相關(guān)酶活性降到最低,防止山銀花與酚類物質(zhì)等發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生褐變,使山銀花外觀性狀仍呈綠色,活性成分依然保留在高含量。數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明,PPO活性與活性成分的相關(guān)性高于POD活性,說明在山銀花干燥過程中,PPO是酚類物質(zhì)氧化轉(zhuǎn)變?yōu)轷闹饕?。同時,真空微波干燥后樣品酶活性較低,更利于存儲過程中藥材色澤的保持和有效成分的保留。綜合考慮,真空微波干燥為山銀花最佳干燥方法。

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