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(四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院,四川成都 610065)

近年來,隨著人們生活水平不斷提高,糖尿病、高血壓、肥胖等已成為常見的高發(fā)病,嚴(yán)重危害了人類健康[1]。眾多研究表明,某些植物成分(如存在于多種果蔬中的多酚類化合物)可有效影響消化酶活性,據(jù)此有望建立糖尿病和肥胖等疾病新的預(yù)防和控制方法[2]。單寧酸又稱鞣酸,廣泛存在于茶葉及多種中草藥和果蔬食品中[3]。文獻(xiàn)表明,單寧酸具有抗炎、抗氧化、降血糖、調(diào)整脂代謝等多種功效[4],如Tikoo[5]發(fā)現(xiàn)單寧酸可改善糖尿病大鼠的一般狀況及腎功能,而沈忠明[4]證明虎杖單寧酸對小鼠具有明顯的降血糖作用。胰α-淀粉酶是一種糖類代謝酶,對動(dòng)物體內(nèi)淀粉和肝糖的降解起重要作用[6]。單寧酸可影響胰α-淀粉酶活性,但對于單寧酸與胰α-淀粉酶相互作用機(jī)制國內(nèi)外尚未見報(bào)道?；诖?本文首先研究了單寧酸對胰α-淀粉酶的抑制作用,并借助紫外和熒光光譜手段探討了作用機(jī)理,擬為單寧酸在相關(guān)功能性食品和藥品中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬胰α-淀粉酶(PPA,分子量50ku)、蘆丁、槲皮素 美國Sigma公司。單寧酸(TA)、沒食子酸、茶多酚 成都市長征化玻有限公司;其他試劑均為分析純。

2501PC紫外分光光度儀 日本島津公司;F-4000熒光光譜儀 日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單寧酸對PPA的抑制作用 采用改進(jìn)的分光光度法[7]研究了單寧酸對PPA的抑制作用。首先將2.5g可溶性淀粉溶于磷酸鹽緩沖液(pH6.9),煮沸,冷卻后定容至250mL,作為底物溶液備用。以磷酸鹽緩沖液配制不同濃度PPA溶液,避光冷藏。將0.5mL底物溶液于310K水浴1min后,依次加入0.25mL單寧酸溶液(單寧酸最終濃度為0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2mg/mL)、0.25mL酶溶液。310K下震蕩反應(yīng)5min后,加入1mL DNS顯色液[8],置于沸水浴中8min。取出,冷至室溫,加蒸餾水10mL稀釋,于540nm測定吸光值。實(shí)驗(yàn)中以空白液為參比,計(jì)算單寧酸對PPA的抑制率,并基于單寧酸濃度與抑制率的回歸方程計(jì)算其半抑制濃度IC50。實(shí)驗(yàn)中對比研究了蘆丁、茶多酚、槲皮素、沒食子酸(最終濃度2mg/mL)對PPA的抑制率。

抑制率(%)=[(T1-T2)/T1]×100

式(1)

式(1)中T1和T2分別代表無抑制劑和有抑制劑時(shí)的酶活。

研究中固定酶濃度(0.08mg/mL)和單寧酸濃度(0.05mg/mL),在不同底物濃度下(0.25%、0.5%、0.75%、1%)進(jìn)行酶活分析,方法同上[7],通過雙倒數(shù)作圖法判斷單寧酸對PPA的抑制類型。

1.2.2 單寧酸與PPA作用的紫外差譜分析 于3.0mL PPA溶液(0.5mg/mL)中,加入0.2mL單寧酸溶液,于室溫震蕩反應(yīng)一定時(shí)間后,在200～300nm范圍內(nèi)掃描,以相同濃度的PPA溶液作空白,記錄PPA溶液的紫外吸收差譜。實(shí)驗(yàn)中改變單寧酸濃度(0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8mg/mL)和作用時(shí)間(2、10、30min、1、2h),通過PPA紫外吸收差譜研究單寧酸與PPA的作用特性。

1.2.3 單寧酸與PPA作用的熒光光譜分析 取3.0mL濃度為0.5mg/mL的PPA溶液,將其與0.2mL單寧酸溶液于熒光比色皿中混勻(單寧酸最終濃度為0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8mg/mL),在不同溫度下(293、303、310K)靜置作用5min后測試。熒光激發(fā)波長278nm和295nm,熒光發(fā)射掃描范圍300～400nm。在上述實(shí)驗(yàn)條件下,以同步波長Δλ=15nm及Δλ=60nm分別進(jìn)行同步熒光掃描。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 每次測定均平行測定三次,采用Excel和SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,測定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(mean±SD)表示,顯著性臨界值α=0.05。采用Origin8.0軟件對采集的紫外和熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 單寧酸對胰α-淀粉酶的抑制特性

單寧酸對PPA的抑制如圖1A所示,隨著單寧酸濃度升高,其對PPA的抑制率逐漸增大,當(dāng)單寧酸濃度達(dá)2mg/mL時(shí),94.8%的PPA酶活受到抑制,基于數(shù)據(jù)擬合求解可知單寧酸對PPA的半抑制濃度IC50為0.87mg/mL。實(shí)驗(yàn)中將單寧酸與幾種典型植物多酚進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)在2mg/mL時(shí),蘆丁、茶多酚、槲皮素、沒食子酸對PPA的抑制率分別為40.2%、67.4%、41.5%和13.9%,單寧酸表現(xiàn)了相對更強(qiáng)的PPA抑制能力。

1.3.4 福山區(qū)政府政策優(yōu)勢。福山區(qū)政府確立了以特色櫻桃產(chǎn)業(yè)帶動(dòng)經(jīng)濟(jì)發(fā)展、以優(yōu)秀電商模式推動(dòng)特色櫻桃產(chǎn)業(yè)的雙驅(qū)動(dòng)模式，不斷提升櫻桃特色產(chǎn)業(yè)的水平，使大櫻桃的電商模式駛?cè)搿翱燔嚨馈?。?006年以來，在面對其他大櫻桃地區(qū)的快速發(fā)展時(shí)，福山政府推動(dòng)了櫻桃品牌的創(chuàng)立，大櫻桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展需要品牌意識(shí)，以實(shí)現(xiàn)利益與品牌價(jià)值的捆綁提升，在提高水果質(zhì)量的同時(shí)，也提升了品牌認(rèn)證的力度，不斷地鞏固福山區(qū)大櫻桃的優(yōu)勢地位[1]。

由Lineweaver-Burk圖可見,當(dāng)單寧酸存在時(shí),酶反應(yīng)米氏常數(shù)(Km)不變,但最大反應(yīng)速率(Vmax)減小(圖1B),單寧酸對PPA的作用表現(xiàn)為非競爭性抑制。說明單寧酸能與PPA活性中心外的必需基團(tuán)結(jié)合,與酶-底物結(jié)合互不影響,但酶-底物-抑制劑三元復(fù)合物不能進(jìn)一步分解為產(chǎn)物[9]。

2.2 單寧酸對胰α-淀粉酶紫外光譜的影響

單寧酸與胰α-淀粉酶(PPA)作用后,可使得酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度變化,如導(dǎo)致酶二級結(jié)構(gòu)改變,這種改變可通過PPA的紫外吸收差譜得以反映[10]。不同濃度單寧酸與PPA作用后,其紫外吸收變化如圖2A所示。可見,PPA在270nm附近的吸收變化隨單寧酸濃度增大而逐漸增大,并且發(fā)生紅移,當(dāng)單寧酸濃度增至0.4mg/mL時(shí),紅移近10nm。隨著單寧酸濃度進(jìn)一步增大(>0.8mg/mL),PPA吸收差譜無明顯變化(圖略),這可能源于單寧酸與PPA作用趨于穩(wěn)定,PPA空間結(jié)構(gòu)不再改變所致。實(shí)驗(yàn)中考察了不同作用時(shí)間后,單寧酸對PPA紫外吸收的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PPA的紫外差譜無本質(zhì)變化(圖2B),說明單寧酸與PPA結(jié)合迅速,短時(shí)間可達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)。

圖1 單寧酸對PPA的抑制特性 Fig.1 Inhibition characteristics of tannic acid on PPA

圖2 單寧酸作用后PPA紫外吸收差譜 Fig.2 The UV differential spectra of PPA in the presence of tannic acid at pH 6.9 and 310

2.3 單寧酸對胰α-淀粉酶熒光光譜的影響

蛋白質(zhì)分子中有多種氨基酸具有熒光特性,其所需激發(fā)波長不同。278nm可激發(fā)色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)殘基,而295nm只可激發(fā)Trp殘基[11]。由圖3可見,隨著單寧酸濃度增大,PPA的內(nèi)源熒光強(qiáng)度有規(guī)律降低。在不同激發(fā)波長下,PPA激發(fā)峰的峰位與峰形略有改變,但都隨單寧酸濃度增大發(fā)生了一定程度紅移。單寧酸與PPA結(jié)合后PPA肽鏈發(fā)生伸展,可能使得Trp和Tyr殘基暴露于極性環(huán)境中,從而導(dǎo)致最大熒光發(fā)射峰紅移[12]。

圖3 單寧酸對PPA熒光光譜的影響 Fig.3 Effect of tannic acid on fluorescence spectrum of PPA at pH 6.9 and 310K

2.4 胰α-淀粉酶的同步熒光光譜

同步熒光可以提供發(fā)色基團(tuán)微環(huán)境的變化信息,在同步熒光波長Δλ=15nm和Δλ=60nm所測得的光譜可分別反映酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)殘基的光譜特性[13],判斷其微環(huán)境的改變,進(jìn)而推斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。研究發(fā)現(xiàn),增加單寧酸濃度,酪氨酸殘基的最大發(fā)射波長沒有明顯移動(dòng)(圖4A),表明在單寧酸和PPA結(jié)合過程中Tyr殘基附近的微環(huán)境沒有明顯改變,而Trp殘基的最大發(fā)射波長發(fā)生了明顯的紅移(移動(dòng)了7nm,圖4B),說明單寧酸與PPA的結(jié)合使得Trp殘基附近微環(huán)境的極性增大、疏水性降低。

圖4 PPA的同步熒光光譜 Fig.4 Synchronous fluorescence spectra of TA-PPA system at pH 6.9 and 310K

2.5 單寧酸對胰α-淀粉酶的熒光猝滅特性

蛋白質(zhì)熒光猝滅通常分為靜態(tài)和動(dòng)態(tài)過程,動(dòng)態(tài)猝滅是因分子熱運(yùn)動(dòng)碰撞引起,其作用過程遵循Stern-Volmer方程[14]:F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]。式中F0和F分別為加入猝滅劑前后的熒光強(qiáng)度,Kq為猝滅常數(shù)(該值越大猝滅效應(yīng)越明顯),τ0為熒光分子的初始平均壽命(生物大分子約為10-8s),K是動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù),[Q]為猝滅劑濃度。

在單寧酸濃度小于0.12×10-3mol/L(0.2mg/mL)時(shí),F0/F與[Q]具有良好的線性關(guān)系。由Stern-Volmer方程可知在293、303、310K條件下單寧酸對PPA的猝滅常數(shù)Ksv分別為1.44×104L/mol(F0/F=14.4[Q]+0.9829,R2=0.9813)、1.38×104L/mol(F0/F=13.8[Q]+1.0221,R2=0.9886)和1.24×104L/mol(F0/F=12.4[Q]+0.9814,R2=0.9962),進(jìn)一步可求得猝滅常數(shù)Kq分別為1.44×1012、1.38×1012、1.24×1012L·mol-1·s-1。文獻(xiàn)[15]表明各類猝滅劑對生物大分子的最大動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)約2.0×1010L·mol-1·s-1,顯然本實(shí)驗(yàn)所得Kq遠(yuǎn)高于該值,這表明在低濃度時(shí),單寧酸對PPA的熒光猝滅不是因碰撞造成的,而是靜態(tài)猝滅,即單寧酸與PPL結(jié)合生成了不發(fā)射光子的配合物。動(dòng)態(tài)猝滅中,溫度升高將增加有效碰撞和加劇電子轉(zhuǎn)移過程,使得猝滅常數(shù)增大,但在靜態(tài)猝滅中,溫度升高將降低配合物的穩(wěn)定性,減小猝滅常數(shù)[16]。本實(shí)驗(yàn)中猝滅常數(shù)Kq隨著溫度的升高而降低,這也進(jìn)一步說明動(dòng)態(tài)碰撞不是單寧酸引起PPA熒光猝滅的主要原因。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著單寧酸濃度繼續(xù)增大,F0/F-[Q]曲線向上彎曲(圖5),這可能因?yàn)閱螌幩釋PA同時(shí)產(chǎn)生了靜態(tài)和動(dòng)態(tài)猝滅效應(yīng)[17]。

圖5 單寧酸對PPA的熒光猝滅Stern-Volmer曲線(λex=278nm) Fig.5 Stem-Volmer curves for the fluorescence quenching of PPA by tannic acid(λex=278nm)

2.6 單寧酸與胰α-淀粉酶作用力類型

ΔG=ΔH-TΔS=-RT lnK

式(2)

式(3)

式中,ΔG為吉布斯自由能,R是氣體常數(shù),K1和K2分別是溫度T1和T2下的結(jié)合常數(shù)。

表1 單寧酸與PPA結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)Table 1 Thermodynamic parameters of interaction between PPA and TA

計(jì)算發(fā)現(xiàn)在不同溫度下反應(yīng)的ΔH值相近,研究中取其均值作為后續(xù)計(jì)算的依據(jù)。單寧酸與PPA結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)ΔS>0,ΔG<0,表明二者的結(jié)合不但能發(fā)生,而且可以自發(fā)進(jìn)行,其主要結(jié)合力應(yīng)源于疏水作用[19]?？紤]到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性,小分子和酶蛋白之間往往同時(shí)存在幾種作用力?；诜肿咏Y(jié)構(gòu)分析,單寧酸為多羥基化合物,羥基與蛋白分子氨基酸殘基之間有可能形成氫鍵,因此推斷單寧酸與PPA之間還可能存在氫鍵作用力。

3 結(jié)論

單寧酸對胰α-淀粉酶(PPA)顯示了明顯的抑制作用,其抑制類型為非競爭性抑制。紫外光譜表明單寧酸可引起PPA構(gòu)象變化,使酶的吸收峰發(fā)生紅移。熒光光譜表明單寧酸與PPA之間能自發(fā)進(jìn)行反應(yīng),通過疏水作用形成單寧酸-PPA復(fù)合物,并引起PPA內(nèi)源熒光猝滅。同步熒光光譜顯示單寧酸與PPA的結(jié)合位點(diǎn)靠近其色氨酸殘基區(qū)域。對單寧酸-PPA作用特性的認(rèn)識(shí),可為單寧酸在相關(guān)功能性食品和藥品中的應(yīng)用提供參考。

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