侯永清 王 蕾 易 丹

(1.武漢輕工大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430023;2.武漢輕工大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料安全湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430023)

動(dòng)物的腸道不僅是所有營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的最終場所，也是機(jī)體防御體系的第一道屏障，維護(hù)動(dòng)物腸道健康對保障動(dòng)物生產(chǎn)至關(guān)重要［1］。腸道也是機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)的中心器官，在實(shí)際生產(chǎn)中，各種應(yīng)激因素會(huì)導(dǎo)致腸道功能紊亂［2］。腸黏膜受損可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌易位和通透性增加，從而引起炎癥和組織損傷［3］。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)是天然氨基酸L-半胱氨酸與還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)的前體物質(zhì)，因而在動(dòng)物機(jī)體抗氧化功能中發(fā)揮重要作用，乙?；蛊涓妆晃铡⒖寡趸愿€(wěn)定。NAC的生理功能和應(yīng)用效果在很大程度上與維持細(xì)胞內(nèi)的GSH水平有關(guān)。NAC被證實(shí)可以有效改善腸道屏障功能，其機(jī)理可能與清除細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平和抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)［4］。研究表明，NAC對腸缺血再灌注、炎癥性腸病、放化療等理化損傷、燒傷、感染、重癥急性胰腺炎等多種疾病相關(guān)腸屏障功能紊亂均具有較好的防治作用［5］。最近研究發(fā)現(xiàn)，仔豬飼糧中添加NAC(500 mg/kg)可以緩解脂多糖(LPS)應(yīng)激引起的腸黏膜損傷、乙酸刺激引起的結(jié)腸炎［6］及改善小腸吸收功能［7-8］。本文旨在就NAC對豬腸道功能的保護(hù)作用相關(guān)研究作一綜述。

1 N-乙酰半胱氨酸的理化特性

NAC為硫醇類化合物，是天然氨基酸L-半胱氨酸與GSH的前體物質(zhì)，分子式為C5H9NO3S，相對分子質(zhì)量為163.2，是一種含活性巰基化合物，其生物活性主要在于硫基，而乙?；蛊浠钚愿臃€(wěn)定。

NAC是小分子物質(zhì)，可口服、肌注、靜脈給藥，進(jìn)入機(jī)體后97%被小腸迅速吸收，并經(jīng)小腸和肝臟細(xì)胞代謝與蛋白質(zhì)肽鏈結(jié)合形成多種代謝產(chǎn)物。NAC在體內(nèi)脫去乙?；笮纬傻陌腚装彼?，半胱氨酸為GSH的前體，可通過血腦屏障和神經(jīng)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)化成細(xì)胞內(nèi)的GSH，具有較強(qiáng)的清除活性氧自由基能力［5］。

2 N-乙酰半胱氨酸對仔豬生長性能的影響

生長性能是家畜生產(chǎn)中的重要指標(biāo)，飼糧中添加NAC有利于提高動(dòng)物生長性能［7］。研究表明，飼糧中添加0.05%NAC可以提高LPS刺激仔豬的平均日增重［7，9］，說明 NAC 可以緩解 LPS刺激造成的仔豬生長性能的降低，這提示炎性應(yīng)激條件下添加NAC對改善仔豬生長性能具有重要意義［7］。當(dāng)前，關(guān)于NAC對豬生長性能影響的報(bào)道甚少。

3 N-乙酰半胱氨酸對仔豬腸道功能的保護(hù)作用

3.1 對仔豬腸黏膜形態(tài)的影響

小腸是消化道內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的主要部位，小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整對維持仔豬的消化吸收功能非常重要［10］。反映小腸黏膜形態(tài)最直觀的指標(biāo)是絨毛高度、隱窩深度、絨毛表面積。隱窩深度增加表明絨毛上皮成熟細(xì)胞減少，絨毛高度/隱窩深度比值常可說明小腸上皮細(xì)胞更新代謝程度［11］，比值下降表明黏膜細(xì)胞生長受阻，比值上升表明黏膜細(xì)胞生長良好［12］。NAC能在一定程度上促進(jìn)小腸黏膜的發(fā)育，緩解LPS應(yīng)激導(dǎo)致的腸絨毛萎縮和隱窩增深，保護(hù)小腸和結(jié)腸的形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整［6-7］。研究表明，飼糧中添加500 mg/kg的NAC可以顯著降低LPS刺激仔豬小腸隱窩深度，提高絨毛高度/隱窩深度的比值和絨毛表面積［6］。這表明NAC在一定程度上加速了小腸上皮細(xì)胞的更新代謝，緩解了LPS刺激導(dǎo)致的腸絨毛萎縮和隱窩增深［12］。研究表明，在斷奶仔豬飼糧中添加500 mg/kg的NAC可降低直腸灌注乙酸造成的仔豬結(jié)腸損傷，在該乙酸灌注結(jié)腸炎模型中，NAC可以增加杯狀細(xì)胞的數(shù)量和細(xì)胞密度，降低上皮淋巴細(xì)胞和淋巴細(xì)胞密度［6］。這些結(jié)果表明，添加NAC可以維持腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整，緩解LPS刺激造成的小腸黏膜的損傷及乙酸刺激造成的結(jié)腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷。

3.2 對仔豬腸道吸收功能和屏障功能的影響

小腸上皮細(xì)胞層構(gòu)成機(jī)體的最前沿防御屏障，具有抵御腸腔內(nèi)有害微生物和潛在致病菌侵入外周臟器的作用［11，13］。D-木糖在腸道中不被消化，經(jīng)吸收后又不被機(jī)體代謝，并最終經(jīng)腎臟排出，其吸收試驗(yàn)被認(rèn)為是反映腸道吸收機(jī)能的經(jīng)典方法。血液中D-木糖濃度間接反映出腸道結(jié)構(gòu)與功能的完整性。研究表明，飼糧中添加500 mg/kg的NAC顯著提高了LPS刺激仔豬血漿D-木糖含量，表明NAC能夠緩解LPS應(yīng)激引起的腸道吸收功能降低。NAC緩解LPS導(dǎo)致的吸收功能下降的作用機(jī)制可能是因?yàn)镹AC作為巰基供給劑，有助于腸道組織對氨基酸、蛋白質(zhì)和多肽類親水性化合物的吸收，以及改善腸道局部黏膜免疫和全身免疫功能，進(jìn)而增強(qiáng)對腸組織結(jié)構(gòu)和功能的保護(hù)作用［12，14］。

二胺氧化酶(DAO)主要存在于哺乳動(dòng)物腸黏膜上層絨毛細(xì)胞胞漿中，是一種具有高度活力的細(xì)胞內(nèi)酶［15］。血漿和腸黏膜DAO活性可作為反映腸黏膜上皮細(xì)胞成熟度及其構(gòu)成的腸道屏障結(jié)構(gòu)損傷與修復(fù)情況的標(biāo)志物，也可反映腸黏膜通透性［12，16］。當(dāng)腸黏膜細(xì)胞受損或脫落時(shí)，DAO 會(huì)釋放入腸細(xì)胞間隙淋巴管和血管，或隨壞死脫落的腸黏膜細(xì)胞進(jìn)入腸腔內(nèi)，導(dǎo)致血液和腸腔DAO活性增高，腸黏膜 DAO 活性降低［8，12，17］。研究表明，飼糧中添加NAC可以緩解LPS刺激仔豬血漿DAO活性的升高及小腸黏膜DAO活性的降低［12］。類似地，NAC能顯著降低大鼠血漿 DAO活性［18］;能有效改善腸黏膜通透性，防止腸道菌群失調(diào)及細(xì)菌移位［12，19］。這些結(jié)果表明，NAC 具有緩解LPS刺激造成腸黏膜通透性增加的作用。NAC的這種作用，可能是一方面NAC能直接抗氧化損傷，或通過促進(jìn)機(jī)體內(nèi)GSH合成來清除活性氧自由基，減輕腸道黏膜的氧化性損傷，另一方面抑制LPS誘導(dǎo)炎性因子產(chǎn)生，降低腸損傷，維持腸道完整性。

3.3 抗氧化作用

NAC可以緩解脂質(zhì)過氧化介導(dǎo)的損傷，提高小腸的抗氧化作用。NAC為硫醇類化合物，是L-半胱氨酸與GSH的前體［5］。作為小分子物質(zhì)，NAC易于進(jìn)入細(xì)胞，脫乙酰基后成為GSH合成的前體，促進(jìn)GSH的合成。研究表明，LPS刺激可以造成組織局部缺血和缺氧，產(chǎn)生大量自由基，從而導(dǎo)致仔豬腸黏膜受到氧化應(yīng)激損傷［15，20］。NAC可以顯著提高LPS刺激仔豬空腸超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性，降低丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子自由基(·O-2)含量及氧化型谷胱甘肽(GSSG)/GSH比值［7］。這些結(jié)果表明，飼糧中添加NAC可以緩解LPS刺激對仔豬腸道氧化應(yīng)激的不利影響［7］。SOD是體內(nèi)主要的自由基清除酶，能夠清除·O-2，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，而CAT主要是將SOD歧化自由基形成的H2O2轉(zhuǎn)化成H2O和O2。GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化H2O2分解的酶，能特異性催化GSH對H2O2的還原反應(yīng)，起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用［12］。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的一種重要分解產(chǎn)物，可以間接反映機(jī)體組織氧化損傷的程度［10］。而自由基主要有·O-2、羥自由基、H2O2等，這些自由基是機(jī)體氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的有害化合物，具有強(qiáng)氧化性，它們的含量高低反映了組織自由基的積累程度［21］。GSSG是 GSH的氧化形式，在氧化劑作用下GSH通過GSH-Px氧化成GSSG，而GSSG通過還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)供氫，在谷胱甘肽還原酶的作用下又還原成GSH，二者構(gòu)成一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，使GSSG維持在總GSH量的1% ～10%水平，構(gòu)成有效的抗氧化系統(tǒng)，故可用來評估脂質(zhì)過氧化損傷情況［22］。NAC能降低自由基等有害產(chǎn)物的積累，調(diào)節(jié)氧化與還原產(chǎn)物的比率，抑制LPS的對腸黏膜的損害。其作用可能是因?yàn)镹AC為細(xì)胞內(nèi)提供—SH來源，而活性—SH具有較強(qiáng)還原能力，對體內(nèi)自由基具有明顯的拮抗作用;另外，NAC能將細(xì)胞外的胱氨酸還原為半胱氨酸，并可在腸黏膜細(xì)胞中轉(zhuǎn)化成GSH，進(jìn)而通過GSH發(fā)揮抗氧化作用，清除體內(nèi)的自由基［12］。研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加GSH可顯著降低小腸黏膜MDA含量，改善仔豬腸道的脂質(zhì)過氧化損傷［23］;在培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中加入NAC后，GSH/GSSG比值顯著升高［24］。飼糧添加NAC可增強(qiáng)仔豬機(jī)體抗氧化能力，進(jìn)而緩解LPS刺激導(dǎo)致的生長抑制［9］。

3.4 抗炎作用

NAC可在一定程度上可緩解LPS刺激導(dǎo)致的仔豬炎癥和免疫應(yīng)激反應(yīng)，能有效緩解LPS刺激對小腸黏膜的應(yīng)激損傷。飼糧中添加500 mg/kg NAC可以緩解LPS刺激導(dǎo)致的豬血漿、空腸和回腸中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、前列腺素E2(PGE2)及十二指腸TNF-α含量的顯著升高，有緩解十二指腸IL-6含量升高的趨勢，可以緩解LPS刺激導(dǎo)致的小腸核因子 -κB(NF-κB)和熱休克蛋白70(HSP70)蛋白水平的顯著升高［7］。這些結(jié)果說明NAC可在一定程度上緩解LPS刺激導(dǎo)致的仔豬炎癥反應(yīng)。另外，飼糧中添加500 mg/kg NAC可降低血漿中皮質(zhì)醇(COR)水平，說明NAC可緩解LPS刺激引起的免疫應(yīng)激。因此，飼糧中添加NAC可緩解LPS刺激導(dǎo)致的血漿及小腸黏膜中炎性因子的升高，NAC可能通過NF-κB信號通路影響炎性因子的表達(dá)，緩解免疫應(yīng)激。最新研究表明，NAC可以顯著降低LPS刺激仔豬空腸和回腸Toll樣受體4(TLR4)mRNA 表達(dá)［7］。TLR4是 TLRs家族中與免疫和炎癥密切相關(guān)的重要成員，是介導(dǎo)LPS應(yīng)答的主要受體，主要識別LPS介導(dǎo)炎癥信號通路［25］。TLR 可通過下游信號分子激活 NF-κB，而活化的NF-κB可以促進(jìn)炎癥相關(guān)基因(如TNF-α、IL-1β和IL-6)的過量表達(dá)，從而導(dǎo)致組織的損傷［25］。其可能作用機(jī)理是:1)NAC在體內(nèi)脫乙酰基生成的半胱氨酸可促進(jìn)GSH的合成，提高組織內(nèi)GSH含量。GSH可抑制IκB磷酸化，促進(jìn)IκB/NF-κB三聚體的穩(wěn)定性，阻止 NF-κB的p65亞基向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，從而抑制 NF-κB活化和核移位［26-27］。NF-κB 活性受抑制后，其調(diào)控轉(zhuǎn)錄的炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6產(chǎn)生、釋放也相應(yīng)地減少，最終趨向平衡，腸黏膜免疫應(yīng)激得到緩解［26］。2)NAC通過調(diào)控TLR4基因表達(dá)來調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)腸道的作用［7］。

3.5 對腸道能量代謝狀況的影響

LPS刺激可阻礙小腸黏膜線粒體正常的能量代謝，降低小腸黏膜能量供應(yīng)和儲備［28］。研究表明，飼糧中添加NAC可緩解LPS刺激導(dǎo)致的小腸三磷酸腺苷(ATP)、腺苷酸池(TAN)和能荷(EC)水平的降低，以及一磷酸腺苷(AMP)水平和AMP/ATP比值的升高［26］。ATP是各種生命活動(dòng)所需能量的直接來源，2分子二磷酸腺苷(ADP)轉(zhuǎn)化成1分子ATP和AMP(2ADP?ATP+AMP)，這個(gè)反應(yīng)始終保持動(dòng)態(tài)平衡，構(gòu)成ATP循環(huán)［29］。TAN是ATP、ADP和AMP之和。EC反映高能磷酸鍵在ATP、ADP、AMP之間的相互轉(zhuǎn)換，細(xì)胞能量產(chǎn)生不足或消耗增加時(shí)，均會(huì)影響EC水平［10］。另外，飼糧中添加500 mg/kg NAC可緩解LPS刺激引起的空腸磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(pAMPK)/腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)比值的升高［26］。AMPK能感知細(xì)胞能量代謝狀態(tài)的改變，維持機(jī)體的能量代謝平衡，被稱為“能量開關(guān)”，在動(dòng)物應(yīng)激(生理、營養(yǎng)、環(huán)境和疾病等)過程中起著重要作用［10］。在一般生理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)AMP含量極低，AMPK處于靜息狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)(如LPS刺激)，細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP比值升高，啟動(dòng) AMPK 激酶系統(tǒng)，AMPK 被激活［26，30］。研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激顯著提高了仔豬小腸AMP/ATP比值，AMPK磷酸化程度增加［31］。飼糧中添加NAC可以:1)提高ATP;2)降低AMP/ATP比值;3)提高EC;4)抑制LPS刺激仔豬小腸黏膜AMPK磷酸化的提高［26］。這表明飼糧中添加NAC可以提高仔豬小腸黏膜腺苷酸水平，增加腸黏膜能量儲備，緩解LPS刺激導(dǎo)致的能量過度損耗?？赡艿臋C(jī)制是:LPS通過AMP/ATP激活A(yù)MPK，添加NAC后可以抑制這一途徑，從而緩解LPS應(yīng)激對仔豬腸黏膜造成的能量代謝障礙，有利于腸黏膜屏障保護(hù)［26］。

3.6 抗細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞生長

NAC有抗細(xì)胞凋亡作用，能促進(jìn)細(xì)胞生長［32］。研究表明，飼糧中添加500 mg/kg的NAC可以緩解LPS刺激引起的空腸DNA含量、RNA/DNA和蛋白質(zhì)/DNA比值的降低［7］。另外，NAC可以緩解乙酸刺激仔豬結(jié)腸蛋白質(zhì)/DNA比值［6］。DNA 含量、RNA/DNA 和蛋白質(zhì)/DNA 比值可以反映腸黏膜細(xì)胞生長發(fā)育的狀況［7，33］。DNA含量反映細(xì)胞數(shù)量，代表著生成新柱狀上皮細(xì)胞的有絲分裂速率［12，33］;RNA/DNA 比值反映組織活性和單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄效率;蛋白質(zhì)/DNA比值反映細(xì)胞蛋白質(zhì)合成效率［7，33］。這些結(jié)果表明，NAC可以促進(jìn)腸黏膜細(xì)胞的生長，緩解LPS或乙酸灌注導(dǎo)致的腸黏膜受損，利于腸道屏障功能的恢復(fù)。

NAC的這種作用可能是通過調(diào)節(jié)caspase-3表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡。caspase-3作為細(xì)胞凋亡信號，其蛋白質(zhì)的表達(dá)高低可以反映機(jī)體在遭受應(yīng)激損傷時(shí)的細(xì)胞凋亡程度［12］。研究表明，LPS刺激或乙酸灌注結(jié)腸可以通過提高小腸［8］或結(jié)腸［6］caspase-3蛋白表達(dá)。飼糧中添加NAC可以顯著降低LPS刺激仔豬小腸caspase-3蛋白表達(dá)［8］及乙酸灌注結(jié)腸caspase-3蛋白表達(dá)［6］。

另外有研究發(fā)現(xiàn)，NAC能顯著提高仔豬血液中表皮生長因子(EGF)水平，緩解LPS刺激造成的生長抑制［9］。研究發(fā)現(xiàn)，NAC可以顯著提高LPS刺激仔豬血液中EGF含量及小腸黏膜中EGF受體(EGFR)mRNA 的表達(dá)［7］。類似地，NAC 可以顯著提高乙酸刺激仔豬結(jié)腸黏膜中EGF mRNA的表達(dá)［6］。EGF和EGFR有促進(jìn)仔豬腸道發(fā)育、修復(fù)炎癥性腸炎導(dǎo)致的仔豬受損腸道的作用［7］。EGF可以促進(jìn)腸道黏膜上皮細(xì)胞的增殖和分化，減輕多種原因?qū)ξ改c道形態(tài)的損害，對維持胃腸道結(jié)構(gòu)和功能的完整性起到重要作用［7，34-35］。EGFR信號通路對腸道具有十分重要的作用［7，36-37］，包括促進(jìn)細(xì)胞增殖、修復(fù)、穩(wěn)定腸道內(nèi)環(huán)境等。飼糧中添加500 mg/kg的NAC可以提高仔豬EGF和EGFR，這與NAC能對抗腸黏膜細(xì)胞凋亡(抑制LPS刺激仔豬腸道caspase-3蛋白表達(dá))，緩解LPS刺激導(dǎo)致的不利影響的觀點(diǎn)一致。我們推測，飼糧中添加NAC能對抗腸黏膜細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖和生長修復(fù)，緩解腸道損傷，可能是通過調(diào)節(jié)EGFR信號通路來實(shí)現(xiàn)的。

3.7 調(diào)控緊密連接蛋白的表達(dá)

NAC可以調(diào)控仔豬腸道緊密連接蛋白的表達(dá)。正常機(jī)體的上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞間存在著緊密連接成分，對維持細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能非常重要［12］。參與緊密連接的蛋白主要有閉鎖(occludin)蛋白、claudin蛋白以及黏附分子(JAM)等［38］。occludin和claudin-1是構(gòu)成緊密連接的主要跨膜蛋白［38］，可以封閉細(xì)胞間隙，保持上皮、內(nèi)皮細(xì)胞的連續(xù)性和完整性，對于維持緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能具有重要作用。緊密連接蛋白的表達(dá)量高低，可以直接反映緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能的完整性，間接反映腸道屏障功能的狀況。研究表明，飼糧中添加NAC可以顯著提高LPS刺激仔豬小腸claudin-1和occludin相對表達(dá)量［7］及乙酸刺激仔豬結(jié)腸 claudin-1相對表達(dá)量［6］。這說明NAC可能是通過調(diào)節(jié)claudin-1或occludin蛋白表達(dá)促進(jìn)了緊密連接，抑制了LPS或乙酸刺激導(dǎo)致的腸黏膜細(xì)胞通透性的增加，增強(qiáng)抗炎作用，改善了腸道屏障功能［8］。

4 小結(jié)

飼糧中添加NAC可以緩解LPS刺激造成的仔豬生長性能的降低;可以維持腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整，緩解LPS刺激造成的小腸黏膜的損傷及乙酸刺激造成的結(jié)腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷，改善豬腸道吸收功能和屏障功能。因此，NAC對豬腸道功能具有保護(hù)作用，其可能的機(jī)制是通過1)降低氧化應(yīng)激(提高抗氧化物酶的活性，降低氧化相關(guān)產(chǎn)物的含量，抑制HSP70的高度表達(dá));2)抗炎作用(降低炎性相關(guān)指標(biāo)含量，抑制NF-κB p65蛋白和TLR4 mRNA表達(dá));3)改善腸黏膜能量代謝狀況(提高 ATP和 EC、降低 AMP/ATP及磷酸化AMPK蛋白表達(dá));4)抗細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞生長(降低caspase-3蛋白表達(dá)，提高EGF含量和EGFR mRNA表達(dá));5)調(diào)節(jié)緊密連接蛋白表達(dá)(提高claudin-1和occludin蛋白表達(dá))。這些研究結(jié)果不僅為克服普遍發(fā)生的仔豬腸道功能紊亂提供重要思路，也為炎性條件下改善嬰兒營養(yǎng)與健康提供重要參考。

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