張曉琳 汪 洋 李愛科

(國家糧食局科學(xué)研究院，北京 100037)

真菌毒素(mycotoxins)是某些真菌在污染谷物或者食品的生長繁殖過程中，產(chǎn)生的具有毒害作用的次級代謝產(chǎn)物，由其引起的中毒癥狀被稱作是真菌毒素中毒癥狀(mycotoxicoses)。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)真菌毒素的種類達400多種，其化學(xué)、生物學(xué)和毒理學(xué)性質(zhì)多種多樣，主要的毒性作用包括致癌作用、遺傳毒性、致畸作用、肝細胞毒性、中毒性腎損害、生殖紊亂和免疫抑制。真菌毒素的存在不僅給人類及牲畜的健康帶來極大的危害，也造成了相應(yīng)的經(jīng)濟損失。據(jù)聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO)統(tǒng)計，全球每年約有25%的農(nóng)作物被真菌毒素污染，約2%的農(nóng)作物因污染嚴重而失去營養(yǎng)和經(jīng)濟價值，造成數(shù)千億美元的經(jīng)濟損失［1］。另外，2003年末至2004年秋，由于養(yǎng)豬行業(yè)大量使用發(fā)霉玉米，動物出現(xiàn)多種并發(fā)傳染病，養(yǎng)殖場出現(xiàn)難以控制的局面。據(jù)調(diào)查，僅河南省死亡豬只就達1 000萬頭。如果以平均每頭100元計算，經(jīng)濟損失達10億元;如果再考慮飼料轉(zhuǎn)化率低下、動物藥品消耗增加，則2004年中國范圍僅養(yǎng)豬業(yè)損失就在100億元以上［2］。因此，如何解決真菌毒素對糧食和飼料的污染，對改善動物生產(chǎn)性能和提高人類食品安全有非常重要的意義。目前，毒素污染飼料的脫毒方法主要包括物理、化學(xué)和生物脫毒法。雖然物理、化學(xué)脫毒法取得了一定程度上的成功，但存在操作困難、降低飼料的營養(yǎng)品質(zhì)和適口性等缺點［3-4］。與物理、化學(xué)脫毒法相比，生物脫毒法具有作用條件溫和，對原料的感官性狀、適口性等影響極小，增加原料營養(yǎng)價值等優(yōu)點，被認為是最佳脫毒方法。隨著物理、化學(xué)脫毒手段弊端的不斷出現(xiàn)和人們對迅猛發(fā)展的生物技術(shù)優(yōu)點的認識增加，國內(nèi)外利用微生物進行毒素脫毒的研究正在逐步展開，而且相關(guān)研究成果表現(xiàn)出了良好的開發(fā)和應(yīng)用前景。生物脫毒作用除了包括微生物通過酶促反應(yīng)將毒素轉(zhuǎn)化成低毒或者無毒產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化作用之外，還包括將毒素黏附在其細胞壁上形成復(fù)合物而達到去除毒素目的的吸附作用，后者通常不改變毒素分子本身的結(jié)構(gòu)，不是本文闡述的重點。本文針對飼料中常見的真菌毒素，對近年來國內(nèi)外真菌毒素生物脫毒的研究進展進行概述。

1 真菌毒素的生物脫毒

1.1 黃曲霉毒素(aflatoxin，AFT)

AFT是一類由多種寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)和黃曲霉(Aspergillus flavus)產(chǎn)生的二呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌铮?］，現(xiàn)已分離出 B1、B2、G1、G2、B2a、G2a、M1、M2、P1 等 18 種之多，其中以黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)的毒性和致癌性最強。AFB1廣泛存在于玉米、高粱、花生粉、豆粕、棉籽粕等飼料原料中，其危害包括降低動物產(chǎn)乳量及產(chǎn)蛋量，導(dǎo)致動物免疫力低下以及致癌、致畸和致突變。對AFT生物降解的研究較早，已發(fā)現(xiàn)多種真菌和細菌都具有降解AFT的能力。真菌中的樹狀指孢霉(Dactylium dendroide)［6］、少根根霉(Rhizopus arrhizus)［7］、寄生曲霉［8］、莖點霉(Phoma sp.)［9］、白腐菌(Trametes versicolor)［10］、黑曲霉(Aspergillus niger)［11］、假蜜環(huán)菌(Armillariella tabescens)［12］及食用真菌糙皮側(cè)耳(Pleurotus ostreatus)［13］都具有生物降解 AFT的作用。雖然這些真菌能夠降解AFT，但是降解過程緩慢并且不徹底［6-13］，這在一定程度上限制了其在飼料行業(yè)中的應(yīng)用。在20世紀(jì)末，國內(nèi)研究者劉大嶺等［12］首先發(fā)現(xiàn)假蜜環(huán)菌E-2的粗酶液可使樣品中的AFB1含量減少80%;隨后，該真菌產(chǎn)生的AFB1降解酶得以分離純化［14］，其編碼基因也得以成功克隆和表達［15］。另外，對該脫毒酶的固定化技術(shù)和酶特性研究表明，此脫毒酶的理想反應(yīng)條件是中性pH，高水分的體外反應(yīng)體系，比較適合在植物油、醬油、啤酒以及牛奶等液體反應(yīng)體系中進行，難以在籽實、餅粕等低水分飼料原料中直接應(yīng)用［16-17］。

細菌降解AFT的報道并不太多，Lillehoj等［18］首先發(fā)現(xiàn)橙色黃桿菌(Flavobacterium aurantiacum)具有去除溶液中AFT的能力。后來，Smiley等［19］研究發(fā)現(xiàn)橙色黃桿菌能產(chǎn)生一種脫毒酶，該脫毒酶通過酶促作用使AFT達到降解。Hormisch等［20］從煤田附近污染的土壤樣品中分離到1株能夠同時降解熒蒽和AFB1的分支桿菌(Mycobacterium fluoranthenivorans)。Teniola 等［21］也從多環(huán)芳烴化合物污染的土壤中分離得到紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)DSM 14303和分支桿菌DSM 44556T，它們分泌的胞外酶都具有較高的降解AFB1的能力。Alberts等［22］通過薄層色譜-高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜-液相質(zhì)譜技術(shù)，對紅串紅球菌降解AFB1的機理進行了進一步研究，結(jié)果表明該菌對AFT的消減是由于其產(chǎn)生的酶的生物降解作用。另外，李俊霞等［23］以香豆素為唯一碳源和能源進行初篩，以AFB1為唯一碳源和能源進行復(fù)篩，獲得1株嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonas sp.)，該菌株對 100 μg/kg的AFB1的72 h的降解率達到85.7%。

1.2 赭曲霉毒素(ochratoxin，OT)

OT是由曲霉屬(Aspergillus)和青霉屬(Penicillium)中的某些菌株產(chǎn)生的具有毒害作用的次級代謝產(chǎn)物。OT是污染谷物食品與飼料的重要真菌毒素，共有A、B、C和α4種衍生物，其中毒性最大、與人類健康關(guān)系最密切、產(chǎn)毒量最高、對農(nóng)作物的污染最重、分布最廣的是赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)。OTA能對腎臟和肝臟產(chǎn)生損傷作用，具有致畸性、致癌性和免疫毒性等多種毒性，對動物和人體健康有很大的潛在危害。OTA由異香豆素通過酰胺鍵與β-苯丙氨酸相連形成。OTA分子結(jié)構(gòu)中的苯丙氨酸基團是其毒力基團［24］，其生物降解通常是將OTA水解為低毒的赭曲霉毒素 α(ochratoxinα，OTα)和 β-苯丙氨酸［25］。在細菌降解OTA方面，研究顯示動物的胃腸道微生物通常能有效地降解OTA，特別是在反芻動物中［26-27］。Madhyastha 等［28］研究發(fā)現(xiàn)，非反芻動物腸道內(nèi)的微生物也能影響OTA的生物降解率，OTA的降解率可能與盲腸和大腸中微生物的多少有關(guān)。Hwang等［29］對37種細菌進行篩選后發(fā)現(xiàn)，醋酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)能在乙醇無機鹽培養(yǎng)基中將OTA降解為OTα。Fuchs等［30］篩選到 1 株嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)VM20可以降解OTA，并且通過人類肝腫瘤細胞微核試驗對該菌株的脫毒效果進行了生物學(xué)驗證。Petchkongkaew等［31］從泰國發(fā)酵大豆產(chǎn)品中分離到的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)CM21對 OTA的降解率達到92.5%，其中的降解產(chǎn)物之一是OTα，其降解機制可能是該菌株產(chǎn)生的羧肽酶(carboxypeptidases)的酶促分解作用。短桿菌屬(Brevibacterium)細菌同樣具有降解OTA的能力，降解產(chǎn)物為OTα和L-β- 苯基丙氨酸［32］。Shi等［33］從新鮮的麋鹿糞便中分離到的1株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CW14，該菌株不僅能夠抑制 OTA產(chǎn)生菌——曲霉菌的生長，還具有高效降解OTA的能力。B?hm等［34］報道，乳酸桿菌(Lactobacillus)、芽孢桿菌(Bacillus)、酵母菌(Saccharomyces)都具有一定的OTA降解能力，但降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、毒性以及這些微生物在毒素污染飼料中的實際應(yīng)用效果都有待進一步研究。某些真菌如煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)TJM8A8和小孢根霉(Rhizopus microsporus)NRRL2710都具有降解OTA的能力［35-36］。除了霉菌之外，Péteri等［37］發(fā)現(xiàn)紅發(fā)夫酵母(Phaffia rhodozyma)CBS 5905不僅能吸附OTA，還能通過羧肽酶將OTA降解為低毒的OTα。

1.3 玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)

ZEN ，又稱F2毒素，是一種具強烈致畸作用的生殖系統(tǒng)毒素。ZEN能導(dǎo)致家畜生長速度下降、免疫抑制、繁殖障礙等。近年來，對ZEN生物降解的研究取得了一定進展。據(jù)報道，粉紅螺旋聚孢霉(Clonostachys rosea)IFO 7063可以通過分泌堿性水解酶——泛解酸內(nèi)酯水解酶，將ZEN轉(zhuǎn)化成無雌激素性質(zhì)的產(chǎn)物，水解酶編碼基因zhd101也已經(jīng)被成功克隆和表達［38-39］。Molnar等［40］從白蟻的后腸中分離出了1種新酵母菌——解毒毛孢酵母(Trichosporon mycotoxinivorans)，它可以成功地將1 mg/L的ZEN降解成無毒的非雌激素類化合物。Altalhi等［41-42］研究發(fā)現(xiàn)惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)ZEA-1具有降解ZEN的能力，編碼此ZEN降解酶的基因在大腸桿菌中也獲得了表達。另外，一些根霉菌，如匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、米根霉(Rhizopus oryzae)、小孢根霉(Rhizopus microsporus)，也具有降解ZEN的能力［36］。國內(nèi)近幾年在ZEN降解菌株篩選和基因克隆方面也取得了一些研究進展。程波財?shù)龋?3］通過富集分離的方法獲得了1株藤黃微球菌(Micrococcus luteus)，該菌株能將2μg/mL的ZEN幾乎完全降解;該課題組研究人員又從粉紅螺旋聚孢霉中克隆到與zhd101高度同源的基因ZEN-jjm，并在大腸桿菌中成功表達［44］。劉海燕等［45］從粉紅螺旋聚孢霉31535菌株中克隆了與zhd101有11個堿基差異的基因zlhy-6，并在畢赤酵母中成功表達。Yu等［46］從土壤中分離了 1株不動桿菌(Acinetobacter sp.)SM04，該菌株能在以 ZEN為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基中快速生長，并能將ZEN降解成無毒的非雌激素類化合物，進一步研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵上清液中的過氧化物酶具有降解ZEN的功能，其編碼基因也得以成功克隆和表達［47］。

1.4 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)

DON，化學(xué)名稱為 3α，7α，15- 三羥基 -12，13-環(huán)氧單端孢霉-9-烯-8-酮，因能引發(fā)母豬拒食和嘔吐又得名嘔吐毒素(vomitoxin)，它廣泛存在于小麥、大麥、玉米等谷物類糧食和飼料中，家畜食用DON污染的飼料會引起拒食、嘔吐、生長延遲、生殖紊亂等癥狀;而人類誤食DON污染的糧食會引起免疫抑制、貧血、頭痛、嘔吐、厭食和腹痛等癥狀［48-51］。對DON生物脫毒的研究始于20世紀(jì)80年代，迄今為止，國內(nèi)外已經(jīng)報道的DON生物脫毒方式主要包括C3羥基的乙?；?、糖苷化、氧化、異構(gòu)化，C16的羥基化，C12/C13環(huán)氧基團的去環(huán)氧化。在DON的化學(xué)結(jié)構(gòu)中，12，13-環(huán)氧基團是主要的毒力基團，去掉這個基團可以大大地降低其毒性，腸道微生物菌群可以通過酶促降解環(huán)氧基團從而對DON起到減毒作用。Fuchs等［52］從牛瘤胃的富集培養(yǎng)物中分離到真桿菌(Eubacterium)BBSH 797，該菌可以在24～48 h內(nèi)轉(zhuǎn)化DON和其他的單端孢霉烯族毒素，從而部分地降低飼料中毒素的毒力，后來，百奧明公司基于此脫毒機理成功開發(fā)了微生物飼料脫毒制劑真桿菌BBSH 797，表明了其良好的應(yīng)用價值，但由于該脫毒方式需要嚴格的厭氧條件，一定程度上限制了其應(yīng)用。Shima等［54］從土壤中分離到1株屬于土壤桿菌-根瘤菌屬(Agrobacterium-Rhizobium)的細菌E3-39，它能夠在培養(yǎng)l d后把90%的DON轉(zhuǎn)化為3-酮基-DON，從而使DON在免疫抑制方面的毒性大大降低。Ikunaga等［54］在土壤中篩選到1株諾卡氏屬菌株，該菌株能在好氧條件下利用DON為唯一碳源和能源生長，其降解毒素濃度范圍為10～1 000μg/mL。He等［55］通過高濃度的DON作為選擇性壓力，從南京郊外土壤中分離得到1株可以水解DON的塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)，該菌株與 DON共培養(yǎng)14 d后，可清除 94.4% 的 DON。徐劍宏等［56］從土壤、麥穗中分離獲得了1株德沃斯氏菌(Devosia sp.)DDS-1，該菌株對液體培養(yǎng)基中DON的降解率達95%以上，其代謝產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)及其毒性未知。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)德沃斯氏菌DDS-1可以先將DON乙?；癁?-乙?；?DON，然后再將3-乙?；?DON氧化為3-羰基-DON，接下來再進一步降解;對3-乙?；?DON氧化酶的酶學(xué)特性研究表明，德沃斯氏菌DDS-1產(chǎn)生的3-乙?；?DON氧化酶具有較好的溫度和酸堿穩(wěn)定性，該酶反應(yīng)需要金屬離子作為輔因子［57］。

1.5 伏馬毒素(fumonisin，F(xiàn)B)

FB主要是由串珠鐮刀菌(Fusarium moniliforme)、層出鐮刀菌(F.proliferatum)、輪枝鐮刀菌(F.verticillioides)等有害真菌感染玉米及其他農(nóng)作物產(chǎn)生的一類結(jié)構(gòu)相似的真菌毒素。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)24種FB，其中有明顯毒性且含量較高的是伏馬毒素B1(fumonisin B1，F(xiàn)B1)、伏馬毒素B2(fumonisin B2，F(xiàn)B2)和伏馬毒素 B3(fumonisin B3，F(xiàn)B3)，而FB1則是危害性最大和研究最廣的FB［58］。FB作為動物飼料中常見的真菌毒素之一，對各種動物的影響不一，它能引起馬腦白質(zhì)軟化癥(equine leukoencephalomalacia，ELEM)、豬肺水腫等疾病，給多種動物肝臟、腎臟造成損傷，甚至引起腫瘤發(fā)生，且人食管癌和神經(jīng)管型缺陷病也可能與FB有關(guān)，對畜禽和人類的健康造成很大的危害。最近，國際癌癥研究機構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)已將它列入可能致癌物的黑名單內(nèi)。目前，許多先進國家為了保護國民健康及畜牧業(yè)不受其害，已開始著手制定農(nóng)產(chǎn)品及其食用原料等有關(guān)于FB的限量標(biāo)準(zhǔn)，并管制已受此毒素污染的食品不得流入消費市場。關(guān)于FB的生物降解研究報道并不多見，其原因可能是由于該毒素發(fā)現(xiàn)時間較晚，對其危害性認識不夠且未引起足夠重視。據(jù)報道，斯平尼弗外瓶柄霉(Exophiala spinifera)可以以FB1為唯一碳源生長，進一步研究表明該菌株產(chǎn)生的可溶性酯酶、胺氧化酶和其他酶可作用于FB進行一系列的酶促反應(yīng)，從而達到降解毒素的目的［59-60］。

2 真菌毒素生物脫毒研究中存在的問題

生物脫毒作為真菌毒素脫毒研究領(lǐng)域的熱點，已經(jīng)有諸多研究成果見諸報端，但這些研究成果大都停留在基礎(chǔ)研究階段，離規(guī)?；茝V應(yīng)用仍有一定的距離。從基礎(chǔ)和應(yīng)用方面綜合考慮，生物脫毒的研究仍然存在以下幾個關(guān)鍵問題有待深入研究與探索。

2.1 降解菌株方面

其一，有些毒素降解菌株的毒素降解能力不太理想，存在著降解不徹底、活性容易消失等問題。上文提及的從土壤中分離到的細菌Agrobacterium-Rhizobium E3-39，能將DON氧化為中間產(chǎn)物3-酮基-DON后將之同化［53］，但從該篇文章報道至今近20年的時間內(nèi)，未見任何后續(xù)報道，猜測其活性已經(jīng)喪失。其二，降解菌株本身缺乏毒性評估，其結(jié)果會最終決定降解菌種本身是否具有實質(zhì)性的應(yīng)用價值。其三，對真菌毒素生物解毒的研究主要側(cè)重于對降解單一毒素菌株的篩選，在自然條件下，真菌毒素的產(chǎn)生通常具有共發(fā)性，即2種或多種毒素共同存在，而這些毒素被動物誤食之后，其毒性作用具有協(xié)同性，會對動物的健康產(chǎn)生更大的危害。目前，真菌毒素生物降解的研究多側(cè)重于對單一毒素降解菌株的篩選，而對于具有多種毒素降解能力菌株的篩選研究則相對較少，需進一步加大研究力度。其四，篩選過程中，真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品通常是作為唯一碳源加入到培養(yǎng)基當(dāng)中，而標(biāo)準(zhǔn)品價格不菲，這無疑增加了不少的研究成本。有研究人員在AFB1降解菌株初步篩選的研究中，以AFB1結(jié)構(gòu)類似物——香豆素來替代價格昂貴的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品［23］，不但經(jīng)濟可行，還減少了研究人員與黃曲霉毒素的接觸，安全性高，這種研究方法希望能給同行帶來一些啟發(fā)。

2.2 降解機理方面

其一，真菌毒素作為化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的小分子物質(zhì)，它的生物降解過程通常需要多種酶共同作用，經(jīng)過多個生化反應(yīng)完成，在此過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物是否真正的低毒或者無毒?這些代謝產(chǎn)物被動物食用的時候，會不會被動物自身或其消化系統(tǒng)內(nèi)的微生物重新代謝生成有毒有害的物質(zhì)?這些方面都需要生物脫毒科研工作者給予充分的重視，并加強這方面的研究。其二，真菌毒素生物脫毒的一般性研究主要是側(cè)重于降解菌株的篩選和菌株的降解能力，但是對于降解酶的分離、純化，降解酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、序列及降解酶基因克隆等作為生物脫毒開發(fā)應(yīng)用的重要理論基礎(chǔ)研究則很薄弱，仍需深入系統(tǒng)化研究。

3 小結(jié)

真菌毒素作為一類無法完全避免的劇毒性天然污染物，由于其存在的廣泛性、毒害性，如何有效控制真菌毒素污染一直是糧食和飼料行業(yè)懸而未決的難題。真菌毒素的生物脫毒作為一種安全、高效、環(huán)保的方法備受研究者的關(guān)注。雖然現(xiàn)在國內(nèi)外利用生物脫毒以降解飼料中真菌毒素的應(yīng)用少之又少，但現(xiàn)有的研究成果均表現(xiàn)出了良好的開發(fā)和應(yīng)用前景，相信在不久的將來，越來越多的真菌毒素降解菌株和降解酶會被人們發(fā)現(xiàn)，各種未知的毒素降解機制也將逐漸為人類所了解和掌握，更多的真菌毒素微生物脫毒劑或脫毒酶制劑產(chǎn)品被成功應(yīng)用于糧食和飼料行業(yè)，從而提高糧食利用率，保證畜牧業(yè)的安全生產(chǎn)，提高畜牧業(yè)經(jīng)濟效益。

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