黃希文施定基賈曉會田琪琳賈睿何培民

（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.中國科學(xué)院植物研究所，北京 100093）

海水小球藻磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（Chpepc2）克隆和生物信息學(xué)分析

黃希文1施定基2賈曉會1田琪琳1賈睿1何培民1

（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.中國科學(xué)院植物研究所，北京 100093）

為了進(jìn)一步了解藻類PEPC酶的特征，對海水小球藻pepc2基因進(jìn)行了克隆并通過生物信息學(xué)方法分析了海水小球藻PEPCase2的結(jié)構(gòu)和功能特征。結(jié)果表明，海水小球藻pepc2基因與萊茵衣藻pepc2基因相似度為90%，且其對應(yīng)的氨基酸序列的特征與萊茵衣藻PEPCase2特征相同，可見該基因編碼的是海水小球藻細(xì)菌型PEPC酶。海水小球藻PEPCase2二級結(jié)構(gòu)主要包括α螺旋、β轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲和伸展鏈，其三級結(jié)構(gòu)外部為α螺旋結(jié)構(gòu)，中心為平行β桶結(jié)構(gòu)。海水小球藻PEPCase2具有多種重要的生理功能，主要與多種重要的物質(zhì)合成有關(guān)。

海水小球藻 PEPC酶 生物信息學(xué) 結(jié)構(gòu) 功能

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC；EC 4.1.1.31）是植物生理代謝過程中的一個(gè)重要的酶，它廣泛存在于高等植物、藻類和細(xì)菌中，但在動物、真菌和酵母中尚未發(fā)現(xiàn)［1-3］。PEPC酶在Mg2+和HCO3-存在的情況下催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）不可逆的β-羧化生成草酰乙酸（OAA）和無機(jī)磷酸（Pi）［4，5］。PEPC酶在C4和CAM光合碳代謝過程中起著重要的作用，其催化植物從大氣固定CO2的反應(yīng)［6］。在C3植物和非光合生物中PEPC酶參與多種重要的生理過程。非光合型PEPC酶主要參與四碳酸的回補(bǔ)代謝途徑［7］。此外，PEPC酶還參與NADPH代謝、C-N的交互反應(yīng)、CO2的重吸收、蘋果酸發(fā)酵和pH調(diào)節(jié)等眾多重要的生理過程［8］。

由此可見，研究PEPC酶的結(jié)構(gòu)和功能對了解

植物多種生理過程是十分重要的。之前關(guān)于PEPC酶的研究主要是針對其酶學(xué)特征的研究，而關(guān)于PEPC酶結(jié)構(gòu)特征的研究較少。關(guān)于PEPC酶功能在C4和CAM植物中已研究的較為清楚，但其在微藻中的功能則研究的較少，僅見于萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）和小型月牙藻（Selenastrum minutum）［9-11］。為了更好地研究藻類PEPC酶的結(jié)構(gòu)和功能的特征，本研究克隆海水小球藻pepc2基因（Chpepc2）cDNA全長序列并通過各種生物信息學(xué)軟件對海水小球藻PEPCase2（ChPEPCase2）進(jìn)行分析，獲得海水小球藻PEPCase2結(jié)構(gòu)和功能的相關(guān)信息，旨在為微藻PEPC酶結(jié)構(gòu)和功能的研究提供一定的信息。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)使用的海水小球藻（Chlorella sp.）由上海海洋大學(xué)藻類培養(yǎng)室提供，該藻株采集自黃海海區(qū)，經(jīng)分離純化保存至今。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)條件 海水小球藻接種培養(yǎng)于f/2液體培養(yǎng)基（pH7.5），培養(yǎng)條件為：溫度22℃，光照強(qiáng)度70 μmol/（m2·s-1），持續(xù)光照，135 r/min振蕩培養(yǎng)8-10 d［12］。

1.2.2 海水小球藻總RNA提取和cDNA逆轉(zhuǎn)錄合成 離心收集對數(shù)生長期（OD750≈1.2）海水小球藻細(xì)胞，加入Trizol試劑抽提海水小球藻總RNA，再采用乙醇沉淀法分離得到海水小球藻總RNA。以海水小球藻總RNA為模板，Oligo（dT）為引物在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下通過RT-PCR反應(yīng)合成海水小球藻cDNA［13］。

1.2.3 海水小球藻pepc2基因（Chpepc2）cDNA全序列獲得 根據(jù)NCBI公布的萊茵衣藻pepc2基因cDNA序列（AY517643.1）設(shè)計(jì)引物P1（5'-TTTTGGAGCCGTGAGGGAC-3'）和P2（5'-CTCGGAGTACCCAGACAAC-3'）。再以海水小球藻cDNA為模板，P1和P2為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR擴(kuò)增海水小球藻pepc2基因cDNA序列。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 45 s，60℃ 30 s，72℃ 4 min，循環(huán)35次；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測確認(rèn)后連接到克隆載體pMD18-T上，構(gòu)建重組克隆載體pMD18-TChpepc2，送至上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.4 海水小球藻pepc2基因cDNA生物信息學(xué)分析1.2.4.1 pepc基因序列檢索（獲取信息學(xué)分析材料） 利用NCBI數(shù)據(jù)庫搜索pepc基因，得到以下物種的13種pepc基因序列（表1）：大腸桿菌（Escherichia coli）、魚腥藻（Coccomyxa subellipsoidea）、萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）、微胞藻（Micromonas sp.）、牛角蠣球藻（Ostreococcus tauri）、海鏈藻（Thalassiosira pseudonana）、三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）、膠球藻（Coccomyxa subellipsoidea）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）。

1.2.4.2 開放閱讀框分析 利用ORF finder（http：// www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析Chpepc2基因的開放閱讀框。

1.2.4.3 同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 利用BioEdit軟件的optimal GLOBAL功能對各種PEPC酶的mRNA和氨基酸序列進(jìn)行同源性兩兩比對。利用MEGA4.0軟件構(gòu)建PEPC酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4.4 保守區(qū)域和催化活性分析 利用BioEdit軟件和PROSITE軟件（http：//prosite.expasy.org/）分析PEPC酶氨基酸序列的保守區(qū)域和催化活性位點(diǎn)。

1.2.4.5 二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)分析 利用SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.

pl?page=npsa_ sopma.html）分析ChPEPCase2的二級結(jié)構(gòu)。利用SWISS-MODEL軟件（http：//swissmodel. expasy.org/）通過同源建模的方法構(gòu)建ChPEPCase2的三級結(jié)構(gòu)模型并用SWISS-Pdbviewer軟件分析ChPEPCase2。

1.2.4.6 理化性質(zhì)分析 ProtParam軟件（http：//web. expasy.org/protparam/）在線分析ChPEPCase2的理化性質(zhì)。利用FoldIndex（http：//bip.weizmann.ac.il/ fldbin/findex）分析ChPEPCase2的可折疊區(qū)域。利用Pfam（http：//pfam.sanger.ac.uk/）分析ChPEPCase2的功能結(jié)構(gòu)域。通過ProtScale軟件（http：//web. expasy.org/protscale/）在線分析ChPEPCase2的親水性。

1.2.4.7 亞細(xì)胞定位與功能分析 利用SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析ChPEPCase2的跨膜結(jié)構(gòu)。利用PSORT Prediction（http：// psort.hgc.jp/form.html）分析ChPEPCase2的亞細(xì)胞定位。利用ProtFun（http：//www.cbs.dtu.dk/services/Prot Fun/）分析ChPEPCase2的功能。

2 結(jié)果

2.1 海水小球藻pepc2基因（Chpepc2）cDNA全序列克隆與測序

Chpepc2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1，經(jīng)測序該基因片段大小為4 427 bp。該序列與萊茵衣藻pepc2基因cDNA全序列比對，相似度為90%，表明該序列即為Chpepc2 cDNA序列。

圖1 Chpepc2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 海水小球藻pepc2基因cDNA生物信息學(xué)分析

2.2.1 開放閱讀框分析 利用ORF finder分析Chpepc2的開放閱讀框，結(jié)果（圖2）顯示，共得到6種可能的結(jié)果，再根據(jù)KOZAK規(guī)則分析，得知該基因序列含有長度為3 159 bp的開放閱讀框，編碼1 052個(gè)氨基酸殘基的肽鏈。并與測序所得Chpepc2的 cDNA序列比較分析，得出ChPEPC2ase的氨基酸序列。

圖2 Chpepc2開放閱讀框

2.2.2 同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 通過NCBI搜索得到13種PEPC酶cDNA序列和氨基酸序列，并將這些序列與ChPEPCase2 cDNA序列和氨基酸序列進(jìn)行同源性兩兩對比。結(jié)果（表2）表明，不同PEPC酶之間同源性較低，cDNA序列和氨基酸序列同源性分別為32.48%-71.14%和7.89%-46.13%，其中ChPEPC2與CrPEPC2的cDNA同源性最高為71.14%，TpPEPC2和PtPEPC2的氨基酸同源性最高為46.13%。

根據(jù)14種pepc基因序列構(gòu)建Neighbor-Joining模式系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果（圖3）顯示，ChPEPC2與CrPEPC2、AtPEPC4親緣關(guān)系較近聚為一支；AtPEPC1、CrPEPC1、MsPEPC、OtPEPC和CsPEPC1關(guān)系較近聚為一支。該結(jié)果與根據(jù)氨基酸序列C端結(jié)構(gòu)對PEPC酶進(jìn)行分類的結(jié)果一致，進(jìn)一步說明ChPEPC2為海水小球藻細(xì)菌型PEPC酶。

2.2.3 保守區(qū)域和催化活性分析 利用BioEdit軟件分析PEPC酶氨基酸序列的保守區(qū)。結(jié)果（圖4）顯示，PEPC酶共有5個(gè)保守區(qū)域：VLTAHPTQALRP（序列Ⅰ）（OAA結(jié)合位點(diǎn)）、RVVPLFETLNDL（序列Ⅱ）、GYSDSGKDAGRLAAAWALY（序列Ⅲ）（HCO3-結(jié)合位點(diǎn)）、FHGRGGTVGRGGGP（序列Ⅳ）（PEP結(jié)合位點(diǎn)）和LRAIPWIFAWTQTRLILP（序列Ⅴ）。此外、PEPC酶C末端還存在一個(gè)QNTG/RNTG序列，可將PEPC酶劃分為C端為QNTG的植物型PEPC酶（PTPC）和細(xì)菌型PEPC酶（BTPC），其中

ChPEPCase2的C端為RNTG序列，可見ChPEPCase2應(yīng)為海水小球藻細(xì)菌型PEPC酶。

表2 14種PEPC酶cDNA序列和氨基酸序列同源性兩兩分析（%）

圖3 14種pepc基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

利用PROSITE軟件分析PEPC酶催化活性位點(diǎn)（表3）顯示，14個(gè)PEPC酶均具有H（組氨酸）和K（賴氨酸）兩個(gè)催化活性位點(diǎn)，分別位于PEPC酶的保守區(qū)域Ⅰ和保守序列Ⅲ。

2.2.4 二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)模型 圖5為ChPEPCase2的二級結(jié)構(gòu)，包括α螺旋、β轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲和伸展鏈。其中α螺旋占49.05%、β轉(zhuǎn)角占7.41%、無規(guī)則卷曲占34.79%、伸展鏈占8.75%。圖6為ChPEPCase2的三級結(jié)構(gòu)，內(nèi)部存在一個(gè)典型的平行β桶結(jié)構(gòu)，其外部為大量的α螺旋結(jié)構(gòu)。圖7為ChPEPCase2結(jié)構(gòu)模型的Ramachandran點(diǎn)圖，圖中96%的點(diǎn)位于立體化學(xué)可行的構(gòu)象區(qū)域內(nèi)（藍(lán)線以內(nèi)），可見該模型為可靠的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)模型。

表3 14種PEPC酶催化活性位點(diǎn)分析

2.2.5 理化性質(zhì)分析 利用ProtParam分析ChPEPCase2的理化性質(zhì)，利用FoldIndex分析ChPEPCase2的可折疊區(qū)域（表4）；利用ProtScale分析ChPEPCase2的親水性（圖8）。結(jié)果顯示，ChPEPCase2氨基酸殘基數(shù)為1 052個(gè)，分子量大小為115.1693 kD；等電點(diǎn)為9.64；不穩(wěn)定系數(shù)為61.75，為典型的不穩(wěn)定蛋白；其氨基酸的疏水系數(shù)大多小于0，總平均疏水指數(shù)為-0.4，可見其為親水性蛋白；ChPEPCase2未折疊區(qū)域指數(shù)為0.096，可見其大部分為可折疊

區(qū)域。

圖4 14種PEPC酶氨基酸序列比對分析

圖5 海水小球藻PEPC2的二級結(jié)構(gòu)分析

圖6 海水小球藻PEPC2三級結(jié)構(gòu)模型

圖7 海水小球藻PEPC2 Ramachandran點(diǎn)圖

2.2.6 亞細(xì)胞定位與功能分析 利用SignalP分析ChPEPCase2的跨膜結(jié)構(gòu)（圖9）；利用PSORT Prediction分析PEPC酶的亞細(xì)胞定位（表5）。結(jié)果表明，ChPEPCase2跨膜結(jié)構(gòu)各項(xiàng)評分均顯著小于0.5，可見其不含有跨膜結(jié)構(gòu)域，所以其應(yīng)分布于基質(zhì)中；亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，ChPEPCase2最有可能位于細(xì)胞核、線粒體基質(zhì)、微體和線粒體內(nèi)膜中，與其他PEPC酶的分布大致相同，多位于線粒體相關(guān)結(jié)構(gòu)中。此外，PEPC酶還分布于細(xì)胞質(zhì)、微體、葉綠體等多種結(jié)構(gòu)中。

表4 海水小球藻PEPC2的理化性質(zhì)

圖8 海水小球藻PEPCase2的疏水性分析

圖9 海水小球藻PEPCase2的跨膜結(jié)構(gòu)分析

利用Pfam分析ChPEPCase2的功能結(jié)構(gòu)域，結(jié)果（表6）表明ChPEPCase2與其他細(xì)菌型PEPC酶顯著結(jié)構(gòu)域相同，為PEPCase功能結(jié)構(gòu)域。此外ChPEPCase2還有一非顯著性結(jié)構(gòu)域，為HNF-1_N（肝細(xì)胞核因子1 N端結(jié)構(gòu)域）；利用ProtFun分析ChPEPCase2的功能，結(jié)果（表7）顯示ChPEPCase2與其他細(xì)菌型PEPC酶類似，主要涉及與細(xì)胞的中心代謝、氨基酸合成、脂肪酸代謝等，最有可能酶類型為連接酶。

表5 14種PEPC酶亞細(xì)胞定位分析

表6 3種細(xì)菌型PEPC酶功能結(jié)構(gòu)域分析

3 討論

3.1 海水小球藻pepc2基因的克隆與結(jié)構(gòu)特征分析作為本研究重要基礎(chǔ)的Chpepc2基因其序列尚未公布，在NCBI中僅能查找到萊茵衣藻、微胞藻等8種真核藻的11種pepc基因序列［14-19］。這給試圖通過PCR擴(kuò)增Chpepc2基因帶來了困難，這也是本研究過程中的難點(diǎn)之一。為了實(shí)現(xiàn)對Chpepc2基因克隆，本研究選擇與海水小球藻親緣關(guān)系較近的萊茵衣藻的pepc2基因序列來設(shè)計(jì)引物，再以海水小球藻cDNA為模板PCR擴(kuò)增Chpepc2基因，最后將PCR擴(kuò)增所得片段與萊茵衣藻pepc2基因序列進(jìn)行比對，其相似率達(dá)到90%，因此初步認(rèn)為該序列為Chpepc2基因cDNA序列。隨后將該基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與NCBI上搜索得到的13種PEPC酶的氨基

酸序列進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，ChPEPCase2肽鏈的N端缺乏絲氨酸可逆磷酸化位點(diǎn)且C端為RNTG結(jié)構(gòu)。根據(jù)之前的研究可知植物型PEPC酶（PTPC）的N端存在一個(gè)絲氨酸可逆磷酸化位點(diǎn)，且C端為QNTG結(jié)構(gòu)；而細(xì)菌型PEPC酶（BTPC）的N端缺乏絲氨酸可逆磷酸化位點(diǎn)，且C端為RNTG結(jié)構(gòu)［20-22］，由此可知ChPEPCase2為細(xì)菌型PEPC酶。根據(jù)PEPC酶氨基酸序列的對比可見，不同PEPC酶之間相似率較低，但各種PEPC酶中均存在5個(gè)保守性較高的區(qū)域，這些保守區(qū)域均與PEPC酶的催化功能有著重要的關(guān)系。進(jìn)一步對ChPEPCase2的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，可知ChPEPCase2二級結(jié)構(gòu)包括α螺旋、β轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲和伸展鏈，與其他PEPC酶的二級結(jié)構(gòu)基本相同，但ChPEPCase2要比植物型PEPC酶多出一段大小約為10 kD的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，這段無規(guī)則卷曲在PEPC酶兩個(gè)球形亞基的相互作用中起著重要的作用［19］。通過對ChPEPCase2的三級結(jié)構(gòu)模型分析發(fā)現(xiàn)ChPEPCase2為類球形結(jié)構(gòu)，其中心為一平行β桶結(jié)構(gòu)，在該平行β桶的C端為酶的催化活性中心，Mg2+、HCO3-和PEP的結(jié)合位點(diǎn)均位于此處；在平行β桶外圍為大量的α螺旋和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)保證了PEPC酶反應(yīng)中心環(huán)境的穩(wěn)定性和酶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。這一預(yù)測結(jié)果與通過X射線衍射技術(shù)測定的大腸桿菌和玉米的PEPC酶的三級結(jié)構(gòu)基本一致［23-26］。關(guān)于海水小球藻PEPC酶的四級結(jié)構(gòu)，目前尚無實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)予以證明，但前人的研究表明PEPC酶的四級結(jié)構(gòu)可分為兩種類型：Class-1 PEPC（PTPC同源四聚體）［6］和Class-2 PEPC（PTPC和BTPC異源八聚體）［27］。與Class-1 PEPC酶相比，Class-2 PEPC酶的熱穩(wěn)定性更高，pH的耐受范圍更廣，催化活性更高且不易受別構(gòu)效應(yīng)抑制［28］。

表7 3種細(xì)菌型PEPC酶功能預(yù)測

3.2 海水小球藻PEPC2的功能分析

通過對ChPEPCase2的理化性質(zhì)分析可知，ChPEPCase2為典型的親水性蛋白且不存在跨膜結(jié)構(gòu)；結(jié)合PEPC酶亞細(xì)胞定位分析可知，PEPC酶為典型的胞質(zhì)酶，分布于細(xì)胞的各種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中，可見PEPC具有多種生理功能，參與了一系列重要的生理過程。通過對ChPEPCase2的功能結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，其存在3個(gè)PEPCase功能結(jié)構(gòu)域，與其他PEPC酶的顯著性功能結(jié)構(gòu)域相同。通過對ChPEPCase2的功能進(jìn)行預(yù)測可知，其主要功能與其他PEPC酶的功能類似，主要與多種中心代謝產(chǎn)物的合成相關(guān)，涉及氨基酸的生物合成、脂肪酸合成以及碳代謝中間產(chǎn)物合成等［29］。

4 結(jié)論

海水小球藻pepc2基因編碼的海水小球藻PEPCase2為典型的細(xì)菌型PEPC酶。該酶共包含5個(gè)氨基酸保守序列，2個(gè)催化活性位點(diǎn)；二級結(jié)構(gòu)主要由α螺旋、β轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲和伸展鏈組成；三級結(jié)構(gòu)中心為平行β桶結(jié)構(gòu)，外部為α螺旋結(jié)構(gòu)。該酶不具備跨膜結(jié)構(gòu)域，為親水性蛋白，分布于多種亞細(xì)胞，具有多種生理功能，參與一系列重要的

物質(zhì)合成代謝。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Cloning and Bioinformatics Analysis of the Phosphoenolpyruvate Carboxylase（Chpepc2）Gene from Marine Chlorella sp.

Huang Xiwen1Shi Dingji2Jia Xiaohui1Tian Qilin1Jia Rui1He Peimin1
（1. College of Aquaculture and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306；2. Institute of Botany，the Chinese Academy of Sciences，Beijing 100093）

To further understand the characteristics of algae PEPCase, marine Chlorella sp. pepc2 gene was cloned and analyzed the structural and functional characteristics of marine Chlorella sp. PEPCase2 by bioinformatics method. The experimental results showed that, the cDNA sequence of marine Chlorella sp. pepc2 gene, compared with the cDNA sequence of Chlamydomonas reinhardtii pepc2 gene, the similarity was 90%, and its amino acid sequence has the same characteristics with C. reinhardtii PEPCase2, so this gene encodes the bacterialtype PEPCase of marine Chlorella sp.；The secondary structures of marine Chlorella sp. PEPCase2 mainly include α-helix, β-turn, random coli and extended strand, and its tertiary structure is a parallel β-barrel structure in the centre with α-helix structures outside；marine Chlorella sp. PEPCase2 has many important physiological functions, mainly related to a variety of important material synthesis.

Marine Chlorella sp. Phosphoenolpyruvate carboxylase Bioinformatics Structure Function

2014-04-04

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（“863計(jì)劃”2009AA064401），上海海洋大學(xué)一級學(xué)科建設(shè)（0707）

黃希文，男，碩士研究生，研究方向：微藻基因工程；E-mail：hu0710092@126.com

何培民，男，博士，教授，研究方向：海洋生物學(xué)，分子生物學(xué)；E-mail：pmhe@shou.edu.cn