程成 林鵬

（集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門 361021）

日本囊對(duì)蝦Cathepsin B基因在不同卵巢發(fā)育時(shí)期的表達(dá)

程成 林鵬

（集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門 361021）

采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，以18S rRNA為內(nèi)標(biāo)基因，檢測(cè)日本囊對(duì)蝦Cathepsin B基因在mRNA水平不同卵巢發(fā)育時(shí)期的表達(dá)。結(jié)果顯示，Cathepsin B在卵黃合成前期表達(dá)最高，內(nèi)源性卵黃合成期和外源性卵黃合成期表達(dá)水平基本一致，而在成熟期表達(dá)水平急劇下降。其中卵黃合成前期與其它3期相比具有顯著性差異（P＜0.05），內(nèi)源性卵黃合成期和外源性卵黃合成期Cathepsin B不具有顯著性差異（P＞0.05），而成熟期與前邊三期相比具有顯著性差異（P＜0.05）。推測(cè)Cathepsin B可能在日本囊對(duì)蝦卵巢發(fā)育中發(fā)揮了作用。

日本囊對(duì)蝦 卵巢發(fā)育 組織蛋白酶B 實(shí)時(shí)定量PCR 基因表達(dá)

日本囊對(duì)蝦（Marsupenaeus japonicus）是我國(guó)東南沿海各省重要的捕撈和養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)類品種［1］，雌性個(gè)體發(fā)育速度比雄性快，在個(gè)體上也存在明顯優(yōu)勢(shì)，性別與生殖制約著它們的產(chǎn)值［2］，若能培育出雌性對(duì)蝦并進(jìn)行單性化養(yǎng)殖可大幅度提高養(yǎng)殖產(chǎn)量，創(chuàng)造更大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，對(duì)蝦性別控制一直是水產(chǎn)遺傳育種研究的熱點(diǎn)，但是相對(duì)于鳥(niǎo)類、哺乳類等高級(jí)動(dòng)物，甲殼動(dòng)物生殖發(fā)育研究比較困難，因?yàn)槠錄](méi)有明顯性染色體［3，4］。了解卵巢發(fā)育的分子機(jī)制是性別控制的基礎(chǔ)，而首要的步驟是確認(rèn)在卵巢中與卵巢發(fā)育相關(guān)的基因［5］。

我們前期研究中發(fā)現(xiàn)，組織蛋白酶B基因（Cathepsin B）在日本囊對(duì)蝦卵巢中特異表達(dá)，而據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道Cathepsin B蛋白在昆蟲(chóng)、魚(yú)類、鳥(niǎo)類等卵生動(dòng)物卵細(xì)胞發(fā)育成熟過(guò)程中加工卵黃、在胚胎發(fā)育過(guò)程中降解卵黃蛋白，為胚胎發(fā)育提供所需的營(yíng)

養(yǎng)物質(zhì)［6-10］，因此推測(cè)該基因可能與卵巢發(fā)育相關(guān)。本研究利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)（RT-PCR）研究日本囊對(duì)蝦不同發(fā)育時(shí)期Cathepsin B在mRNA水平上的表達(dá)，并探討其在卵巢發(fā)育中所起的作用，旨在為對(duì)蝦卵巢發(fā)育分子調(diào)控機(jī)制研究提供基礎(chǔ)性資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品處理 日本囊對(duì)蝦購(gòu)于廈門水產(chǎn)品貿(mào)易批發(fā)市場(chǎng)，解剖前測(cè)定對(duì)蝦體長(zhǎng)，體重，解剖取得日本囊對(duì)蝦卵巢并稱取質(zhì)量后，分為兩份，一份立即于液氮中冷凍，后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱，一份保存到4%的多聚甲醛溶液（Paraformaldehyde，PFA），用于后續(xù)切片制作，鑒定卵巢發(fā)育程度。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 RNA抽提試劑RDP（成分類似Trizol試劑［11］）；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，Thermo公司；SYBR Green Realtime PCR Master Mix，TOYOBO公司。

1.1.3 主要儀器 羅氏實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x器LightCycler?480 Real-Time PCR Instrument（Roche）；-80℃超低溫冰箱，Thermo公司；醫(yī)用4℃冷藏冰箱，中科美菱公司；AF-100AS自動(dòng)制冰機(jī)，SCOTSMAN公司；ADAP-24雙蒸水系統(tǒng)，ReSearch公司；低溫冷凍離心機(jī)，Sigma公司；勻漿機(jī)，IKA公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)定量PCR引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Cathepsin B的cDNA全長(zhǎng)（GenBank登錄號(hào)HQ328943.1）設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量引物，引物使用Primer6設(shè)計(jì)并由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 Cathepsin B基因熒光定量引物

1.2.2 不同卵巢發(fā)育分期 利用HE染色切片并參照性腺發(fā)育指數(shù)（Gonad-somatic index，GSI）法進(jìn)行卵巢切片分期。根據(jù)文獻(xiàn)［12-14］將卵巢中的卵細(xì)胞發(fā)育分為4個(gè)期，分別為卵黃合成前期（Previtellogenic stage，0.14＜GSI＜0.18），內(nèi)源性卵黃合成時(shí)期（Endogenous vitellogenic stage，1.2＜GSI＜2.1），外源性卵黃合成時(shí)期（Exogenous vitellogenic stage，5.2＜GSI＜6.6）和成熟時(shí)期（Maturing stage，5.4＜GSI＜8.4）。GSI作為分期標(biāo)準(zhǔn)與切片分期互為對(duì)照，確保分期的準(zhǔn)確性。

1.2.3 總 RNA 的提取及逆轉(zhuǎn)錄 取不同發(fā)育時(shí)期的卵巢組織，采用RDP試劑，參照Trizol試劑的RNA提取步驟，提取RNA［11］。在所提取的RNA中加入20-50 μL的無(wú)RNA酶滅菌水，靜置30 min使其充分溶解，將所提取的RNA經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，取1 μL測(cè)定其OD260/280值，確定濃度。取3 μg提取的RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析以cDNA為定量模板，以18S rRNA為參照基因［15］，使用LightCycler?480 Real-Time PCR Instrument進(jìn)行定量試驗(yàn)，反應(yīng)體系為10 μL：SYBR Green 5 μL，正向引物0.25 μL（10 mmol），反向引物0.25 μL（10 mmol），cDNA模板4.5 μL。每個(gè)發(fā)育時(shí)期的卵巢取3個(gè)組織樣品，每個(gè)樣品組織做3個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)重復(fù)。反應(yīng)條件：95℃1 min；95℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 10s，45個(gè)循環(huán)。熔解曲線，95℃ 5 s，65℃ 1 min，以每秒0.11℃上升到97℃。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 根據(jù)定量PCR儀測(cè)出的Ct值計(jì)算出每個(gè)樣品的RQ值［RQ值=2-ΔΔCt，ΔΔCt=（Cathepsin B目的基因Ct值-18S rRNA對(duì)照基因Ct值）-校準(zhǔn)ΔCt值］來(lái)計(jì)算Cathepsin B基因的表達(dá)水平，基因的表達(dá)水平由RQ平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±standard deviation，±s）來(lái)表示。如果Cathepsin B基因與18S rRNA基因的擴(kuò)增效率不同，則使用羅氏熒光定量PCR儀自動(dòng)校正功能校正RQ值。利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)RQ值進(jìn)行單因素方差分析，分析Cathepsin B基因表達(dá)顯著性，P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 提取總RNA質(zhì)量檢驗(yàn)

將所提取的總RNA取1 μL經(jīng)1%的凝膠電泳圖檢測(cè)，圖1顯示，28S rRNA、18S rRNA條帶清晰，說(shuō)明提取的RNA質(zhì)量完好，可用于下一步的RNA

的逆轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)。經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定所提取的總RNA的OD260/280值，其數(shù)值在1.8-2.1之間，RNA未被降解，并測(cè)量得到RNA的濃度。

圖1 提取的總RNA的質(zhì)量檢驗(yàn)

2.2 熒光定量PCR的擴(kuò)增效率的檢測(cè)

分 別 將Cathepsin B和18S rRNA的cDNA以10-1、10-2、10-3和10-4的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋，并進(jìn)行熒光定量PCR，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)。以各濃度的Ct值作為縱坐標(biāo)，以稀釋倍數(shù)的對(duì)數(shù)絕對(duì)值作為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，圖2顯示，相關(guān)系數(shù)值R2＞0.99，擴(kuò)增效率Cathepsin B，0.93；18S rRNA，1.05。

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)Cathepsin B目的基因（A）及18S rRNA對(duì)照基因（B）擴(kuò)增效率的檢驗(yàn)

2.3 熒光定量試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Cathepsin B目的基因及18S rRNA參照基因的熔解曲線均為單一條帶峰（圖3），表明擴(kuò)增出的是單一的PCR特異產(chǎn)物。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果（圖4）顯示，Cathepsin B 的mRNA在卵黃合成前期表達(dá)含量最高，在內(nèi)源性卵黃合成期和外源性卵黃合成期表達(dá)水平基本一致，而在成熟期表達(dá)水平急劇下降。其中卵黃合成前期與內(nèi)源性卵黃合成期、外源性卵黃合成期和成熟期相比，Cathepsin B表達(dá)具有顯著差異性（P＜0.05），內(nèi)源性卵黃合成期與外源性卵黃合成期之間沒(méi)有顯著差異性（P＞0.05），而成熟期與前邊3期相比具有顯著性差異（P＜0.05）。

圖3 Cathepsin B（紅色）與18S rRNA（藍(lán)色）基因熒光定量熔解曲線

圖4 日本囊對(duì)蝦不同發(fā)育時(shí)期卵巢Cathepsin B相對(duì)表達(dá)

3 討論

本研究通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR分析了 Cathepsin B

基因在mRNA水平日本囊對(duì)蝦卵巢不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)。結(jié)果顯示，Cathepsin B 在卵黃合成前期表達(dá)含量最高，在內(nèi)源性卵黃合成期、外源性卵黃合成期表達(dá)水平有所下降，但在這兩個(gè)時(shí)期中表達(dá)基本一致且沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。由結(jié)果推測(cè)Cathepsin B在卵黃合成前期可能快速、大量合成；而在內(nèi)源性卵黃合成期、外源性卵黃合成期表達(dá)穩(wěn)定，預(yù)示Cathepsin B可能在卵巢發(fā)育前3個(gè)期的卵黃生成中發(fā)揮了重要作用。在卵巢成熟期Cathepsin B表達(dá)水平的急劇下降預(yù)示著Cathepsin B在卵巢成熟期所發(fā)揮的作用可能明顯下降。

我們通過(guò)Western blot試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Cathepsin B蛋白在卵黃合成前期表達(dá)含量最低，在外源性卵黃合成期表達(dá)水平達(dá)到最高，說(shuō)明Cathepsin B在卵巢發(fā)育中其mRNA與蛋白表達(dá)不同步。因此我們推測(cè)Cathepsin B在日本囊對(duì)蝦卵巢發(fā)育過(guò)程中受到復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。皮質(zhì)棒蛋白（Cortical rod proteins，CRP）同樣與其mRNA表達(dá)不一致［16，17］，CRP是皮質(zhì)棒的主要成分之一，它的 mRNA 的合成在卵黃合成前期表達(dá)含量最高，但是其蛋白質(zhì)的合成卻在內(nèi)源性卵黃合成期才開(kāi)始表達(dá)。據(jù)研究，在卵子生成過(guò)程中有些基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被儲(chǔ)存起來(lái)用作后期蛋白合成［18，19］，據(jù)此推測(cè)Cathepsin B mRNA 在卵黃合成前期表達(dá)量最高，是為后續(xù)卵巢發(fā)育時(shí)期Cathepsin B蛋白的翻譯合成過(guò)程進(jìn)行模板儲(chǔ)備，其mRNA受到轉(zhuǎn)錄后加工和調(diào)控?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在牡蠣中Cathepsin B是一個(gè)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因［20］。據(jù)此可以推測(cè)日本囊對(duì)蝦卵巢發(fā)育過(guò)程中Cathepsin B的表達(dá)過(guò)程可能是：在卵黃合成前期，Cathepsin B mRNA大量合成，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后加工并儲(chǔ)存起來(lái)，此間伴隨著部分降解；在卵黃合成時(shí)期，其mRNA保持相對(duì)穩(wěn)定的表達(dá)，用于翻譯合成Cathepsin B蛋白；而到成熟期時(shí)，Cathepsin B mRNA同其蛋白表達(dá)水平同時(shí)下降，結(jié)束其使命。

熒光定量引物的設(shè)計(jì)要按照一定的要求來(lái)設(shè)計(jì)才能取得良好的效果，比如在靠近mRNA的3'端來(lái)設(shè)計(jì)定量引物可以減少mRNA降解造成的試驗(yàn)誤差；設(shè)計(jì)引物時(shí)要適當(dāng)提高擴(kuò)增引物的退火溫度，減少引物二聚體的形成；擴(kuò)增子的長(zhǎng)度應(yīng)在80-150 bp之間，擴(kuò)增子長(zhǎng)度過(guò)短難以與引物二聚體區(qū)分，長(zhǎng)度過(guò)長(zhǎng)會(huì)影響擴(kuò)增效率，盡量避免引物二聚體的出現(xiàn)，尤其是發(fā)夾結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。RNA酶按來(lái)源可分為外源性和內(nèi)源性RNA酶，外源性RNA酶，例如人體自身的RNA酶會(huì)對(duì)樣品RNA造成降解，可以通過(guò)戴口罩、手套避免［21］。RNA的提取重點(diǎn)是避免內(nèi)源性RNA酶對(duì)RNA的降解，組織塊不能太大，否則RDP裂解液無(wú)法完全將其裂解，組織內(nèi)源性RNA酶使RNA降解。一般1 mL的RDP可完全抑制50 mg組織內(nèi)的RNA酶。

4 結(jié)論

熒光定量試驗(yàn)顯示，Cathepsin B 在日本囊對(duì)蝦卵巢發(fā)育的整個(gè)過(guò)程中都有表達(dá)，在卵黃合成前期表達(dá)水平最高，在內(nèi)源性卵黃合成期和外源性卵黃合成期表達(dá)量維持在一個(gè)比較穩(wěn)定的水平，在成熟期表達(dá)水平急劇下降。結(jié)果表明，Cathepsin B在日本囊對(duì)蝦卵巢發(fā)育的不同時(shí)期具有差異化表達(dá)，其在卵巢成熟過(guò)程中起到重要作用。Cathepsin B 的mRNA在日本囊對(duì)蝦卵巢發(fā)育中是一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

The Expression of Cathepsin B in the Different Ovary Development Stages of Marsupenaeus japonicus

Cheng Cheng Lin Peng
（The Key Laboratory of Healthy Mariculture for the East China Sea，Ministry of Agriculture，F(xiàn)isheries College，Jimei University，Xiamen 361021）

The expression of Cathepsin B is tested in the different ovary development stages of Marsupenaeus japonicus by Real-time PCR. The results show Cathepsin B is in the highest level in the previtellogenic stage（PR）, medium level in the endogenous vitellogenic stage（EN）and exogenous vitellogenic stage（EX）. However the expression suddenly declines and is in the lowest level in the maturing stage（MA）. Cathepsin B of PR has significant difference compared with that of EN, EX and MA respectively（P＜0.05）. There is no significant difference between EN and EX stages（P＞0.05）. The expression of Cathepsin B in MA is significantly different from that in other three stages（P＜0.05）. The results of Real-time PCR indicate that Cathepsin B may play one important role in the ovary development of Marsupenaeus japonicus.

Marsupenaeus japonicas Ovary development Cathepsin B Real-time PCR Gene expression

2014-04-04

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012J01140），福建省教育廳科技項(xiàng)目（JA12193），集美大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金項(xiàng)目（2010A001）

程成，男，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)生物技術(shù)；E-mail：837662459@qq.com

林鵬，男，博士，教授，研究方向：水產(chǎn)生物技術(shù)；E-mail：linpeng@jmu.edu.cn