程成 林鵬

（集美大學水產(chǎn)學院 農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室，廈門 361021）

日本囊對蝦Cathepsin B基因在不同卵巢發(fā)育時期的表達

程成 林鵬

（集美大學水產(chǎn)學院 農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室，廈門 361021）

采用實時定量PCR技術(shù)，以18S rRNA為內(nèi)標基因，檢測日本囊對蝦Cathepsin B基因在mRNA水平不同卵巢發(fā)育時期的表達。結(jié)果顯示，Cathepsin B在卵黃合成前期表達最高，內(nèi)源性卵黃合成期和外源性卵黃合成期表達水平基本一致，而在成熟期表達水平急劇下降。其中卵黃合成前期與其它3期相比具有顯著性差異（P＜0.05），內(nèi)源性卵黃合成期和外源性卵黃合成期Cathepsin B不具有顯著性差異（P＞0.05），而成熟期與前邊三期相比具有顯著性差異（P＜0.05）。推測Cathepsin B可能在日本囊對蝦卵巢發(fā)育中發(fā)揮了作用。

日本囊對蝦 卵巢發(fā)育 組織蛋白酶B 實時定量PCR 基因表達

日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicus）是我國東南沿海各省重要的捕撈和養(yǎng)殖經(jīng)濟類品種［1］，雌性個體發(fā)育速度比雄性快，在個體上也存在明顯優(yōu)勢，性別與生殖制約著它們的產(chǎn)值［2］，若能培育出雌性對蝦并進行單性化養(yǎng)殖可大幅度提高養(yǎng)殖產(chǎn)量，創(chuàng)造更大的經(jīng)濟價值，對蝦性別控制一直是水產(chǎn)遺傳育種研究的熱點，但是相對于鳥類、哺乳類等高級動物，甲殼動物生殖發(fā)育研究比較困難，因為其沒有明顯性染色體［3，4］。了解卵巢發(fā)育的分子機制是性別控制的基礎(chǔ)，而首要的步驟是確認在卵巢中與卵巢發(fā)育相關(guān)的基因［5］。

我們前期研究中發(fā)現(xiàn)，組織蛋白酶B基因（Cathepsin B）在日本囊對蝦卵巢中特異表達，而據(jù)文獻報道Cathepsin B蛋白在昆蟲、魚類、鳥類等卵生動物卵細胞發(fā)育成熟過程中加工卵黃、在胚胎發(fā)育過程中降解卵黃蛋白，為胚胎發(fā)育提供所需的營

養(yǎng)物質(zhì)［6-10］，因此推測該基因可能與卵巢發(fā)育相關(guān)。本研究利用實時定量PCR技術(shù)（RT-PCR）研究日本囊對蝦不同發(fā)育時期Cathepsin B在mRNA水平上的表達，并探討其在卵巢發(fā)育中所起的作用，旨在為對蝦卵巢發(fā)育分子調(diào)控機制研究提供基礎(chǔ)性資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物及樣品處理 日本囊對蝦購于廈門水產(chǎn)品貿(mào)易批發(fā)市場，解剖前測定對蝦體長，體重，解剖取得日本囊對蝦卵巢并稱取質(zhì)量后，分為兩份，一份立即于液氮中冷凍，后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱，一份保存到4%的多聚甲醛溶液（Paraformaldehyde，PFA），用于后續(xù)切片制作，鑒定卵巢發(fā)育程度。

1.1.2 試驗試劑 RNA抽提試劑RDP（成分類似Trizol試劑［11］）；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，Thermo公司；SYBR Green Realtime PCR Master Mix，TOYOBO公司。

1.1.3 主要儀器 羅氏實時熒光定量儀器LightCycler?480 Real-Time PCR Instrument（Roche）；-80℃超低溫冰箱，Thermo公司；醫(yī)用4℃冷藏冰箱，中科美菱公司；AF-100AS自動制冰機，SCOTSMAN公司；ADAP-24雙蒸水系統(tǒng)，ReSearch公司；低溫冷凍離心機，Sigma公司；勻漿機，IKA公司。

1.2 方法

1.2.1 實時定量PCR引物設計 根據(jù)Cathepsin B的cDNA全長（GenBank登錄號HQ328943.1）設計實時熒光定量引物，引物使用Primer6設計并由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

表1 Cathepsin B基因熒光定量引物

1.2.2 不同卵巢發(fā)育分期 利用HE染色切片并參照性腺發(fā)育指數(shù)（Gonad-somatic index，GSI）法進行卵巢切片分期。根據(jù)文獻［12-14］將卵巢中的卵細胞發(fā)育分為4個期，分別為卵黃合成前期（Previtellogenic stage，0.14＜GSI＜0.18），內(nèi)源性卵黃合成時期（Endogenous vitellogenic stage，1.2＜GSI＜2.1），外源性卵黃合成時期（Exogenous vitellogenic stage，5.2＜GSI＜6.6）和成熟時期（Maturing stage，5.4＜GSI＜8.4）。GSI作為分期標準與切片分期互為對照，確保分期的準確性。

1.2.3 總 RNA 的提取及逆轉(zhuǎn)錄 取不同發(fā)育時期的卵巢組織，采用RDP試劑，參照Trizol試劑的RNA提取步驟，提取RNA［11］。在所提取的RNA中加入20-50 μL的無RNA酶滅菌水，靜置30 min使其充分溶解，將所提取的RNA經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗，取1 μL測定其OD260/280值，確定濃度。取3 μg提取的RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存。

1.2.4 實時熒光定量PCR 分析以cDNA為定量模板，以18S rRNA為參照基因［15］，使用LightCycler?480 Real-Time PCR Instrument進行定量試驗，反應體系為10 μL：SYBR Green 5 μL，正向引物0.25 μL（10 mmol），反向引物0.25 μL（10 mmol），cDNA模板4.5 μL。每個發(fā)育時期的卵巢取3個組織樣品，每個樣品組織做3個統(tǒng)計學重復。反應條件：95℃1 min；95℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 10s，45個循環(huán)。熔解曲線，95℃ 5 s，65℃ 1 min，以每秒0.11℃上升到97℃。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 根據(jù)定量PCR儀測出的Ct值計算出每個樣品的RQ值［RQ值=2-ΔΔCt，ΔΔCt=（Cathepsin B目的基因Ct值-18S rRNA對照基因Ct值）-校準ΔCt值］來計算Cathepsin B基因的表達水平，基因的表達水平由RQ平均值±標準誤（mean±standard deviation，±s）來表示。如果Cathepsin B基因與18S rRNA基因的擴增效率不同，則使用羅氏熒光定量PCR儀自動校正功能校正RQ值。利用SPSS統(tǒng)計軟件對RQ值進行單因素方差分析，分析Cathepsin B基因表達顯著性，P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 提取總RNA質(zhì)量檢驗

將所提取的總RNA取1 μL經(jīng)1%的凝膠電泳圖檢測，圖1顯示，28S rRNA、18S rRNA條帶清晰，說明提取的RNA質(zhì)量完好，可用于下一步的RNA

的逆轉(zhuǎn)錄試驗。經(jīng)紫外分光光度計測定所提取的總RNA的OD260/280值，其數(shù)值在1.8-2.1之間，RNA未被降解，并測量得到RNA的濃度。

圖1 提取的總RNA的質(zhì)量檢驗

2.2 熒光定量PCR的擴增效率的檢測

分 別 將Cathepsin B和18S rRNA的cDNA以10-1、10-2、10-3和10-4的稀釋倍數(shù)進行稀釋，并進行熒光定量PCR，每個稀釋度做3個重復。以各濃度的Ct值作為縱坐標，以稀釋倍數(shù)的對數(shù)絕對值作為橫坐標建立標準曲線方程，圖2顯示，相關(guān)系數(shù)值R2＞0.99，擴增效率Cathepsin B，0.93；18S rRNA，1.05。

圖2 實時熒光定量PCR對Cathepsin B目的基因（A）及18S rRNA對照基因（B）擴增效率的檢驗

2.3 熒光定量試驗結(jié)果

經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)Cathepsin B目的基因及18S rRNA參照基因的熔解曲線均為單一條帶峰（圖3），表明擴增出的是單一的PCR特異產(chǎn)物。實時定量PCR結(jié)果（圖4）顯示，Cathepsin B 的mRNA在卵黃合成前期表達含量最高，在內(nèi)源性卵黃合成期和外源性卵黃合成期表達水平基本一致，而在成熟期表達水平急劇下降。其中卵黃合成前期與內(nèi)源性卵黃合成期、外源性卵黃合成期和成熟期相比，Cathepsin B表達具有顯著差異性（P＜0.05），內(nèi)源性卵黃合成期與外源性卵黃合成期之間沒有顯著差異性（P＞0.05），而成熟期與前邊3期相比具有顯著性差異（P＜0.05）。

圖3 Cathepsin B（紅色）與18S rRNA（藍色）基因熒光定量熔解曲線

圖4 日本囊對蝦不同發(fā)育時期卵巢Cathepsin B相對表達

3 討論

本研究通過實時定量PCR分析了 Cathepsin B

基因在mRNA水平日本囊對蝦卵巢不同發(fā)育時期的表達。結(jié)果顯示，Cathepsin B 在卵黃合成前期表達含量最高，在內(nèi)源性卵黃合成期、外源性卵黃合成期表達水平有所下降，但在這兩個時期中表達基本一致且沒有顯著性差異（P＞0.05）。由結(jié)果推測Cathepsin B在卵黃合成前期可能快速、大量合成；而在內(nèi)源性卵黃合成期、外源性卵黃合成期表達穩(wěn)定，預示Cathepsin B可能在卵巢發(fā)育前3個期的卵黃生成中發(fā)揮了重要作用。在卵巢成熟期Cathepsin B表達水平的急劇下降預示著Cathepsin B在卵巢成熟期所發(fā)揮的作用可能明顯下降。

我們通過Western blot試驗發(fā)現(xiàn)Cathepsin B蛋白在卵黃合成前期表達含量最低，在外源性卵黃合成期表達水平達到最高，說明Cathepsin B在卵巢發(fā)育中其mRNA與蛋白表達不同步。因此我們推測Cathepsin B在日本囊對蝦卵巢發(fā)育過程中受到復雜的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。皮質(zhì)棒蛋白（Cortical rod proteins，CRP）同樣與其mRNA表達不一致［16，17］，CRP是皮質(zhì)棒的主要成分之一，它的 mRNA 的合成在卵黃合成前期表達含量最高，但是其蛋白質(zhì)的合成卻在內(nèi)源性卵黃合成期才開始表達。據(jù)研究，在卵子生成過程中有些基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被儲存起來用作后期蛋白合成［18，19］，據(jù)此推測Cathepsin B mRNA 在卵黃合成前期表達量最高，是為后續(xù)卵巢發(fā)育時期Cathepsin B蛋白的翻譯合成過程進行模板儲備，其mRNA受到轉(zhuǎn)錄后加工和調(diào)控?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在牡蠣中Cathepsin B是一個轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因［20］。據(jù)此可以推測日本囊對蝦卵巢發(fā)育過程中Cathepsin B的表達過程可能是：在卵黃合成前期，Cathepsin B mRNA大量合成，進行轉(zhuǎn)錄后加工并儲存起來，此間伴隨著部分降解；在卵黃合成時期，其mRNA保持相對穩(wěn)定的表達，用于翻譯合成Cathepsin B蛋白；而到成熟期時，Cathepsin B mRNA同其蛋白表達水平同時下降，結(jié)束其使命。

熒光定量引物的設計要按照一定的要求來設計才能取得良好的效果，比如在靠近mRNA的3'端來設計定量引物可以減少mRNA降解造成的試驗誤差；設計引物時要適當提高擴增引物的退火溫度，減少引物二聚體的形成；擴增子的長度應在80-150 bp之間，擴增子長度過短難以與引物二聚體區(qū)分，長度過長會影響擴增效率，盡量避免引物二聚體的出現(xiàn)，尤其是發(fā)夾結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。RNA酶按來源可分為外源性和內(nèi)源性RNA酶，外源性RNA酶，例如人體自身的RNA酶會對樣品RNA造成降解，可以通過戴口罩、手套避免［21］。RNA的提取重點是避免內(nèi)源性RNA酶對RNA的降解，組織塊不能太大，否則RDP裂解液無法完全將其裂解，組織內(nèi)源性RNA酶使RNA降解。一般1 mL的RDP可完全抑制50 mg組織內(nèi)的RNA酶。

4 結(jié)論

熒光定量試驗顯示，Cathepsin B 在日本囊對蝦卵巢發(fā)育的整個過程中都有表達，在卵黃合成前期表達水平最高，在內(nèi)源性卵黃合成期和外源性卵黃合成期表達量維持在一個比較穩(wěn)定的水平，在成熟期表達水平急劇下降。結(jié)果表明，Cathepsin B在日本囊對蝦卵巢發(fā)育的不同時期具有差異化表達，其在卵巢成熟過程中起到重要作用。Cathepsin B 的mRNA在日本囊對蝦卵巢發(fā)育中是一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式。

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（責任編輯 馬鑫）

The Expression of Cathepsin B in the Different Ovary Development Stages of Marsupenaeus japonicus

Cheng Cheng Lin Peng
（The Key Laboratory of Healthy Mariculture for the East China Sea，Ministry of Agriculture，F(xiàn)isheries College，Jimei University，Xiamen 361021）

The expression of Cathepsin B is tested in the different ovary development stages of Marsupenaeus japonicus by Real-time PCR. The results show Cathepsin B is in the highest level in the previtellogenic stage（PR）, medium level in the endogenous vitellogenic stage（EN）and exogenous vitellogenic stage（EX）. However the expression suddenly declines and is in the lowest level in the maturing stage（MA）. Cathepsin B of PR has significant difference compared with that of EN, EX and MA respectively（P＜0.05）. There is no significant difference between EN and EX stages（P＞0.05）. The expression of Cathepsin B in MA is significantly different from that in other three stages（P＜0.05）. The results of Real-time PCR indicate that Cathepsin B may play one important role in the ovary development of Marsupenaeus japonicus.

Marsupenaeus japonicas Ovary development Cathepsin B Real-time PCR Gene expression

2014-04-04

福建省自然科學基金項目（2012J01140），福建省教育廳科技項目（JA12193），集美大學創(chuàng)新團隊基金項目（2010A001）

程成，男，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)生物技術(shù)；E-mail：837662459@qq.com

林鵬，男，博士，教授，研究方向：水產(chǎn)生物技術(shù)；E-mail：linpeng@jmu.edu.cn