謝曉娜張小秋邵敏朱惠楊麗濤，2李楊瑞，2

（1..廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530004；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心 廣西農(nóng)業(yè)科院農(nóng)業(yè)部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣西甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530007）

甘蔗類異黃酮還原酶（IRL）基因的克隆與表達(dá)分析

謝曉娜1張小秋1邵敏1朱惠1楊麗濤1，2李楊瑞1，2

（1..廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530004；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心 廣西農(nóng)業(yè)科院農(nóng)業(yè)部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣西甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530007）

采用 RT-PCR 技術(shù)從甘蔗中克隆 SoIRL基因，用生物信息學(xué)方法對(duì)獲得的氨基酸序列進(jìn)行分析，利用熒光定量PCR 技術(shù)研究SoIRL基因在甘蔗不同組織和不同脅迫條件下的表達(dá)特性。結(jié)果表明，克隆獲得甘蔗 SoIRL，GenBank 登錄號(hào)為KF808324。該 cDNA 全長 1 169 bp，含有 1 個(gè) 927 bp 的完整開放閱讀框（ORF），編碼 309個(gè)氨基酸。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，甘蔗SoIRL 與玉米的 IRL 蛋白親緣關(guān)系較近。qRT-PCR 分析表明 SoIRL 在甘蔗根、莖、葉中均有表達(dá)；在RSD病菌及低溫（4℃）、聚乙二醇（PEG）、NaCl 和 脫落酸（ABA）4種非生物脅迫下均被誘導(dǎo)表達(dá)，但表達(dá)模式不同。說明該基因可能參與甘蔗應(yīng)答RSD過程，并可能在非生物脅迫中也發(fā)揮了作用。

甘蔗 類異黃酮還原酶 基因克隆 表達(dá)分析

甘蔗是制糖的主要原料，是我國最重要的糖料作物，也是極具潛力的生物質(zhì)能源作物［1］，甘蔗宿根矮化?。≧atoon stuning disease，RSD）是甘蔗生產(chǎn)中最為嚴(yán)重的細(xì)菌病害之一，常導(dǎo)致感病品種新

植蔗減產(chǎn)10%-15%，宿根蔗減產(chǎn)20%-25%，在干旱的情況下感病品種的宿根蔗產(chǎn)量損失可達(dá)60%以上［2］，目前有關(guān)甘蔗與RSD病原菌互作的分子機(jī)制研究不多。類異黃酮還原酶（IRL），是合成木質(zhì)素和異黃酮等植物次生代謝產(chǎn)物的一類關(guān)鍵酶［3，4］，而木質(zhì)素、類黃酮和生物堿等次生代謝產(chǎn)物［5］，在植物的生長發(fā)育、色素形成、抗毒素的產(chǎn)生等方面都具有重要的作用。自1991年首次從豆科植物克隆得到異黃酮還原酶基因以來，陸續(xù)從擬南芥［6］、煙草［7］、葡萄［8］、馬鈴薯［9］、金蕎麥［10］、苦蕎［11］、銀杏［12］等多種植物中克隆得到IRL基因。目前，對(duì)編碼甘蔗類異黃酮還原酶基因的研究還未見報(bào)道，對(duì)于異黃酮還原酶基因與植物抗逆性之間的機(jī)理研究也未見報(bào)道。本研究利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和MALDI-TOF/TOF技術(shù)，鑒定出類異黃酮還原酶蛋白，并通過RT-PCR克隆甘蔗SoIRL基因；分析SoIRL基因的相關(guān)結(jié)構(gòu)域、序列特征及細(xì)胞定位，研究SoIRL基因在甘蔗不同部位及不同逆境下的表達(dá)模式，為甘蔗的抗逆尤其是抗病育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料處理與取樣：試驗(yàn)于2011年3月至2013年12月在廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院甘蔗智能溫室大棚及廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

將PCR檢測(cè)后沒有宿根矮化病的甘蔗品種GT11砍成單芽種莖，50℃ 2 h溫湯脫菌后，涼至室溫。一部分用Lxx菌液浸種，一部分用清水浸種作為對(duì)照。將處理后的甘蔗品種的單芽種莖進(jìn)行桶栽土培?；旌贤翞椋ㄍ痢糜袡C(jī)肥∶沙=7∶2∶1，W/W），并把桶移至智能溫室大棚，按照日常管理。待甘蔗長至90、120、150、180 d時(shí)分別取蔗莖基部2-3節(jié)；取不做任何處理的生長健壯，長勢(shì)一致的甘蔗單芽種莖種植在細(xì)沙中，當(dāng)苗長出2-3葉時(shí)，轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)杯（沙∶土=1∶1）中培養(yǎng)。待苗長到 7-8片真葉時(shí)，取長勢(shì)一致的植株，分為4組，進(jìn)行如下處理，一組用15%的PEG進(jìn)行澆灌處理；一組 4℃低溫處理（白晝 16 h/8 h，濕度 65%）；另外兩組分別用 100 mmol/L的 NaCl 和100 μmol/L的 ABA進(jìn)行噴灑葉面處理。在處理后分別于 0、3、6、12、24和 48 h 取樣；另取不做任何處理的健康甘蔗根、莖、葉樣品。各處理取樣后用液氮速凍，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 雙向電泳 RSD菌液浸種為處理，ddH2O浸種為對(duì)照，以TCA-丙酮法提取對(duì)照與處理蔗汁蛋白質(zhì)，進(jìn)行雙向電泳，利用BioRad 2-D分析軟件找出差異蛋白點(diǎn)，質(zhì)譜鑒定，登錄NCBI數(shù)據(jù)庫，對(duì)質(zhì)譜鑒定結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.2 總RNA的提取及cDNA的合成 用Trizol試劑提取總RNA（北京康為世紀(jì)公司），RNA濃度測(cè)定后，將RNA稀釋至同一濃度保存待用。應(yīng)用 M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）將純化的總RNA 反轉(zhuǎn)錄成第一鏈 cDNA，逆轉(zhuǎn)錄加尾引物為Oligo（dT）18：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC（T）18-3'，具體操作步驟參照說明書進(jìn)行。

1.2.3 SoIRL基因的克隆與生物信息學(xué)分析 以質(zhì)譜鑒定的 IRL蛋白氨基酸序列為參照，登錄NCBI進(jìn)行搜索，選取同源性較高的植物核苷酸序列，運(yùn)用Primer軟件設(shè)計(jì)該基因上游引物IRL1：5'-ATGGCGTCGGAGAAGAGCAA-3'，下游引物使用逆轉(zhuǎn)錄加尾引物 3side：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3'。SoIRL基因的克隆參照Dream Taq DNA 聚合酶的反應(yīng)體系及程序，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖電泳檢測(cè)，回收純化目的條帶，用pMD18-T連接，挑取陽性克隆，PCR檢測(cè)后，送去上海生工生物工程公司測(cè)序。

用軟件 BioXM2.6 預(yù) 測(cè) SoIRL 氨 基 酸 序 列；用Protparam分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；用TMpred分析分析SoIRL蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)；用ExPASy Proteomics Server軟件預(yù)測(cè)基因的親疏水性；用SOPMA軟件預(yù)測(cè)基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析；用Motif Scan軟件對(duì)SoIRL的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)；采用MEGA 4軟件構(gòu)建甘蔗SoIRL氨基酸序列與其它物種的進(jìn)化樹。

1.2.4 SoIRL基因的實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析 根據(jù)獲得的SoIRL基因序列設(shè)計(jì)Real-time PCR特異性引物IRL-F：5'-GAGAAGAAGACCGGCAAGAC-3'，IRL-R：5'-GATCGCCAGGATGATATTCAG-3'；以 甘蔗GAPDH基因（登錄號(hào)為 EF189713）為內(nèi)參，并設(shè)計(jì)內(nèi)參

引物 GAPDH-F：5'-AAGGGTGGTGCCAAGAAGG-3'，GAPDH-R：5'-CAAGGGGAGCAAGGCAGTT-3'。試驗(yàn)在羅氏 480（LC480）熒光定量 PCR 儀上進(jìn)行，反應(yīng)總體積為25 μL，反應(yīng)體系及程序參照 TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTMⅡ說明書。按照 2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 RSD脅迫下甘蔗蔗汁差異蛋白質(zhì)雙向電泳分析以甘蔗為材料，提取健康與感染RSD的甘蔗蔗汁蛋白，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行等點(diǎn)聚焦和SDS-PAGE電泳分離，利用BioRad 2-D軟件進(jìn)行分析，其中蛋白點(diǎn)12在RSD病原菌脅迫下調(diào)表達(dá)，被MALDI-TOFTOF/MS鑒定為IRL基因（圖1）。

圖 1 甘蔗低溫脅迫SoIRL蛋白的差異表達(dá)

2.2 SoIRL基因的克隆

以cDNA為模板，IRL1和3side為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳（圖2）檢測(cè)得到一條1 200 bp左右的DNA條帶，對(duì)目的條帶進(jìn)行回收純化，連接T載體，轉(zhuǎn)化DH5α，藍(lán)白斑篩選后，測(cè)序得到一個(gè)1 169 bp的序列。該基因命名為SoIRL，NCBI登錄號(hào)為KF808324。BioXM2.6 軟件分析顯示該基因包含啟動(dòng)子 ATG 和終止子TGA，開放閱讀框（open read frame，ORF）為927 bp，編碼309個(gè)氨基酸（圖3）。

圖 2 甘蔗 SoIRL 的擴(kuò)增

2.3 SoIRL基因生物信息學(xué)分析

用在線軟件http：//www.expasy.org/tools/protpara m.htm分析SoIRL的理化性質(zhì)，顯示該基因所編碼的氨基酸序列等電點(diǎn)為 5.17，蛋白質(zhì)分子量大小為 33.00 kD。在氨基酸序列組成中，一些氨基酸如Ala、Leu、Val、Gly 出現(xiàn)頻率較高，分別占11.7%、9.4%、9.1%和9.1%，而一些氨基酸如Trp、Met、His 出現(xiàn)頻率則較低，只占0.3%、1.0%、1.3%和1.9%，而Sec、Cys 在氨基酸序列中則沒有出現(xiàn)。該蛋白質(zhì)的分子式為C1486H2365N387O453S3，原子總數(shù)為4 694，消光系數(shù)為23 380，不穩(wěn)定系數(shù)為30.18，是穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)為97.25，總平均親水性為-0.026，該蛋白為親水蛋白。SOSUI signal軟件預(yù)測(cè)顯示SoIRL N端1-24含一個(gè)序列長24個(gè)氨基酸的信號(hào)肽（MASEKSKILVVGGTGYLGRHVVAA）。TMpred軟件預(yù)測(cè)含有7個(gè)跨膜螺旋區(qū)，3個(gè)區(qū)為由內(nèi)向外跨膜，分別分布在15-36、150-169和259-277區(qū)域；4個(gè)區(qū)為由外向內(nèi)跨膜，位置分別在8-24、7-191、150-168和258-274。氨基酸疏水性最小值為-2.544，最大值為2.478。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，α-螺旋122個(gè)，占39.48%，延伸鏈54個(gè)，占17.48%；β-轉(zhuǎn)角22個(gè)，占7.12%；無規(guī)則卷曲111個(gè)，占35.92%，可見SoIRL蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是α-螺旋和無規(guī)則卷曲組成。該基因含有16個(gè)磷酸化位點(diǎn)，Ser 4個(gè)、Thr 4個(gè)和Tyr 4個(gè)，轉(zhuǎn)錄后修飾位點(diǎn)的存在，說明轉(zhuǎn)錄后修飾對(duì)功能性蛋白SoIRL具有重要的作用。

蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域分析顯示含有一個(gè)環(huán)腺苷酸磷酸化位點(diǎn)為138-141；3個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)分別為3-5、25-27、235-237；5個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)分別為52-55、223-226、229-232、277-

280和299-302；序列132-137、145-150、165-170、286-291為N-肉豆蔻?；稽c(diǎn)；210-213為N-糖基化位點(diǎn)；122-129為依賴于cAMP-cGMP蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)；9-29、10-23為NAD輔酶結(jié)合位點(diǎn)；兩個(gè)NmrA（氮代謝抑制調(diào)節(jié)劑）保守結(jié)構(gòu)域（8-300）。這說明SoIRL很可能為短鏈脫氫酶家族（SDR）的成員。在NCBI在線軟件分析SoIRL極可能為SDR大家族中PCBER家族的一員。

圖 3 SoIRL 編碼區(qū)核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

甘蔗 SoIRL 的氨基酸序列與其它作物 IRL 編碼的氨基酸序列多重比對(duì)分析（圖4）發(fā)現(xiàn)，它們之間有較高的同源性，但也有明顯堿基上的差異。通過構(gòu)建甘蔗和其它植物的IRL進(jìn)化樹（圖5），發(fā)現(xiàn)甘蔗的 SoIRL 與高粱、玉米、禾草聚為一大類，與玉米的同源性最高為 99%。從進(jìn)化樹上看，相同科或類群的植物聚為一類，但不同植物間 IRL 間也存在很高的同源性，這也可推測(cè)其在進(jìn)化過程中是相當(dāng)保守的。

2.4 SoIRL基因的表達(dá)量分析

提取甘蔗不同組織的RNA，以甘蔗GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，結(jié)果（圖6）表明SoIRL在甘蔗的根、莖、葉中都有表達(dá)，為組成型表達(dá)，SoIRL基因在+1、+3、+5葉（最高可見肥厚帶葉為+1葉，往下以此類推）中的表達(dá)量差異不大；在莖中的表達(dá)量為第7節(jié)間（莖中部）最高，莖基部第1節(jié)間次之，在莖尖表達(dá)量最小，只有莖中部表達(dá)量的1/4；SoIRL在根部也有表達(dá)，且表達(dá)量與在莖中部及葉中的表達(dá)量差異不是很大。

同時(shí)采集90、120、150和180 d健康及感染RSD甘蔗蔗莖基部，進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果（圖7）表明，在感病的蔗莖體內(nèi)90、120和150 d，So-IRL的表達(dá)都高于健康對(duì)照，而在180 d則低于健康蔗莖。無論是健康還是感染RSD的蔗莖，SoIRL都表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)，可見SoIRL在甘蔗體內(nèi)的表達(dá)不是一成不變的，而是隨著甘蔗的生長而發(fā)生著變化。

圖 4 SoIRL與其它植物IRL 氨基酸序列多重比對(duì)

圖 5 甘蔗 SoIRL 與其它植物 IRL 氨基酸序列的關(guān)系分析

在干旱、低溫、激素和鹽脅迫下 SoIRL 均被誘導(dǎo)表達(dá)，但表達(dá)模式不一（圖 8）。在PEG模擬的干旱脅迫下，SoIRL 出現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的表達(dá)模式，處理3 h時(shí)降到最低僅為對(duì)照的一半，之后開始緩慢上升，到48 h時(shí)升為對(duì)照的1.9倍。在4℃低溫脅迫下，SoIRL的表達(dá)則出現(xiàn)“抑-揚(yáng)-抑-揚(yáng)”的雙峰表達(dá)模式，3 h時(shí)SoIRL的表達(dá)量急劇下降，降為對(duì)照的3.8%，之后開始緩慢增加，12 h時(shí)升到最高為對(duì)照的1.83倍，之后又開始有所下降，48 h時(shí)又升為對(duì)照的1.63倍。ABA處理下SoIRL的表達(dá)出現(xiàn)“升-降-升”的表達(dá)趨勢(shì)，處理3 h時(shí)表達(dá)量有所增

加，之后開始下降，24 h降到最低，僅為對(duì)照的37.0%，之后又開始增加，到48 h時(shí)表達(dá)量還是低于對(duì)照。NaCl模擬的高鹽脅迫下SoIRL的表達(dá)也出現(xiàn)“揚(yáng)-抑-揚(yáng)”的表達(dá)趨勢(shì)，在處理3 h時(shí)升為對(duì)照的2.3倍，之后開始出現(xiàn)急劇下降，12 h降到最低僅為對(duì)照的13.0%，之后又開始上升，48 h升到最高為對(duì)照的3倍之多。

圖6 甘蔗SoIRL的組織特異性表達(dá)

圖7 健康及感染RSD的甘蔗出苗后90-180 d SoIRL的表達(dá)

圖 8 SoIRL 在 4 種非生物脅迫條件下的表達(dá)特性

3 討論

類異黃酮還原酶包括異黃酮還原酶（IFR）［13］、落葉松脂醇還原酶（PLR）［14］和苯基香豆?jié)M芐醚還原酶（PCBER）［15］，進(jìn)幾年的研究發(fā)現(xiàn)IRL與植物中多種抗毒素的合成密切相關(guān)，參與了植物對(duì)生物和非生物脅迫的應(yīng)答［4］，在植物的生長發(fā)育、抗病、抗逆等方面發(fā)揮著重要的作用。

本研究根據(jù)已知IRL基因序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，獲得甘蔗SoIRL基因的全長序列1 167 bp，序列

分析表明該基因具有完整的開放閱讀框，生物信息學(xué)分析SoIRL極可能屬于短鏈脫氫酶家族，是NADPH依賴性還原酶，屬于PCBER家族成員的一員。這與趙海霞等［11］已報(bào)道的苦蕎FtIRL 推導(dǎo)的蛋白質(zhì)含有保守的NADPH 結(jié)合位點(diǎn)，符合短鏈脫氫酶家族的結(jié)構(gòu)特征結(jié)論一致。軟件預(yù)測(cè)顯示SoIRL N端1-24含一個(gè)序列長24個(gè)氨基酸的信號(hào)肽（MASEKSKILVVGGTGYLGRHVVAA），包含兩個(gè)NmrA保守結(jié)構(gòu)域，4個(gè)N-肉豆蔻?；稽c(diǎn)，一個(gè)保守的N-糖基化位點(diǎn)，多個(gè)重要的磷酸化位點(diǎn)，這些與已報(bào)道的野生金蕎麥FcIRL結(jié)構(gòu)相似［10］。同源性分析顯示甘蔗SoIRL編碼的氨基酸序列與其它物種IRL氨基酸序列具有較高的同源性，進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)SoIRL與高粱還有玉米的IRL親緣關(guān)系最近，相同科或類群的植物聚為一類，同時(shí)發(fā)現(xiàn)不同植物間IRL間也有較高的同源性，這說明IRL在進(jìn)化過程中保持了一定的演化趨同性。

本研究通過 qRT-PCR 分析SoIRL在甘蔗組織中的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)SoIRL在甘蔗的根、莖、葉中都有表達(dá)，為組成型表達(dá)。這與Vander Mijnsbrugge等［16］報(bào)道的PCBER在快速生長的植物組織中都能大量表達(dá)一致。棉花種皮的PCBER轉(zhuǎn)錄水平較高［15］，這在種子發(fā)育時(shí)起著至關(guān)重要的作用，因?yàn)樗粌H能保護(hù)種子的結(jié)構(gòu)不被破壞，而且可以增強(qiáng)棉花抵御外來生物侵染的能力。在RSD病原菌的脅迫下，SoIRL被誘導(dǎo)表達(dá)。有研究報(bào)道，葡萄的IRL蛋白在抵抗UV射線及病原菌感染時(shí)被誘導(dǎo)產(chǎn)生［8］，水稻OsIRL 在稻瘟病病原菌（Magnaporthe grisea）和茉莉酸的誘導(dǎo)下，其表達(dá)量上升［18］，咖啡葉中CoIRL在真菌浸染和機(jī)械損傷的逆境下，表達(dá)量顯著上升［3］。本研究還通過 qRT-PCR分析了SoIRL在4種非生物脅迫下的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在PEG、4℃脅迫下SoIRL都表現(xiàn)為先降低后升高的表達(dá)模式，都是在處理3 h表達(dá)量降到最低點(diǎn)。而在ABA作用下SoIRL出現(xiàn)“揚(yáng)-抑”的表達(dá)模式，3 h時(shí)升到最高，24 h降到最低，在NaCl模擬的高鹽脅迫下，SoIRL則表現(xiàn)為“揚(yáng)-抑-揚(yáng)”的表達(dá)模式，48 h表達(dá)量升到最高?？梢姺巧锩{迫可以誘導(dǎo)SoIRL的表達(dá)，但不同的非生物脅迫表達(dá)的模式不盡相同。關(guān)于其它植物IRL在不同逆境脅迫下的表達(dá)分析也已有報(bào)道。在ABA處理下銀杏體內(nèi)的GbIRL出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，推測(cè)可能是通過促進(jìn)苯丙烷代謝途徑從而提高下游代謝水平［12］，柚子IRL基因參與應(yīng)答紫外輻射［19］，銀杏在UV-B照射下，GbIRL1表達(dá)量升高，推測(cè)可能與異黃酮的積累有關(guān)［20］，水稻OsIRL在ABA、SA作用下表達(dá)量下調(diào)［18］，擬南芥中的IRL基因被氧化脅迫誘導(dǎo)，編碼產(chǎn)生相應(yīng)蛋白［6］，煙草A622基因能夠被MeJA誘導(dǎo)表達(dá)，但卻被乙烯及其類似物所抑制［21］，銀杏GbIRL在機(jī)械損傷、SA、ABA、ALA誘導(dǎo)下，其表達(dá)量上升，在ETH誘導(dǎo)下表達(dá)量下降［12］。環(huán)境條件會(huì)對(duì)植物的生長產(chǎn)生各種各樣的影響甚至脅迫，為了提高植物對(duì)物理環(huán)境的適應(yīng)性，植物一方面在形態(tài)結(jié)構(gòu)上發(fā)生變化，另一方面在生理生化上發(fā)生變化，而一些次生物質(zhì)則成為后種適應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。在植物耐旱、抗寒和耐鹽性研究中都發(fā)現(xiàn)次生代謝產(chǎn)物在其中發(fā)揮著重要作用［22］。在干旱脅迫下，植物組織中次生代謝產(chǎn)物的濃度常常上升。由于4℃、PEG、NaCl 等對(duì)植物的脅迫與植物遭受寒害、干旱、滲透脅迫的效應(yīng)類似，因此可以推測(cè) SoIRL在甘蔗抗干旱、抗?jié)B透脅迫或者抗氧化脅迫中發(fā)揮某種作用，推測(cè)SoIRL基因可能通過調(diào)節(jié)木質(zhì)素代謝過程對(duì)脅迫產(chǎn)生一定的應(yīng)急反應(yīng)或發(fā)揮其它作用，但是調(diào)控方式和調(diào)控程度在不同物種中表現(xiàn)又有所不同，具體作用需通過進(jìn)一步的試驗(yàn)來探討。

4 結(jié)論

通過研究甘蔗感染RSD后蛋白質(zhì)組的變化，鑒定并克隆出SoIRL。通過qRT-PCR分析研究了SoIRL在RSD病原菌脅迫、甘蔗不同組織及與 4 種非生物脅迫條件下的表達(dá)特性，結(jié)果表明該基因在甘蔗體內(nèi)為組成型表達(dá)，其表達(dá)受RSD病原菌誘導(dǎo)，并參與了甘蔗應(yīng)答RSD過程，也受非生物脅迫的誘導(dǎo)，推測(cè)其在甘蔗抵抗干旱、低溫和高鹽等非生物脅迫的逆境中也發(fā)揮了重要作用。

［1］李楊瑞, 楊麗濤. 20世紀(jì)90年代以來我國甘蔗產(chǎn)業(yè)和科技的新發(fā)展［J］. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2009, 22（5）：1469-1476.

［2］Zerillo MM, Van Sluys MA, Camargo LE, et al. Characterization of

new IS elements and studies of their dispersion in two subspecies of Leifsonia xyli［J］. BMC Microbiology, 2008, 8：127.

［3］Brandalise M, Severino FE, Maluf M P, et al. The promoter of a gene encoding an isoflavone reductase-like protein in coffee（Coffea arabica）drives a stress-responsive expression in leaves［J］. Plant Cell Reports, 2009, 28（11）：1699-1708.

［4］Kajikawa M, Hirai N, Hashimoto T. A PIP-family protein is required for biosynthesis of tobacco alkaloids［J］. Plant Molecular Biology, 2009, 69（3）：287-298.

［5］Ferrer JL, Austin M, Stewart Jr C, et al. Structure and function of enzymes involved in the biosynthesis of phenylpropanoids［J］. Plant Physiology and Biochemistry, 2008, 46（3）：356-370.

［6］Babiychuk E, Kushnir S, Belles-Boix E, et al. Arabidopsis thaliana NADPH oxidoreductase homologs confer tolerance of yeasts toward the thiol-oxidizing drug diamide［J］. Journal of Biological Chemistry, 1995, 270（44）：26224-26231.

［7］Hibi N, Higashiguchi S, Hashimoto T, et al. Gene expression in tobacco low-nicotine mutants［J］. The Plant Cell Online, 1994, 6（5）：723-735.

［8］Lers A, Burd S, Lomaniec E, et al. The expression of a grapefruit gene encoding an isoflavone reductase-like protein is induced in response to UV irradiation［J］. Plant Molecular Biology, 1998, 36（6）：847-856.

［9］Van Eldik G, Ruiter R, Colla P, et al. Expression of an isoflavone reductase-like gene enhanced by pollen tube growth in pistils of Solanum tuberosum［J］. Plant Molecular Biology, 1997, 33（5）：923-929.

［10］郭鐵英. 野生金蕎麥類異黃酮還原酶基因（FcIRL）的克隆與功能的初步研究［D］.重慶：西南大學(xué), 2008.

［11］趙海霞, 李成磊, 白悅辰, 等. 苦蕎類異黃酮還原酶基因（FtlRL）的克隆及序列分析［J］. 食品科學(xué), 2012, 33（11）：210-214.

［12］Cheng H, Li LL, Xu F, et al. Expression patterns of an isoflavone reductase-like gene and its possible roles in secondary metabolism in Ginkgo biloba［J］. Plant Cell Reports, 2013, 32（5）：637-650.

［13］Paiva NL, Edwards R, Sun Y, et al. Stress responses in alfalfa（Medicago sativa L.）11. Molecular cloning and expression of alfalfa isoflavone reductase, a key enzyme of isoflavonoid phytoalexin biosynthesis［J］. Plant Molecular Biology, 1991, 17（4）：653-667.

［14］Hano C, Martin I, Fliniaux O, et al. Pinoresinol-lariciresinol reductase gene expression and secoisolariciresinol diglucoside accumulation in developing flax（Linum usitatissimum）seeds［J］. Planta, 2006, 224（6）：1291-1301.

［15］Turley RB. Expression of a phenylcoumaran benzylic ether reductase-like protein in the ovules of Gossypium hirsutum［J］. Biologia Plantarum, 2008, 52（4）：759-762.

［16］Vander Mijnsbrugge K, Beeckman H, De Rycke R, et al. Phenylcoumaran benzylic ether reductase, a prominent poplar xylem protein, is strongly associated with phenylpropanoid biosynthesis in lignifying cells［J］. Planta, 2000, 211（4）：502-509.

［17］Turley RB. Expression of a phenylcoumaran benzylic ether reductase-like protein in the ovules of Gossypium hirsutum［J］. Biologia Plantarum, 2008, 52（4）：759-762.

［18］Kim ST, Cho KS, Kim SG, et al. A rice isoflavone reductaselike gene, OsIRL, is induced by rice blast fungal elicitor［J］. Molecules & Cells, 2003, 16（2）：224-231.

［19］Min T, Kasahara H, Bedgar D L, et al. Crystal structures of pinoresinol-lariciresinol and phenylcoumaran benzylic ether reductases and their relationship to isoflavone reductases［J］. Journal of Biological Chemistry, 2003, 278（50）：50714-50723.

［20］Xu F, Cai R, Cheng Sǐ, et al. Molecular cloning, characterization and expression of phenylalanine ammonia-lyase gene from Ginkgo biloba［J］. African Journal of Biotechnology, 2008, 7（6）721-729.

［21］Shoji T, Winz R, Iwase T, et al. Expression patterns of two tobacco isoflavone reductase-like genes and their possible roles in secondary metabolism in tobacco［J］. Plant Molecular Biology, 2002, 50（3）：427-440.

［22］段傳人, 王伯初, 徐世榮. 環(huán)境應(yīng)力對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物形成的作用［J］. 重慶大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2003, 26（10）：67-71.

（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning and Expression Analysis of Sugarcane Isoflavone Reductaselike（IRL）Gene

Xie Xiaona1Zhang Xiaoqiu1Shao Min1Zhu Hui1Yang Litao1，2Li Yangrui1，2
（1. College of Agriculture，Guangxi University，State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources，Nanning 530004；2. Sugarcane Research Center，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement（Guangxi），Ministry of Agriculture，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement，Nanning 530007）

The SoIRL gene cDNA sequence was cloned from sugarcane variety GT11 using RT-PCR techniques. The bioinformatics methods were used to analyze the putative amino acid sequence, and Real-time PCR method was used to study the expression of SoIRL gene in different tissues and under different stresses. The results showed that the full-length cDNA of SoIRL（GenBank accession number：KF808324）in sugarcane was cloned. The sequence consists of 1 167 bp with an intact open reading frame of 927 bp, encoding a polypeptide of 303 amino acids. Phylogenetic tree analysis indicated that SoIRL was highlg closely related to IRL of Zea mays. Real-time PCR results showed that the SoIRL expressed in root, stalk and leaf. Furthermore, SoIRL transcription level was induced under the treatment of the bacterial of ratoon stuning diaease, low temperature, PEG, NaCl and ABA stresses, but the expression patterns were different. Gene SoIRL was firstly isolated and characterized from sugarcane（GT11）, which may participate in sugarcane resistance to RSD, and also play a role in the sugarcane resistance to chilling, drought and salt stress environments.

Sugarcane SoIRL Gene cloning Expression analysis

2014-03-27

國家”863”計(jì)劃課題（2013AA102604），國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31360293），國家國際合作項(xiàng)目（2013DFA31600），廣西科技合作與交流計(jì)劃項(xiàng)目（桂科合1347004-2），廣西自然科學(xué)基金創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2011GXNSFF018002），廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012GXNSFDA053011）

謝曉娜，女，博士研究生，研究方向：作物栽培及生理基礎(chǔ)；E-mail：xiaonaxie@163.com

楊麗濤，教授，研究方向：甘蔗生理生化及分子生物學(xué)，E-mail：liyr@gxu.edu.cn；李楊瑞，教授，研究方向：甘蔗，E-mail：liyr@gxaas.net