平海濤王玉萍王東霞周曉潔

（1.甘肅省作物遺傳改良與創(chuàng)新重點實驗室 甘肅省干旱生境作物學(xué)國家重點實驗室培育基地，蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；3. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，蘭州 730070）

馬鈴薯塊莖形成相關(guān)基因STI-LIKE在擬南芥植株發(fā)育中的功能驗證

平海濤1，2王玉萍1，3王東霞1周曉潔1，2

（1.甘肅省作物遺傳改良與創(chuàng)新重點實驗室 甘肅省干旱生境作物學(xué)國家重點實驗室培育基地，蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；3. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，蘭州 730070）

馬鈴薯塊莖的形成涉及一系列基因的表達和關(guān)閉。以馬鈴薯普通栽培品種“大西洋”為試驗材料，采用RT-PCR擴增獲得馬鈴薯STI-LIKE基因全長片段。RT-PCR定量分析表明，該基因在馬鈴薯營養(yǎng)器官中均有表達。生物信息學(xué)分析表明STI-LIKE蛋白具有3個TPR結(jié)構(gòu)域，在高等植物中具有高同源性，是一個普遍存在的蛋白質(zhì)。為驗證STI-LIKE蛋白在擬南芥植株發(fā)育中功能，分別構(gòu)建該基因強啟動子表達載體（pBI121）和干擾載體（pHANNIBAL和pART27），轉(zhuǎn)化擬南芥獲得了兩種載體的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株，同時制備STI-LIKE蛋白抗體驗證轉(zhuǎn)基因植株蛋白表達。研究結(jié)果表明STI-LIKE基因可能參與擬南芥株型發(fā)育過程。

馬鈴薯 STI-LIKE基因 TPR結(jié)構(gòu)域 株型發(fā)育

馬鈴薯塊莖既是無性繁殖的“種子”，也是產(chǎn)量構(gòu)成和營養(yǎng)儲藏器官。塊莖形成和發(fā)育是馬鈴薯植株同化產(chǎn)物的利用及地下器官形態(tài)建成的復(fù)雜過程，不同品種、不同生態(tài)環(huán)境條件下，塊莖形態(tài)、營養(yǎng)成分等各方面均表現(xiàn)出差異，成熟塊莖大小相差可達到100倍［1］。馬鈴薯塊莖發(fā)育是在內(nèi)源生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和外部環(huán)境因素共同影響下相關(guān)基因在發(fā)育過程中程序性表達的結(jié)果，涉及一系列基因的表達與關(guān)閉［2-5］。研究表明，HSP17.7、CONSTANS和CDPK1［6-8］對馬鈴薯塊莖的形成起調(diào)控作用。

擬南芥STI-LIKE蛋白含有TPR和STI1結(jié)構(gòu)域。TPR結(jié)構(gòu)域是一個由34個氨基酸重復(fù)的串聯(lián)結(jié)構(gòu)單元，最初是在研究細胞分裂時發(fā)現(xiàn)的［9］。TPR結(jié)構(gòu)域包含蛋白參與細胞周期、細胞應(yīng)激、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白折疊和蛋白運輸?shù)纫幌盗猩砩磻?yīng)［10-12］。一些TPR結(jié)構(gòu)域包含蛋白可與Hsp90相互作用［13］，起到信號傳導(dǎo)作用。TPR結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)蛋白的相互作用和蛋白質(zhì)復(fù)合體的組裝［14］。STI結(jié)構(gòu)域是熱激蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，存在于蛋白質(zhì)N末端或C末端，介導(dǎo)蛋白質(zhì)和HSP蛋白相結(jié)合［15］。在高光和熱激狀態(tài)下，擬南芥STI蛋白累積量迅速上升［16，17］。STILIKE同源蛋白STI磷酸化蛋白2C與細胞分裂激酶呈負相關(guān)［15］。

在我們前期的研究中發(fā)現(xiàn)，STI-LIKE蛋白在馬鈴薯塊莖的發(fā)育階段中表達量呈上升趨勢，推測其可能在塊莖發(fā)育中起關(guān)鍵作用［18］。由于TPR結(jié)構(gòu)域和STI結(jié)構(gòu)域的功能及STI-LIKE蛋白在細胞周期調(diào)控中的功能，推測STI-LIKE基因可能參與植株發(fā)育過程的調(diào)控。本研究通過構(gòu)建STI-LIKE干擾載體和強啟動子表達載體轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，驗證其在擬南芥生長發(fā)育過程的功能，旨在分析STI-LIKE蛋白在植物發(fā)育中的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

馬鈴薯普通栽培品種“大西洋”和擬南芥（生態(tài)型Columbia）由甘肅省作物遺傳改良與創(chuàng)新重點實驗室提供。

KOD-Plus高 保 真 酶、Target Clone-Plus- A試劑盒購自東洋紡公司，Trizol RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo公司，限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，T載體pMD19-T購自寶生物工程有限公司，pET28原核表達載體購自Novagen公司，pHANNIBAL和pART 27為實驗室保存質(zhì)粒，其他試劑為國產(chǎn)試劑。

1.2 方法

1.2.1 基因的確定 前期在馬鈴薯塊莖發(fā)育過程差異蛋白質(zhì)組研究中發(fā)現(xiàn)STI-LIKE蛋白在塊莖發(fā)育過程中表達豐度上升，可能參與馬鈴薯塊莖的發(fā)育［18］。根據(jù)NCBI的EST數(shù)據(jù)庫確定了馬鈴薯STI-LIKE基因的CDS序列。

1.2.2 RNA提取與cDNA合成 按照Trizol試劑盒的方法提取馬鈴薯塊莖總RNA，以總RNA為模板按照Thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒的方法反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。

1.2.3 引物設(shè)計與目的基因的克隆

1.2.3.1 引物 利用軟件DNAMAN設(shè)計引物，由上海生工合成。目的片段擴增引物35sF和35sR；以RNAixbaF、RNAibamhR、RNAixhoF和 RNAikpnR為RNAi片段擴增引物；以antibodyF和antibody為擴增引物制備抗原。

35sF：aatctagaATGGCCGAAGAAGCTAAGGCCA AAGG，35sR：ttctcgagTTATCTAACTTGCACAATTCCT GC；

RNAixbaF：aatctagaATGGCCGAAGAAGCTAAG GCCAAAGG，RNAibamhR：aaggatccCTGTTGCAAATA ACCCCTTGTACTCG；

RNAixhoF：aactcgagATGGCCGAAGAAGCTAAG GCCAAAGG，RNAikpnR：aaggtaccCTGTTGCAAATAA CCCCTTGTACTCG；

AntibodyF：aactcgagAAAGATTGTGACACAGCTGTTG，AntibodyR：aaggatccGAGTTCCTGATTCTGAGGATC。

1.2.3.2 STI-LIKE基因目的片段擴增 以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，利用PCR反應(yīng)合成目的片段。反應(yīng)體系50 μL、模板2 μL，KOD-plus 0.5 μL、引物（35sF，35sR）各1 μL，buffer 5 μL，dNTP 4 μL，水36.5 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃復(fù)性15 s，68℃延伸2.5 min 35個循環(huán)。RNAi載體目的片段，抗體目的片段制備PCR延伸時間為1 min，其余反應(yīng)體系與目的片段擴增一致。擴增片段以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后測序。

1.2.3.3 STI-LIKE基因生物信息學(xué)分析 利用NCBI數(shù)據(jù)庫和該網(wǎng)站提供的blast工具進行同源蛋白比對分析（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域由NCBI網(wǎng)站預(yù)測給出，蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測利用蛋白專家系統(tǒng)在線工具（http：//www.expasy.org/）完成。

1.2.3.4 STI-LIKE基因過表達載體的構(gòu)建 切膠回收全長片段，酶切連接到pBI121。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿

菌Top 10，挑取白斑克隆PCR鑒定，酶切驗證。

1.2.3.5 STI-LIKE基因RNAi載體構(gòu)建 以酶Xba I、BamH I和Xhol I、Kpn I分別雙酶切目的片段。Xba I、BamH I和Xhol I、Kpn I分別先后雙酶切pHANNIBAL載體，挑取白斑克隆PCR 鑒定。將pHANNIBAL與pART27分別用酶Spe I和Not I雙酶切后將pHANNIBAL酶切片段連接到pART27，挑取白斑克隆PCR 鑒定。

1.2.3.6 STI-LIKE基因表達定量分析 分別提取馬鈴薯塊莖、莖、葉、匍匐莖和根的RNA并定量，并使模板濃度一致，進行RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系，100 ng模板，上下游引物各1 μL，buffer 5 μL，dNTP 4 μL，Taq酶0.5 μL，水36.5 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃復(fù)性15 s，72℃延伸2.5 min，30個循環(huán)。

1.2.3.7 STI-LIKE抗原蛋白表達和純化 對目的蛋白進行同源比對，預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)。選取無跨膜域片段區(qū)作為抗體制備的抗原區(qū)段。以引物（Antibody和AntibodyR）擴增cDNA，XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切目的片段與pET28，連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。挑取白斑克隆PCR 鑒定提質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DE3，誘導(dǎo)后蛋白過鎳離子親和交換柱純化制備抗體。

1.2.4 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化具體方法參照杜培粉［19］進行，以1/2MS+L77培養(yǎng)基重新懸浮利用花藥侵染法侵染花蕾兩次，收獲的擬南芥種子播種于含有50 mg/L卡那霉素的1/2 MS 培養(yǎng)基中，提取12 d 未黃化的幼苗進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 RNA提取與目的基因克隆

馬鈴薯“大西洋”總RNA提取結(jié)果表明RNA（28S、18S、5S）完整無降解。合成總cDNA后稀釋100倍，以引物（35sF，35sR）擴增得到目的片段（圖1）。

圖1 馬鈴薯總RNA提取及目的基因RT-PCR

2.2 生物信息學(xué)分析

同源比對的結(jié)果表明STI-LIKE只存在于高等植物中，低等植物中沒有同源蛋白（圖2）。同源性分析還表明在高等植物中STI-LIKE保守性很高，并且具有3個TPR結(jié)構(gòu)域，其中一個TPR結(jié)構(gòu)域靠近N末端，其它兩個靠近C末端（圖3）。

圖2 馬鈴薯STI-LIKE蛋白同源性分析

圖3 馬鈴薯STI-LIKE蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測

2.3 STI-LIKE基因過表達載體的構(gòu)建

將目的片段連到載體后，挑去白斑克隆，酶切檢測目的片段（1 700 bp）并利用載體通用引物測序，確定連入的目的片段無錯配，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌并侵染擬南芥（圖4）。

圖4 pBI121載體酶切檢測

2.4 STI-LIKE基因的RNAi載體的構(gòu)建

擴增獲得兩條目的片段（圖5-A），分別連接到pHANNIBAL載體。陽性pHANNIBAL載體雙酶切后得到大小相近的兩個片段（圖5-B）。將pHANNIBAL與pART27雙酶切連接后，挑取白斑克隆PCR 鑒定（圖5-C）。測序結(jié)果正確無錯配。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌侵染擬南芥。

圖5 STI-LIKE基因干擾載體的構(gòu)建

2.5 STI-LIKE基因在各器官表達定量分析

定量分析表明，STI-LIKE基因在馬鈴薯各組織器官（無花器官）中都有表達，其中在根中表達量最低（圖6）。

圖6 馬鈴薯各營養(yǎng)器官STI-LIKE基因表達量定量分析

2.6 抗原蛋白表達和純化

小量誘導(dǎo)（圖7-A）表明，IPTG誘導(dǎo)3 h后濃度達到峰值。大量誘導(dǎo)（圖7-B）表明，抗原蛋白主要存在于沉淀中。純化后SDS-PAGE（圖7-C）檢測，純化效果理想，用純化后蛋白制備抗體。

圖7 馬鈴薯STI-LIKE蛋白抗原的小量誘導(dǎo)（A）、大量表達（B）和純化檢測（C）

2.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥表型分析及驗證

對生長3周的轉(zhuǎn)基因植株觀察，結(jié)果（圖8）發(fā)現(xiàn)過表達STI-LIKE基因植株生長和野生型表型相同，而干擾表達STI-LIKE基因植株明顯小于野生型

植株。Western blot（圖9）檢測表明野生型植株與過表達STI-LIKE基因植株的STI-LIKE蛋白表達量無顯著差異，而干擾表達STI-LIKE基因植株中STILIKE蛋白表達量顯著降低，低于1/2野生型植株表達量。

圖8 轉(zhuǎn)STI-LIKE基因擬南芥植株表型分析

圖9 轉(zhuǎn)STI-LIKE基因擬南芥植株免疫印跡分析

3 討論

同源比對的結(jié)果表明STI-LIKE蛋白在高等植物中具有高度保守性，同時也說明其可能具有相似的功能［19］。同時STI-LIKE蛋白不具有信號肽并定位于細胞質(zhì)。3個主要TPR結(jié)構(gòu)域分布在N末端和C末端，表明可能是通過與另外兩個蛋白形成一個三亞基復(fù)合體蛋白質(zhì)的形式實現(xiàn)其功能［14］。對馬鈴薯的根、葉、莖、匍匐莖和塊莖中STI-LIKE表達分析表明該基因并不具有嚴格組織特異性，在馬鈴薯各器官組織中廣泛表達［20］。由此推測該基因?qū)︸R鈴薯塊莖發(fā)育的影響可能是通過調(diào)控共有的代謝通路來影響馬鈴薯塊莖的發(fā)育過程。

對轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的表型分析是植物基因功能驗證模式體系，對過表達和干擾表達轉(zhuǎn)STI-LIKE基因擬南芥植株表型觀察表明，過表達STI-LIKE基因?qū)M南芥發(fā)育無顯著影響，而干擾表達STI-LIKE基因卻能夠使擬南芥植株發(fā)育過程受阻，又由于STI-LIKE蛋白在高等植物中具有高度同源性，推測STI-LIKE基因在擬南芥和馬鈴薯中的功能相同［21］，是高等植物生長發(fā)育所必須的。本研究為STI-LIKE基因在調(diào)節(jié)擬南芥植株發(fā)育和馬鈴薯塊莖發(fā)育的進一步功能驗證奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

參與馬鈴薯塊莖形成的STI-LIKE蛋白具有3個TPR結(jié)構(gòu)域，在高等植物中具有高同源性和保守性，表達不存在組織特異性；過表達STI-LIKE基因?qū)M南芥發(fā)育無影響，干擾表達STI-LIKE基因使擬南芥植株發(fā)育受阻，表明STI-LIKE基因為植物發(fā)育的必需基因。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Functions of Potato Tuber Formation-related Gene STI-LIKE in Phenotype of Arabidopsis thaliana

Ping Haitao1，2Wang Yuping1，3Wang Dongxia1Zhou Xiaojie1，2
（1. Gansu Key Laboratory of Crop Improvement & Germplasm Enhancement，Gansu Provincial Key Laboratory of Aridland Crop Science，Lanzhou 730070；2. College of Life Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070； 3. College of Horticulture, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070）

A series of gene’s expression and silencing were involved in potato tuber formation. The full length of potato STI-LIKE gene was cloned by using the RT-PCR（reverse transcription PCR）method from the potato variety “Atlantic”. The expression of STI-LIKE gene in all potato organs were analyses by real time PCR analysis. The results showed that STI-LIKE gene expressed in all potato organs. The bioinformatics analysis indicated that STI-LIKE protein contains three TPR domains, and the STI-LIKE gene was homologous recombination in higher plants. The expression vector（pBI121）and interference vectors（pHANNIBAL and pART27）were constructed and transferred to Arabidopsis thaliana. The STI-LIKE protein expression level was examined by Western blot with specific antibody. The results indicated that STI-LIKE gene might be associated with the growth and development of seedling of Arabidopsis.

Potato STI-LIKE gene TPR domain Phenotype

2014-04-08

國家自然科學(xué)基金項目（31060063，31260094），甘肅省自然科學(xué)基金項目（0803RJZA0510），甘肅省教育廳高?？蒲袑ｍ棧?002-07），甘肅省財政廳高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費

平海濤，男，碩士研究生，研究方向：作物遺傳育種；E-mail：pinghaitaopht@163.com

王玉萍，女，副教授，作物遺傳育種；E-mail：wangyp@gsau.edu.cn