平海濤王玉萍王東霞周曉潔
(1.甘肅省作物遺傳改良與創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 甘肅省干旱生境作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,蘭州 730070;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,蘭州 730070;3. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,蘭州 730070)
馬鈴薯塊莖形成相關(guān)基因STI-LIKE在擬南芥植株發(fā)育中的功能驗(yàn)證
平海濤1,2王玉萍1,3王東霞1周曉潔1,2
(1.甘肅省作物遺傳改良與創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 甘肅省干旱生境作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,蘭州 730070;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,蘭州 730070;3. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,蘭州 730070)
馬鈴薯塊莖的形成涉及一系列基因的表達(dá)和關(guān)閉。以馬鈴薯普通栽培品種“大西洋”為試驗(yàn)材料,采用RT-PCR擴(kuò)增獲得馬鈴薯STI-LIKE基因全長(zhǎng)片段。RT-PCR定量分析表明,該基因在馬鈴薯營(yíng)養(yǎng)器官中均有表達(dá)。生物信息學(xué)分析表明STI-LIKE蛋白具有3個(gè)TPR結(jié)構(gòu)域,在高等植物中具有高同源性,是一個(gè)普遍存在的蛋白質(zhì)。為驗(yàn)證STI-LIKE蛋白在擬南芥植株發(fā)育中功能,分別構(gòu)建該基因強(qiáng)啟動(dòng)子表達(dá)載體(pBI121)和干擾載體(pHANNIBAL和pART27),轉(zhuǎn)化擬南芥獲得了兩種載體的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株,同時(shí)制備STI-LIKE蛋白抗體驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因植株蛋白表達(dá)。研究結(jié)果表明STI-LIKE基因可能參與擬南芥株型發(fā)育過(guò)程。
馬鈴薯 STI-LIKE基因 TPR結(jié)構(gòu)域 株型發(fā)育
馬鈴薯塊莖既是無(wú)性繁殖的“種子”,也是產(chǎn)量構(gòu)成和營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)藏器官。塊莖形成和發(fā)育是馬鈴薯植株同化產(chǎn)物的利用及地下器官形態(tài)建成的復(fù)雜過(guò)程,不同品種、不同生態(tài)環(huán)境條件下,塊莖形態(tài)、營(yíng)養(yǎng)成分等各方面均表現(xiàn)出差異,成熟塊莖大小相差可達(dá)到100倍[1]。馬鈴薯塊莖發(fā)育是在內(nèi)源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)和外部環(huán)境因素共同影響下相關(guān)基因在發(fā)育過(guò)程中程序性表達(dá)的結(jié)果,涉及一系列基因的表達(dá)與關(guān)閉[2-5]。研究表明,HSP17.7、CONSTANS和CDPK1[6-8]對(duì)馬鈴薯塊莖的形成起調(diào)控作用。
擬南芥STI-LIKE蛋白含有TPR和STI1結(jié)構(gòu)域。TPR結(jié)構(gòu)域是一個(gè)由34個(gè)氨基酸重復(fù)的串聯(lián)結(jié)構(gòu)單元,最初是在研究細(xì)胞分裂時(shí)發(fā)現(xiàn)的[9]。TPR結(jié)構(gòu)域包含蛋白參與細(xì)胞周期、細(xì)胞應(yīng)激、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白折疊和蛋白運(yùn)輸?shù)纫幌盗猩砩磻?yīng)[10-12]。一些TPR結(jié)構(gòu)域包含蛋白可與Hsp90相互作用[13],起到信號(hào)傳導(dǎo)作用。TPR結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)蛋白的相互作用和蛋白質(zhì)復(fù)合體的組裝[14]。STI結(jié)構(gòu)域是熱激蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域,存在于蛋白質(zhì)N末端或C末端,介導(dǎo)蛋白質(zhì)和HSP蛋白相結(jié)合[15]。在高光和熱激狀態(tài)下,擬南芥STI蛋白累積量迅速上升[16,17]。STILIKE同源蛋白STI磷酸化蛋白2C與細(xì)胞分裂激酶呈負(fù)相關(guān)[15]。
在我們前期的研究中發(fā)現(xiàn),STI-LIKE蛋白在馬鈴薯塊莖的發(fā)育階段中表達(dá)量呈上升趨勢(shì),推測(cè)其可能在塊莖發(fā)育中起關(guān)鍵作用[18]。由于TPR結(jié)構(gòu)域和STI結(jié)構(gòu)域的功能及STI-LIKE蛋白在細(xì)胞周期調(diào)控中的功能,推測(cè)STI-LIKE基因可能參與植株發(fā)育過(guò)程的調(diào)控。本研究通過(guò)構(gòu)建STI-LIKE干擾載體和強(qiáng)啟動(dòng)子表達(dá)載體轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥,驗(yàn)證其在擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的功能,旨在分析STI-LIKE蛋白在植物發(fā)育中的功能。
1.1 材料
馬鈴薯普通栽培品種“大西洋”和擬南芥(生態(tài)型Columbia)由甘肅省作物遺傳改良與創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。
KOD-Plus高 保 真 酶、Target Clone-Plus- A試劑盒購(gòu)自東洋紡公司,Trizol RNA提取試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Thermo公司,限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司,T載體pMD19-T購(gòu)自寶生物工程有限公司,pET28原核表達(dá)載體購(gòu)自Novagen公司,pHANNIBAL和pART 27為實(shí)驗(yàn)室保存質(zhì)粒,其他試劑為國(guó)產(chǎn)試劑。
1.2 方法
1.2.1 基因的確定 前期在馬鈴薯塊莖發(fā)育過(guò)程差異蛋白質(zhì)組研究中發(fā)現(xiàn)STI-LIKE蛋白在塊莖發(fā)育過(guò)程中表達(dá)豐度上升,可能參與馬鈴薯塊莖的發(fā)育[18]。根據(jù)NCBI的EST數(shù)據(jù)庫(kù)確定了馬鈴薯STI-LIKE基因的CDS序列。
1.2.2 RNA提取與cDNA合成 按照Trizol試劑盒的方法提取馬鈴薯塊莖總RNA,以總RNA為模板按照Thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒的方法反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。
1.2.3 引物設(shè)計(jì)與目的基因的克隆
1.2.3.1 引物 利用軟件DNAMAN設(shè)計(jì)引物,由上海生工合成。目的片段擴(kuò)增引物35sF和35sR;以RNAixbaF、RNAibamhR、RNAixhoF和 RNAikpnR為RNAi片段擴(kuò)增引物;以antibodyF和antibody為擴(kuò)增引物制備抗原。
35sF:aatctagaATGGCCGAAGAAGCTAAGGCCA AAGG,35sR:ttctcgagTTATCTAACTTGCACAATTCCT GC;
RNAixbaF:aatctagaATGGCCGAAGAAGCTAAG GCCAAAGG,RNAibamhR:aaggatccCTGTTGCAAATA ACCCCTTGTACTCG;
RNAixhoF:aactcgagATGGCCGAAGAAGCTAAG GCCAAAGG,RNAikpnR:aaggtaccCTGTTGCAAATAA CCCCTTGTACTCG;
AntibodyF:aactcgagAAAGATTGTGACACAGCTGTTG,AntibodyR:aaggatccGAGTTCCTGATTCTGAGGATC。
1.2.3.2 STI-LIKE基因目的片段擴(kuò)增 以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板,利用PCR反應(yīng)合成目的片段。反應(yīng)體系50 μL、模板2 μL,KOD-plus 0.5 μL、引物(35sF,35sR)各1 μL,buffer 5 μL,dNTP 4 μL,水36.5 μL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s,55℃復(fù)性15 s,68℃延伸2.5 min 35個(gè)循環(huán)。RNAi載體目的片段,抗體目的片段制備PCR延伸時(shí)間為1 min,其余反應(yīng)體系與目的片段擴(kuò)增一致。擴(kuò)增片段以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后測(cè)序。
1.2.3.3 STI-LIKE基因生物信息學(xué)分析 利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)和該網(wǎng)站提供的blast工具進(jìn)行同源蛋白比對(duì)分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域由NCBI網(wǎng)站預(yù)測(cè)給出,蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)利用蛋白專(zhuān)家系統(tǒng)在線(xiàn)工具(http://www.expasy.org/)完成。
1.2.3.4 STI-LIKE基因過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建 切膠回收全長(zhǎng)片段,酶切連接到pBI121。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿
菌Top 10,挑取白斑克隆PCR鑒定,酶切驗(yàn)證。
1.2.3.5 STI-LIKE基因RNAi載體構(gòu)建 以酶Xba I、BamH I和Xhol I、Kpn I分別雙酶切目的片段。Xba I、BamH I和Xhol I、Kpn I分別先后雙酶切pHANNIBAL載體,挑取白斑克隆PCR 鑒定。將pHANNIBAL與pART27分別用酶Spe I和Not I雙酶切后將pHANNIBAL酶切片段連接到pART27,挑取白斑克隆PCR 鑒定。
1.2.3.6 STI-LIKE基因表達(dá)定量分析 分別提取馬鈴薯塊莖、莖、葉、匍匐莖和根的RNA并定量,并使模板濃度一致,進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系,100 ng模板,上下游引物各1 μL,buffer 5 μL,dNTP 4 μL,Taq酶0.5 μL,水36.5 μL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s,55℃復(fù)性15 s,72℃延伸2.5 min,30個(gè)循環(huán)。
1.2.3.7 STI-LIKE抗原蛋白表達(dá)和純化 對(duì)目的蛋白進(jìn)行同源比對(duì),預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)。選取無(wú)跨膜域片段區(qū)作為抗體制備的抗原區(qū)段。以引物(Antibody和AntibodyR)擴(kuò)增cDNA,XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切目的片段與pET28,連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。挑取白斑克隆PCR 鑒定提質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DE3,誘導(dǎo)后蛋白過(guò)鎳離子親和交換柱純化制備抗體。
1.2.4 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化具體方法參照杜培粉[19]進(jìn)行,以1/2MS+L77培養(yǎng)基重新懸浮利用花藥侵染法侵染花蕾兩次,收獲的擬南芥種子播種于含有50 mg/L卡那霉素的1/2 MS 培養(yǎng)基中,提取12 d 未黃化的幼苗進(jìn)行檢測(cè)。
2.1 RNA提取與目的基因克隆
馬鈴薯“大西洋”總RNA提取結(jié)果表明RNA(28S、18S、5S)完整無(wú)降解。合成總cDNA后稀釋100倍,以引物(35sF,35sR)擴(kuò)增得到目的片段(圖1)。
圖1 馬鈴薯總RNA提取及目的基因RT-PCR
2.2 生物信息學(xué)分析
同源比對(duì)的結(jié)果表明STI-LIKE只存在于高等植物中,低等植物中沒(méi)有同源蛋白(圖2)。同源性分析還表明在高等植物中STI-LIKE保守性很高,并且具有3個(gè)TPR結(jié)構(gòu)域,其中一個(gè)TPR結(jié)構(gòu)域靠近N末端,其它兩個(gè)靠近C末端(圖3)。
圖2 馬鈴薯STI-LIKE蛋白同源性分析
圖3 馬鈴薯STI-LIKE蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)
2.3 STI-LIKE基因過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建
將目的片段連到載體后,挑去白斑克隆,酶切檢測(cè)目的片段(1 700 bp)并利用載體通用引物測(cè)序,確定連入的目的片段無(wú)錯(cuò)配,轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌并侵染擬南芥(圖4)。
圖4 pBI121載體酶切檢測(cè)
2.4 STI-LIKE基因的RNAi載體的構(gòu)建
擴(kuò)增獲得兩條目的片段(圖5-A),分別連接到pHANNIBAL載體。陽(yáng)性pHANNIBAL載體雙酶切后得到大小相近的兩個(gè)片段(圖5-B)。將pHANNIBAL與pART27雙酶切連接后,挑取白斑克隆PCR 鑒定(圖5-C)。測(cè)序結(jié)果正確無(wú)錯(cuò)配。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌侵染擬南芥。
圖5 STI-LIKE基因干擾載體的構(gòu)建
2.5 STI-LIKE基因在各器官表達(dá)定量分析
定量分析表明,STI-LIKE基因在馬鈴薯各組織器官(無(wú)花器官)中都有表達(dá),其中在根中表達(dá)量最低(圖6)。
圖6 馬鈴薯各營(yíng)養(yǎng)器官STI-LIKE基因表達(dá)量定量分析
2.6 抗原蛋白表達(dá)和純化
小量誘導(dǎo)(圖7-A)表明,IPTG誘導(dǎo)3 h后濃度達(dá)到峰值。大量誘導(dǎo)(圖7-B)表明,抗原蛋白主要存在于沉淀中。純化后SDS-PAGE(圖7-C)檢測(cè),純化效果理想,用純化后蛋白制備抗體。
圖7 馬鈴薯STI-LIKE蛋白抗原的小量誘導(dǎo)(A)、大量表達(dá)(B)和純化檢測(cè)(C)
2.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥表型分析及驗(yàn)證
對(duì)生長(zhǎng)3周的轉(zhuǎn)基因植株觀察,結(jié)果(圖8)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)STI-LIKE基因植株生長(zhǎng)和野生型表型相同,而干擾表達(dá)STI-LIKE基因植株明顯小于野生型
植株。Western blot(圖9)檢測(cè)表明野生型植株與過(guò)表達(dá)STI-LIKE基因植株的STI-LIKE蛋白表達(dá)量無(wú)顯著差異,而干擾表達(dá)STI-LIKE基因植株中STILIKE蛋白表達(dá)量顯著降低,低于1/2野生型植株表達(dá)量。
圖8 轉(zhuǎn)STI-LIKE基因擬南芥植株表型分析
圖9 轉(zhuǎn)STI-LIKE基因擬南芥植株免疫印跡分析
同源比對(duì)的結(jié)果表明STI-LIKE蛋白在高等植物中具有高度保守性,同時(shí)也說(shuō)明其可能具有相似的功能[19]。同時(shí)STI-LIKE蛋白不具有信號(hào)肽并定位于細(xì)胞質(zhì)。3個(gè)主要TPR結(jié)構(gòu)域分布在N末端和C末端,表明可能是通過(guò)與另外兩個(gè)蛋白形成一個(gè)三亞基復(fù)合體蛋白質(zhì)的形式實(shí)現(xiàn)其功能[14]。對(duì)馬鈴薯的根、葉、莖、匍匐莖和塊莖中STI-LIKE表達(dá)分析表明該基因并不具有嚴(yán)格組織特異性,在馬鈴薯各器官組織中廣泛表達(dá)[20]。由此推測(cè)該基因?qū)︸R鈴薯塊莖發(fā)育的影響可能是通過(guò)調(diào)控共有的代謝通路來(lái)影響馬鈴薯塊莖的發(fā)育過(guò)程。
對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的表型分析是植物基因功能驗(yàn)證模式體系,對(duì)過(guò)表達(dá)和干擾表達(dá)轉(zhuǎn)STI-LIKE基因擬南芥植株表型觀察表明,過(guò)表達(dá)STI-LIKE基因?qū)M南芥發(fā)育無(wú)顯著影響,而干擾表達(dá)STI-LIKE基因卻能夠使擬南芥植株發(fā)育過(guò)程受阻,又由于STI-LIKE蛋白在高等植物中具有高度同源性,推測(cè)STI-LIKE基因在擬南芥和馬鈴薯中的功能相同[21],是高等植物生長(zhǎng)發(fā)育所必須的。本研究為STI-LIKE基因在調(diào)節(jié)擬南芥植株發(fā)育和馬鈴薯塊莖發(fā)育的進(jìn)一步功能驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)。
參與馬鈴薯塊莖形成的STI-LIKE蛋白具有3個(gè)TPR結(jié)構(gòu)域,在高等植物中具有高同源性和保守性,表達(dá)不存在組織特異性;過(guò)表達(dá)STI-LIKE基因?qū)M南芥發(fā)育無(wú)影響,干擾表達(dá)STI-LIKE基因使擬南芥植株發(fā)育受阻,表明STI-LIKE基因?yàn)橹参锇l(fā)育的必需基因。
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(責(zé)任編輯 李楠)
Functions of Potato Tuber Formation-related Gene STI-LIKE in Phenotype of Arabidopsis thaliana
Ping Haitao1,2Wang Yuping1,3Wang Dongxia1Zhou Xiaojie1,2
(1. Gansu Key Laboratory of Crop Improvement & Germplasm Enhancement,Gansu Provincial Key Laboratory of Aridland Crop Science,Lanzhou 730070;2. College of Life Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070; 3. College of Horticulture, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070)
A series of gene’s expression and silencing were involved in potato tuber formation. The full length of potato STI-LIKE gene was cloned by using the RT-PCR(reverse transcription PCR)method from the potato variety “Atlantic”. The expression of STI-LIKE gene in all potato organs were analyses by real time PCR analysis. The results showed that STI-LIKE gene expressed in all potato organs. The bioinformatics analysis indicated that STI-LIKE protein contains three TPR domains, and the STI-LIKE gene was homologous recombination in higher plants. The expression vector(pBI121)and interference vectors(pHANNIBAL and pART27)were constructed and transferred to Arabidopsis thaliana. The STI-LIKE protein expression level was examined by Western blot with specific antibody. The results indicated that STI-LIKE gene might be associated with the growth and development of seedling of Arabidopsis.
Potato STI-LIKE gene TPR domain Phenotype
2014-04-08
國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31060063,31260094),甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(0803RJZA0510),甘肅省教育廳高??蒲袑?zhuān)項(xiàng)(1002-07),甘肅省財(cái)政廳高?;究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)
平海濤,男,碩士研究生,研究方向:作物遺傳育種;E-mail:pinghaitaopht@163.com
王玉萍,女,副教授,作物遺傳育種;E-mail:wangyp@gsau.edu.cn