楊松楠王姣陳宗祥田新杰張靜文龍艷裴新梧袁潛華

（1. 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海口 570228；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

普通野生稻miR160f的克隆和功能分析

楊松楠1王姣2陳宗祥2田新杰1張靜文2龍艷2裴新梧2袁潛華1

（1. 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，?？?570228；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

MicroRNAs是一類在調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄后表達中起重要作用的非編碼RNA。miR160通過調(diào)節(jié)生長素響應(yīng)因子（ARF）參與根細(xì)胞的分裂和分化，從而影響根的發(fā)育。克隆了普通野生稻miR160f基因，并將其轉(zhuǎn)入擬南芥中鑒定功能。結(jié)果表明，過表達miR160f的擬南芥蓮座葉的數(shù)量減少，抽薹時間縮短，開花的時間提前。qPCR檢測顯示miR160f的靶基因ARF10、ARF16及ARF17在過表達擬南芥植株中的表達下調(diào)，而ARF10和ARF16蛋白的缺失或減少會導(dǎo)致根冠細(xì)胞分化受阻、分裂失控，并導(dǎo)致根尖干細(xì)胞群的異位擴大，因此可以表明miR160不僅影響根的發(fā)育，還可能與水稻的開花時間相關(guān)。

miRNA 花期 普通野生稻 擬南芥 表達載體

MicroRNAs是一類短的非編碼單鏈RNAs，長度范圍在16-29 nt，以20-21 nt居多［1］，最早發(fā)現(xiàn)于線蟲C.elegans中，廣泛存在于動植物和一些病毒中［2］。越來越多的證據(jù)顯示miRNA在許多生物的代謝過程中起重要作用，包括組織識別、發(fā)育時序調(diào)控、對環(huán)境脅迫的應(yīng)答等［3］。然而，miRNA并不直接控制植物的生長和發(fā)育，其功能是通過對它所作用的靶基因mRNA的切割或抑制蛋白翻譯實現(xiàn)［4］。miRNA參與植物開花及花器官發(fā)育，與植物激素信號傳導(dǎo)、葉片發(fā)育、植物組織器官形態(tài)改變、營養(yǎng)脅迫、抗逆境脅迫等多種因素相關(guān)［5］。

普通野生稻（O. rufipogon）被認(rèn)為是亞洲栽培

稻（O. sativa）的祖先種，廣泛分布于中國、東南亞和南亞地區(qū)。其中，中國南方地區(qū)是普通野生稻的發(fā)源地之一，具有豐富的遺傳多樣性和多種優(yōu)良特性，是栽培稻遺傳改良的寶貴資源［6］。目前，對栽培稻miRNA的克隆與功能驗證已有許多報道，但對普通野生稻miRNA的研究報道較少［7，8］。其中miR160家族與植物生長素信號有關(guān)，植物生長素誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄通過植物生長素響應(yīng)因子（ARF）促成側(cè)根的發(fā)育，因此miR160家族對側(cè)根的起始和種子的發(fā)育起調(diào)節(jié)作用，其家族包括眾多成員，如 miR160a，b，c，d，e，f，g，h，i，m，n，o。Mallory等［9］證實，中斷miR160的轉(zhuǎn)錄，其靶基因ARF10、ARF16、ARF17 mRNA 的表達水平均有增加，從而改變生長素誘導(dǎo)因子GH3-like基因的表達，并影響另一生長素效應(yīng)因子DR5的正常功能，導(dǎo)致植株的發(fā)育受到嚴(yán)重影響，如產(chǎn)生鋸齒狀葉片或卷縮狀葉片，花形態(tài)改變和可育性降低等。Kantar等［10］的研究結(jié)果表明，擬南芥miR160的靶基因是ARF10、16和17，其中ARF10和16共同參與了根冠細(xì)胞的分化，并在根冠處特異表達［11］。在地上部分，miR-160通過對3個靶基因負(fù)調(diào)控，參與了生長素初始應(yīng)答基因的表達調(diào)控，促進了細(xì)胞的分裂和增大［12］。在對水稻的研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因miR160a植株在ABA的處理下其幼苗根部生長受到抑制，而且從孕穗期開始，轉(zhuǎn)基因植株的分蘗角度增大，株型發(fā)生改變［13］。在普通野生稻中，還沒有相關(guān)miR160的研究，本研究克隆普通野生稻中的miR160f，構(gòu)建過表達載體轉(zhuǎn)化擬南芥，并進行功能分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 植物表達載體構(gòu)建與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 根據(jù)本實驗室前期構(gòu)建的廣東高州普通野生稻sRNA文庫中的miR160f莖環(huán)前體序列［8］，以miR160f莖環(huán)前體為中心的基因組DNA序列為模板，設(shè)計帶酶切位點Bgl（GAAGATCTTC）的上游引物和BstEⅡ（GGGTTACCC）的下游引物（上游引物：GAAGATCTTCGGATTAACGCTGCCTGGCTCC，下游引物：GGGTTACCCGAGCAAACCCTGCATGACTC）。以提取的普通野生稻葉片DNA為模板克隆得到165 bp的片段pre-miR160f。通過測序驗證后再克隆到表達載體pCAMBIA3301上，命名為：pmiR160f-bar。利用花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，浸染后的擬南芥收取種子后，播種于含50 μg/mL Bialaphos Sodium Salt的MS選擇培養(yǎng)基用于篩選轉(zhuǎn)基因植株。對T2代植株進行形態(tài)學(xué)觀察。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥分子檢測 提取野生型及轉(zhuǎn)基因擬南芥基因組DNA，設(shè)計bar基因的引物（上游引物：TCAAATTCTCGGTGACGGGCA，下游引物：ATGAGCCCAGAACGACGCCC），檢測表達載體是否轉(zhuǎn)入擬南芥中。為了進一步證實轉(zhuǎn)基因植株中miR160f成熟體是否表達，設(shè)計莖環(huán)RT反向引物（CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCCGGCAATTCAGTT GAGTGGCATTC）進行RNA反轉(zhuǎn)錄，再利用miR160f上游引物（ACACTCCAGCTGGGTGCCTGGCTC）和下游引物（AACTGGTGTCGTGGAG）進行miR160f成熟體的擴增。成熟體莖環(huán)RT-PCR步驟參照Feng等［14］，擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的表型觀察 經(jīng)選擇培養(yǎng)基篩選存活的T1代陽性植株收取種子，與野生型種子同時播種在營養(yǎng)土中于光照16 h/黑暗8 h、光照強度為180 μmol/ （m2·s）、溫度為22℃、相對濕度為70%的條件下進行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株各選取32株進行表型觀察，并對首次抽薹時間、首次抽薹時蓮座葉的數(shù)目及首次開花時的植株高度作統(tǒng)計分析。

1.2.4 miR160f二級結(jié)構(gòu)及靶基因預(yù)測 使用The mfold Web Server在線軟件預(yù)測普通野生稻miR160f的二級結(jié)構(gòu)，psRNATarget（A Plant Small RNA Target Analysis Server）在線軟件預(yù)測普通野生稻miR160f在擬南芥數(shù)據(jù)庫中的靶基因。普通野生稻miR160f成熟序列被提交到psRNATarget在線軟件并采用默認(rèn)參數(shù)，miRNA與其靶基因錯配數(shù)等于或少于3個。

1.2.5 靶基因表達分析 分別設(shè)計用于qPCR分析的miRNA靶基因和內(nèi)標(biāo)基因Actin的特異性引物。引物設(shè)計方法及qPCR方法參照Nuria Hierro等［15］。在ABI 7500 Real Time System 上，使用SYBR?Select Mix進行靶基因的qPCR 反應(yīng)，檢測相關(guān)miRNA靶基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥中的表達情況。

2 結(jié)果

2.1 普通野生稻miR160f前體克隆及載體構(gòu)建

聚合物鉆井液配方1#4%BTJ+0.2%QYHN+0.2%TSN+0.4%MAN104+0.4%MAN101+0.5%FPAY+2%SMP-1+1%SPNH+2%KR-n+BA；

通過PCR從普通野生稻基因組DNA中擴增得到長度為165 bp的普通野生稻miR160f前體，使用mfold軟件預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)（圖1），普通野生稻miR160f前體形成完美的二級結(jié)構(gòu)。將所測序列與在線軟件預(yù)測的普通野生稻miR160f的二級結(jié)構(gòu)序列進行比對，相似性為100%（圖2）。將普通野生稻miR160f前體克隆到pCAMBIA3301上（圖3）。

2.2 miR160f轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測

以轉(zhuǎn)基因擬南芥DNA為模板，在轉(zhuǎn)基因植株中擴增出589 bp的bar基因（圖4-A），說明表達載體成功轉(zhuǎn)入擬南芥植株中。為了檢測轉(zhuǎn)基因植株中是否有普通野生稻miR160f的表達，以轉(zhuǎn)基因擬南芥RNA為模板，對成熟miR160f進行擴增，在轉(zhuǎn)基因植株中擴增出分子量大小為70 bp左右的條帶（圖4-B），說明轉(zhuǎn)基因植株中有普通野生稻miR160f的表達。

圖1 普通野生稻miR160f前體二級結(jié)構(gòu)

圖3 pmiR160f-bar載體圖譜

圖4 miR160f轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測

2.3 miR160f轉(zhuǎn)基因植株的表型觀察

使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法將構(gòu)建好的pmiR160f-bar植物表達載體轉(zhuǎn)入擬南芥植株，待植株成熟后收集種子，在選擇培養(yǎng)基中篩選出轉(zhuǎn)基因幼苗，然后移栽到營養(yǎng)土中，在光照16 h/黑暗8 h、光照強度為180 μmol/ （m2·s）、溫度為22℃、相對濕度為70%的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。成熟后收獲種子，野生型和轉(zhuǎn)基因植株各種植32株，對其首次抽薹時蓮座葉數(shù)目、首次抽薹時間以及首次開花時植株高度進行觀測統(tǒng)計，并作3次生物學(xué)重復(fù)，結(jié)果（表1）表明，轉(zhuǎn)pmiR160f-bar基因擬南芥蓮座葉比野生型平均少2片，抽薹時間平均提前1 d。由于蓮座葉數(shù)目與植物開花存在數(shù)量上的關(guān)系，蓮座葉數(shù)少會造成植物營養(yǎng)期縮短花期提前，這表明miR160f可能

與植物開花時間相關(guān)。

表1 miR160f轉(zhuǎn)基因植株的表型分析

2.4 miR160f在擬南芥中的靶基因預(yù)測

將miR160f成熟體序列提交至psRNATarget在線軟件系統(tǒng)預(yù)測其靶基因，所預(yù)測的靶基因大多為生長素響應(yīng)因子（ARF），如ARF10、ARF16、ARF17（表2）。ARF家族成員主要在植物生長發(fā)育中起重要作用［16］，生長素的作用表現(xiàn)在3個層次：（1）植株水平，如植物的向性運動、頂端優(yōu)勢、側(cè)根發(fā)生等；（2）細(xì)胞水平，如細(xì)胞伸長、細(xì)胞分裂及細(xì)胞分化等；（3）分子水平，如對生長素快速響應(yīng)的基因的表達。

表2 miR160f在擬南芥中的靶基因預(yù)測

2.5 miR160f靶基因表達分析

由于轉(zhuǎn)基因株系中miR160f超表達，被miR160f負(fù)調(diào)控的靶基因表達下調(diào)。在擬南芥野生型及轉(zhuǎn)miR160f基因擬南芥中檢測其靶基因表達，結(jié)果（圖5）表明ARF17在轉(zhuǎn)基因株系中表現(xiàn)出明顯的下調(diào)，ARF10、ARF16在轉(zhuǎn)基因株系中出現(xiàn)少許下調(diào)。以往的研究表明，ARF16蛋白調(diào)控植物根的發(fā)育［10，17］，ARF家族受miR160調(diào)節(jié)，miR160與植物根發(fā)育相關(guān)。在本項研究中發(fā)現(xiàn)了將普通野生稻中的miR160f轉(zhuǎn)入擬南芥后，出現(xiàn)蓮座葉數(shù)減少，抽薹時間縮短的性狀變化，這說明miR160f可能也與植物的開花時間相關(guān)。

3 討論

目前已在擬南芥、栽培稻、玉米和大麥等多種植物中發(fā)現(xiàn)了miR160基因的家族成員，這些家族成員共有12個，包括miR160a、b、c、d、e、f、g、h、i、m、 n和o，其中miR160f在栽培稻、小立碗蘚、毛果楊、高粱、豇豆和玉米中被發(fā)現(xiàn)［18］。miR160成熟體在不同物種中高度保守，這意味著miR160在植物生長發(fā)育上發(fā)揮重要的功能。

圖5 miR160f靶基因表達分析

本試驗利用過表達的方法將普通野生稻花期相關(guān)miRNA的前體基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，使其在擬南芥中高效表達來研究其功能。試驗中將帶有miRNA前體基因的表達載體通過農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)轉(zhuǎn)入擬南芥基因組中，獲得過表達的轉(zhuǎn)基因植株，為進一步研究miRNA的功能提供了試驗系統(tǒng)。關(guān)于如何選取miRNA前體基因莖環(huán)結(jié)構(gòu)的長度，有的研究中選取含莖環(huán)1 kb以上的片段進行轉(zhuǎn)化［19］，也有研究報道稱僅選取莖環(huán)臨近處即可［20］，本研究采用后者。在進行引物設(shè)計時，為了防止原來的莖環(huán)結(jié)構(gòu)在PCR退火時阻礙引物與模板的結(jié)合，本研究在設(shè)計引物時是從莖環(huán)結(jié)構(gòu)兩側(cè)外約10 bp處開始，然后通過mfold軟件分析發(fā)現(xiàn)，擴增片段能夠較好地維持原來的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，即不會影響天然miRNA的產(chǎn)生。當(dāng)獲得過表達miRNA植株后，通過對其預(yù)測的靶基因進行qPCR，來檢測相應(yīng)靶基因的表達量，從而確定該miRNA到底是作用于哪一個靶基因及該靶基因的具體功能。

許多研究報導(dǎo)了miR160調(diào)控植物的側(cè)根起始和種子發(fā)育［21］，本研究首次在普通野生稻中克隆得到miR160f的前體，轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，結(jié)果表明轉(zhuǎn)miR160f擬南芥植株表現(xiàn)出蓮座葉數(shù)目減少、首次抽薹時間縮短等性狀變化，由于蓮座葉數(shù)目與植物開花存在數(shù)量上的關(guān)系，蓮座葉減少會造成植物營養(yǎng)期縮短、花期提前，這說明miR160f還可能

參與植物花期的調(diào)控。

同時，我們利用生物信息學(xué)的方法預(yù)測了miR160f在擬南芥中的靶基因，通過對野生型與轉(zhuǎn)miR160f擬南芥中的靶基因ARF家族成員ARF10、ARF16和ARF17進行表達分析，發(fā)現(xiàn)它們的表達均下調(diào)，其中ARF17下調(diào)表達最為明顯，而ARF家族成員多與植物根的發(fā)育相關(guān)，因此證明了miR160f確實參與植物根的發(fā)育。

4 結(jié)論

本研究克隆了普通野生稻miR160f前體基因并預(yù)測出二級結(jié)構(gòu)，在擬南芥中表達miR160f，結(jié)果表明與野生型擬南芥相比，轉(zhuǎn)miR160f擬南芥植株蓮座葉數(shù)目減少，抽薹時間縮短，普通野生稻miR160f在擬南芥中存在3個靶基因：ARF10、ARF16和ARF17，通過對靶基因進行qPCR發(fā)現(xiàn)，ARF17下調(diào)表達最為顯著。表明miR160不僅影響根的發(fā)育，還可能與水稻的開花時間相關(guān)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Clone and Function Analysis MiR160f in Common Wild Rice（Oryza rufipogon Griff.）

Yang Songnan1Wang Jiao2Chen Zongxiang2Tian Xinjie1Zhang Jingwen2Long Yan2Pei Xinwu2Yuan Qianhua1
（1. College of Agriculture，Hainan University，Haikou 570228；2. Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

MicroRNAs are a class of non-coding RNAs involved in post- transcriptional control of gene expression. Former study on Arabidopsis thaliana reveals that miR160 involves in root cell division and differentiation by regulating auxin response factors（ARF）thus influence the root development. This study cloned miR160f gene from common wild rice and transferred into Arabidopsis thaliana to identify its function. The results showed that over-expression of miR160f decreased the number of rosette leaves, shortened bloting time, leading to early flowering. RT-PCR showed the expressions of gene ARF10，ARF16 and ARF17 are down-regulation caused by miR160f in transgenic Arabidopsis thaliana, while the deficiency of ARF10 and ARF16 protein can inhibit root cap cell differentiation, lose control of cell division and lead to ectopic expansion of apical stem cell populations Therefore, the result demonstrates that miR160 not only influence on root development, but also may influence flowering time of common wild rice.

MiRNA Flowering time Common wild rice Arabidopsis thaliana Expression vector

2014-04-22

國家轉(zhuǎn)基因重大專項2014ZX08011-001，公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項經(jīng)費項目（201403075），教育部熱帶作物新品種選育工程中心聯(lián)合資助項目

楊松楠，男，碩士研究生，研究方向：植物基因工程；E-mail：ysnysn@126.com

裴新梧，研究員，研究方向：植物基因工程；E-mail：peixw@mail.caas.net.cn

袁潛華，研究員，研究方向：作物栽培、農(nóng)業(yè)生物技術(shù)；E-mail：qhyuan@163.com