呂淑芳江靜

（1.河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，開封 475004；2.河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，洛陽(yáng) 471003）

擬南芥乙烯合成酶ACS基因家族研究進(jìn)展

呂淑芳1，2江靜1

（1.河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，開封 475004；2.河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，洛陽(yáng) 471003）

1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC）合酶（ACC synthase，ACS）是乙烯生物合成的限速酶。ACS酶活性是ACC和乙烯調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)，其酶活性調(diào)節(jié)主要涉及轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)、翻譯后修飾、酶高級(jí)結(jié)構(gòu)形成、生化特性等方面。簡(jiǎn)要總結(jié)擬南芥ACS酶活性研究進(jìn)展。

ACS酶 活性調(diào)控 乙烯

植物激素乙烯（ethylene）是氣體小分子（C2H4），不僅調(diào)節(jié)植物種子萌發(fā)、細(xì)胞伸長(zhǎng)、組織分化、葉片和花的衰老脫落、果實(shí)成熟［1-8］等生長(zhǎng)發(fā)育過程，還調(diào)控生物脅迫和非生物脅迫［9-11］等應(yīng)答反應(yīng)。多種逆境因子都可以增加乙烯生物合成量，并因此改變植物抵抗和耐受逆境脅迫能力。

植物乙烯生物合成是一系列酶促反應(yīng)過程：首先腺苷蛋氨酸合成酶催化蛋氨酸與腺苷酸（AMP）反應(yīng)生成腺苷蛋氨酸（SAM）；然后，SAM由ACC合酶催化生成ACC；最后，ACC氧化酶（ACC oxidase，ACO）催化ACC發(fā)生氧化反應(yīng)而生成乙烯［11-14］。其中，ACS催化SAM向ACC轉(zhuǎn)化是關(guān)鍵的限速步驟，所以ACS被認(rèn)為是ACC和乙烯生物合成的限速酶?，F(xiàn)已從番茄、冬瓜、蘋果、康乃馨、筍瓜、豇豆及擬南芥中克隆到一些ACS基因［15-18］，這些同源的ACS酶活性調(diào)節(jié)過程各種各樣。本研究著重介紹模式植物擬南芥ACS酶活性及其調(diào)控特點(diǎn)。

1 擬南芥ACS基因家族成員及其生理特性

擬南芥基因組包含12個(gè)ACS同源基因，分別分布在5條染色體上。家族成員之間的氨基酸序列相似性為32%-91%，核苷酸序列相似34%-84%［19］，ACS蛋白序列具有7個(gè)相同的功能結(jié)構(gòu)域和11個(gè)保守性位點(diǎn)，包含了輔基磷酸吡哆醛結(jié)合位點(diǎn)、底物特異性結(jié)合位點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)等結(jié)構(gòu)信息。其中，ACS1缺少3個(gè)保守的氨基酸（T、N和P），沒有酶促活性［20］，ACS3的基因是假基因［19，21］，ACS10和

ACS12執(zhí)行氨基轉(zhuǎn)移酶功能［19］，其余9個(gè)ACS酶具有催化ACC生物合成功能。根據(jù)其蛋白C末端序列的差異分為3個(gè)類型，即TypeI：ACS1、2和6；TypeII：ACS4、5、8和9；TypeIII：ACS7、11［22-24］（圖1）。其中，TypeI有一個(gè)鈣依賴蛋白激酶（Calcium-dependent protein kinase，CDPK）磷酸化位點(diǎn)和3個(gè)有絲分裂原蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase，MAPK）磷酸化位點(diǎn)，TypeII僅有一個(gè)單獨(dú)CDPK磷酸化位點(diǎn)，TypeIII沒有以上所述蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)。

圖1 擬南芥ACS蛋白C端差異及其分類

研究表明，ACS蛋白序列和結(jié)構(gòu)存在一定的保守性和差異性。就蛋白序列而言，肽鏈長(zhǎng)度，分子量的不同，氨基酸的豐度、功能性位點(diǎn)各不相同［27］；就結(jié)構(gòu)特點(diǎn)而言，N末端序列的保守性、C末端序列的多樣性等也不相同［28］。這些決定了其生化特性不同，如等電點(diǎn)、底物親和力和最大反應(yīng)速度的不同，對(duì)ACS抑制劑AVG、Sinefungin的敏感程度不同［19］，同時(shí)也決定了其功能差異（表1）。

表1 ACS家族成員的生化指標(biāo)［19］

擬南芥ACS酶活性直接關(guān)系到體內(nèi)乙烯含量。野生型植株（Wild type，WT）的黃化苗過量產(chǎn)生乙烯（Ethylene over-produce），在ACS5和ACS9功能缺失突變體acs5、acs9或者acs5acs9這一過程受限［25，26］，說明ACS5和ACS9是WT植株黃化苗時(shí)期乙烯過度產(chǎn)生的主效基因。光照條件下，5 d齡的WT植株中的乙烯含量高于功能缺損的acs1-1突變體；類似的功能缺失突變體acs4-1與acs9-1植株中的乙烯含量要顯著高于WT；而單突變acs2-1，acs5-1 對(duì)乙烯含量的影響并不顯著［29］。這些結(jié)果暗示，ACS酶活性隨著植物生長(zhǎng)發(fā)育階段而改變，且各成員具有功能特異性。但是，令人費(fèi)解的是，ACS1被認(rèn)為無催化乙烯合成活性［29，30］，acs1-1突變體卻表現(xiàn)出乙烯含量顯著變化。據(jù)此推測(cè)，單個(gè)ACS基因突變可能影響ACS基因家族整體表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。

ACS單個(gè)成員具有功能特異性和專一性，主要表現(xiàn)在下胚軸伸長(zhǎng)、開花時(shí)間和子葉面積的大小3個(gè)方面。acs1-1 和 acs9-1黑暗中生長(zhǎng)的黃化幼苗下胚軸伸長(zhǎng)得到促進(jìn)，而acs4-1下胚軸長(zhǎng)度受到抑制；光下生長(zhǎng)的所有ACS單突變體下胚軸伸長(zhǎng)得

到促進(jìn)，子葉面積增加。acs1-1、acs6-1、acs7-1和acs9-1開花時(shí)間較WT提前，但acs6-1 acs7-1雙突變體早花表型受到抑制，開花時(shí)間較WT延遲［29］。暗示ACS6和ACS7在調(diào)控開花時(shí)間方面可能存在功能拮抗作用。

2 ACS基因家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控

基因的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控是植物應(yīng)答各種信號(hào)刺激的重要過程。借助于基因芯片技術(shù)、Northern blot、定量PCR技術(shù)、GUS轉(zhuǎn)基因和酶活性分析等技術(shù)，分析不同的生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期、不同外界信號(hào)刺激下ACS基因家族的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)發(fā)現(xiàn)，ACS家族成員轉(zhuǎn)錄調(diào)控各有特點(diǎn)。

2.1 不同發(fā)育時(shí)期、不同器官組織中特點(diǎn)

除ACS9在發(fā)育后期表達(dá)外，擬南芥ACS家族其它基因在5 d的黃化苗、光下生長(zhǎng)的幼苗及表皮細(xì)胞、保衛(wèi)細(xì)胞、維管組織中均有表達(dá)［9，31-34］；其中ACS11在萼片的香毛簇中特異表達(dá)，ACS1在胚座框中特異表達(dá)；而在擬南芥中胚軸、根、花的不同組織和長(zhǎng)角果中表現(xiàn)為多個(gè)ACS基因共表達(dá)［21］。

2.2 不同環(huán)境因素調(diào)節(jié)的ACS表達(dá)特點(diǎn)

生物脅迫與非生物脅迫可改變ACS轉(zhuǎn)錄活性和乙烯合成。物理傷害雖然能抑制下胚軸中ACS1、ACS5的組成性表達(dá)，但卻誘導(dǎo)ACS2、ACS4、ACS6、ACS7、ACS8的表達(dá)［21］；冷處理抑制ACS5 和ACS11表達(dá)，且改變了ACS8表達(dá)模式；熱處理增強(qiáng)了ACS4的mRNA含量，改變了ACS8和ACS11的表達(dá)模式；缺氧環(huán)境下誘導(dǎo)ACS2、ACS6、ACS7、ACS9的表達(dá)［21］。ACS基因轉(zhuǎn)錄活性也被外源激素所調(diào)控。IAA可提高ACS2、ACS4、ACS5、ACS6、ACS7、ACS8、ACS11在擬南芥根中的表達(dá)，特異的誘導(dǎo)擬南芥黃化苗中ACS4表達(dá)［32］；油菜素內(nèi)酯能夠增強(qiáng)ACS4的mRNA含量［33］。同時(shí)，基因芯片結(jié)果（http：//bar.utoronto.ca/efp）顯示，處理150 mmol/L NaCl時(shí)，ACS家族各基因mRNA含量呈現(xiàn)不同的時(shí)間相關(guān)性。光照誘導(dǎo)ACS8表達(dá)呈現(xiàn)晝夜節(jié)律變化［35］。

ACS基因表達(dá)也會(huì)受到體內(nèi)或體外乙烯水平自催化調(diào)節(jié)。ACS4、ACS 7、ACS9受到ACC顯著性的誘導(dǎo)［34，36］；ACS9在乙烯不敏感突變體etr1-1與ein2-1均表現(xiàn)為mRNA含量的下降，且ACC處理不能恢復(fù)ACS9的mRNA含量［37］。這些研究結(jié)果暗示，ACC處理對(duì)ACS酶活性誘導(dǎo)是必要而非充分的，同時(shí)也暗示了乙烯的自催化調(diào)節(jié)是通過乙烯受體感受乙烯信號(hào)后反饋調(diào)節(jié)ACS基因表達(dá)。

另外，張舒群等［38］報(bào)道ACS2和ACS6轉(zhuǎn)錄活性可被促有絲分裂活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MPK）3/MPK6和轉(zhuǎn)錄因子WRKY33所調(diào)控，從而影響乙烯的合成。

3 ACS家族蛋白水平調(diào)控

ACS是以磷酸吡哆醛為輔因子的胞質(zhì)酶，半衰期很短，通常只有30 min到幾小時(shí)［39-41］。ACS蛋白結(jié)構(gòu)決定了自身的生化功能，保守性較低的C端往往是蛋白修飾位點(diǎn)；位于中間某些位置的Arg、Try是二聚體相互作用的位點(diǎn)。這些位點(diǎn)屬于非酶活性位點(diǎn)，但是調(diào)節(jié)著ACS命運(yùn)。

3.1 ACS家族蛋白修飾

廣譜蛋白激酶抑制劑K252a或十字孢堿（Staurosporine）能夠抑制真菌誘導(dǎo)劑對(duì)番茄懸浮細(xì)胞ACS酶活性的誘導(dǎo)作用［42］，而用蛋白磷酸化酶抑制劑花萼海綿誘癌素A（Calyculin A）處理番茄后能夠組成型的誘導(dǎo)ACS酶活性［42，43］，說明磷酸化可以調(diào)節(jié)ACS活性。進(jìn)一步的研究證明，磷酸化對(duì)ACS活性的調(diào)節(jié)是通過對(duì)其穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)來改變ACS活性［22，44，45］。

TypeI和TypeII ACSs在沒有乙烯存在時(shí)通過蛋白酶體降解。對(duì)于TypeI ACSs，乙烯的存在可能誘導(dǎo)E3識(shí)別位點(diǎn)的磷酸化從而阻止了E3的識(shí)別。TypeII ACSs，其降解受到擬南芥3個(gè)BTB 結(jié)構(gòu)域的E3180 連接酶的作用，其適配器蛋白是ETO1、EOL1和EOL2。其中ETO1與cullin3和AtACS5互作，ETO1表達(dá)的破壞導(dǎo)致了ACS5的穩(wěn)定性和持續(xù)乙烯的合成，所以ETO1可能作為一個(gè)特異的底物適配器介導(dǎo)AtACS5的降解［46-48］。ACS4、ACS8和ACS9具有與ACS5相似的C端，都含有類似的絲氨酸位點(diǎn)，同時(shí)ACS5蛋白的C端絲氨酸位點(diǎn)被證明是CDPK磷酸化位點(diǎn)［49］。XBAT32是E3連接酶環(huán)指區(qū)域的一個(gè)蛋白，酵母雙雜交顯示XBAT32能與ACS4和ACS7相互作用，修飾ACS蛋白負(fù)調(diào)控乙烯的合成，從而調(diào)控?cái)M南芥?zhèn)雀陌l(fā)育［50-52］。

14-3-3蛋白在乙烯信號(hào)傳遞中發(fā)揮一定的作用，14-3-3蛋白可能通過結(jié)合ACS磷酸化的C末端來調(diào)節(jié)ACS的活性，保護(hù)ACS在乙烯生物合成時(shí)不被降解。用串聯(lián)親和純化標(biāo)簽（Tandem affinity purification，TAP）標(biāo)記擬南芥14-3-3ω（At1g78300），并在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)。串聯(lián)MS分析純化復(fù)合物，結(jié)果表明14-3-3蛋白能與121個(gè)蛋白相互作用，其中包括參與乙烯合成的ACC合成酶（ACS-6、-7和-8）［53］。 最近，Huang等［54］證明14-3-3與ACS7相互作用參與根的向重力性。Yao等［55］通過酵母雙雜交系統(tǒng)，證明在酵母細(xì)胞中水稻14-3-3蛋白和ACS能發(fā)生相互作用。

圖2 ACS蛋白在乙烯合成中的調(diào)控模式［58］

表2 ACS蛋白之間互作［8］

番茄成熟后期，Le-ACS2位于C端的第460位氨基酸被磷酸化后，表現(xiàn)出乙烯的過量產(chǎn)生，而Le-ACS4并沒有表現(xiàn)出磷酸化［22］。說明ACS蛋白磷酸化是由其蛋白結(jié)構(gòu)決定的，更準(zhǔn)確地說是由其C末端的序列決定的［56，57］。植物體內(nèi)、體外因子都可以改變ACS蛋白的磷酸化進(jìn)程。正常條件下，ACS表現(xiàn)出低活性，當(dāng)植物受到外界刺激的時(shí)候，能夠迅速產(chǎn)生乙烯，蛋白激酶通過直接與ACS相互作用并對(duì)其磷酸化來參與這一過程。擬南芥I型ACS家族成員具有保守的MPK3和MPK6作用位點(diǎn)，ACS2、6能夠被MPK6磷酸化［45，57］。II型與III型的ACS家族成員不具備MPK磷酸化位點(diǎn)（圖2），當(dāng)ACS6沒有被磷酸化的情況下，能夠被迅速形成的26S蛋白酶復(fù)合體降解，而磷酸化的作用就是抑制蛋白酶復(fù)合體對(duì)C端的結(jié)合，從而改變其蛋白穩(wěn)定性［56］。驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ACS蛋白之間能夠形成同源二聚體與異源二聚體，位于其肽鏈中間位置的Arg、Try是二聚體相互作用位點(diǎn)。不同的二聚體具有不同的生化特性，也決定了不同的蛋白純化條件［36］，同時(shí)表現(xiàn)出不同的酶活力［59］，包括對(duì)底物SAM結(jié)合的米氏常數(shù)（Km值：8.3-4 mol/L）、催化常數(shù)（kcat值：0.19-4.82 s-1）和對(duì)抑制劑AVG的抑制常數(shù)（Ki值：0.019-0.8 mol/L）。但并不是所有的二聚體都具有酶活力。ACS單體間能夠形成25個(gè)具有酶活力的二聚體與20個(gè)不具有酶活力的二聚體。除了ACS1外，擬南芥ACS家族其他蛋白同源二聚體都具有酶活力（表2）。ACS7能夠與TypeI和TypeII的ACS單體形成功能性的異源二聚體。意外的是，ACS1同源二聚體不具備酶活力，但能夠與ACS2和ACS6形成具有酶活力的異源二聚體［9］。但是，迄今為止，這些二

3.2 ACS蛋白互作

通過大腸桿菌（E. coli）ACS蛋白體外純化實(shí)

聚體如何形成，以何種方式結(jié)合，亞細(xì)胞定位以及具有什么樣的生物學(xué)調(diào)控功能與意義都還不確定。

4 小結(jié)

ACS每個(gè)基因成員的表達(dá)調(diào)控受不同脅迫因素的誘導(dǎo)，基因的表達(dá)也較為復(fù)雜，其調(diào)節(jié)主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上，同時(shí)也發(fā)生在翻譯水平上［60，61］。因此，乙烯生物合成的調(diào)控可能存在多種因素，通過不同的調(diào)控因子分別接受不同的刺激，誘導(dǎo)特定的ACS的表達(dá)［62-65］，同時(shí)也通過所編碼蛋白的氨基酸序列的差異決定其反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)及乙烯生物合成的速度［13，65］。但是到目前為止，調(diào)控ACS表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控的信號(hào)通路等都鮮少報(bào)道。

乙烯生物合成途徑中的ACC合成酶基因不斷被分離克隆，有的已經(jīng)通過基因工程技術(shù)，將其轉(zhuǎn)入到不同的物種中，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)來調(diào)控植物ACC合成酶基因的表達(dá)。但植物體內(nèi)參與乙烯生物合成的ACC合成酶基因的數(shù)目及特性尚不清楚。今后，需要進(jìn)一步從分子和蛋白水平上進(jìn)行研究。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Review of Arabidopsis 1-Aminocyclopropane-1-Carboxylic Acid Synthases

Lü Shufang1，2Jiang Jing1
（1. State Key Laboratory of Cotton Biology，College of Life Science，Henan University，Kaifeng 475004；2. College of Agricultural，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003）

1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid（ACC）synthase（ACS）is the key rate-limiting enzyme of ethylene biosynthesis. The activity of ACS enzyme is the basis of ACC or ethylene regulates plant growth and development. This regulation is mainly involved in various levels：transcription, post-transcriptional modification, enzyme structure formation, biochemical characteristics, and so on. Here we briefly review the research progresses of ACS enzymic activity.

ACS enzyme Activity regulation Ethylene

2014-03-27

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31271510）

呂淑芳，女，講師，碩士研究生，研究方向：植物學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：lvshufang780515@sina.com

江靜，博士，教授，研究方向：植物抗逆生理與分子生物學(xué)；E-mail：jiangjing@henu.edu.cn