靳文斌 張蕭蕭 李玉 路福平

（天津科技大學生物工程學院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室 工業(yè)酶國家工程實驗室 天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津 300457）

合成唾液酸乳糖重組大腸桿菌的構建

靳文斌 張蕭蕭 李玉 路福平

（天津科技大學生物工程學院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室 工業(yè)酶國家工程實驗室 天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津 300457）

唾液酸寡糖具有抗感染、提高免疫力、促進雙歧桿菌增殖等功能，對其微生物合成方法的研究具有重要的理論和應用價值?？寺『捅磉_來源于Campylobacter jejuni的N-乙酰葡萄糖胺異構酶基因（neuC）、乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因（neuB）、CMP-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因（neuA）和來源于Nesseria meningitidis的唾液酸轉移酶基因（nst），利用表達載體pSTV29，在大腸桿菌Escherichia coli JM109內(nèi)構建合成唾液酸乳糖的代謝途徑。在接種量2%、裝液量50 mL/250 mL三角瓶、搖床轉速180 r/min、溫度34℃的條件下發(fā)酵30 h，并以10 g/L乳糖為底物，利用HPLC檢測到唾液酸乳糖的合成量為2.45 g/L，為人乳唾液酸寡糖及其類似物的異體合成提供了新的思路。

唾液酸乳糖 大腸桿菌 代謝工程

人乳寡糖及其類似物由于安全、可靠，不產(chǎn)生抗藥性，并且具有部分免疫功能［1］，以人乳寡糖及其類似物為原料開發(fā)新型藥物成為當前醫(yī)藥領域的一大熱點。目前我國對人乳寡糖的研究開發(fā)仍處于初始階段且多采用化學合成法獲得人乳寡糖及其類似物。由于糖苷供體價格昂貴［2］、合成路徑復雜［3］及分離純化困難，限制了人乳寡糖及其類似物的工業(yè)應用。伴隨著相關基因不斷解析和微生物代謝路徑不斷得到闡明［4-7］，使得利用生物技術的方法大量獲得人乳寡糖成為可能。

唾液酸寡糖是人乳寡糖的重要組成成分，具有抗感染、提高免疫力、促進雙歧桿菌增殖等功能［8］，

在食品醫(yī)藥行業(yè)具有廣闊的市場前景，近年來受到人們的廣泛關注。由于化學合成法涉及復雜的保護和去保護步驟，人們把目光轉向了生物技術的方法。利用組合生物學技術，人們已成功合成殼聚糖［9，10］、巖藻糖基化寡糖［11］、神經(jīng)節(jié)苷脂等碳水化合物［12］，為合成唾液酸寡糖提供了新思路，解決了難以實現(xiàn)規(guī)模合成的難題。

本研究主要是將來源于空腸彎曲桿菌（C. jejuni）的N-乙酰葡萄糖胺異構酶基因（neuC）、乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因（neuB）、CMP-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因（neuA）和來源于腦膜炎奈瑟氏菌（N. meningitidis）的唾液酸轉移酶基因（nst）引入大腸桿菌JM109，在其體內(nèi)構建合成唾液酸乳糖的合成途徑，以乳糖為底物合成唾液酸乳糖，合成途徑如圖1。

圖1 合成唾液酸乳糖工程菌代謝途徑

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒 Escherichia coli JM109和大腸桿菌表達質(zhì)粒pSTV29均為本實驗室保藏；重組質(zhì)粒pUC57-neuA-neuB-neuC和pUC57-nst均由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進行neuA、neuB、neuC、nst基因合成時提供。

1.1.2 試劑 限制性內(nèi)切酶PstⅠ、EcoRⅠ、KpnⅠ、SacⅠ和SolutionⅠ，大連寶生物工程有限公司；1 kb DNA Ladder、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒，北京天為時代科技有限公司；氯霉素，上海生工生物工程公司；其他為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 10，pH7.0，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖40，酵母粉 5，硫酸銨5，磷酸氫二鈉4，磷酸二氫鉀0.5，pH6.8，115℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 工 程 菌JM109/pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst的構建 將質(zhì)粒pUC57-neuA-neuB-neuC和質(zhì)粒pSTV29分別用限制性內(nèi)切酶PstⅠ、EcoRⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，用SolutionⅠ于16℃連接過夜，利用電轉化法轉入大腸桿菌Escherichia coli JM109中，通過氯霉素抗性平板篩選轉化子，獲得工程菌JM109/pSTV29-neuB-neuC，用同樣的方法構建工程菌JM109/pSTV29-neuA-neuB-neuC和工程菌JM109/pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst，重組質(zhì)粒用雙酶切法進行鑒定。

1.2.2 唾液酸乳糖及其中間產(chǎn)物的發(fā)酵合成 將構建的工程菌JM109/pSTV29-neuB-neuC、JM109/ pSTV29-neuA-neuB-neuC和 JM109/pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst分別接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 180 r/min培養(yǎng)過夜。按2%接種量轉入50 mL新鮮的大腸桿菌發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，氯霉素終濃度為 40 μg/mL，34℃培養(yǎng)至OD600=0.4-0.6，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，34℃誘導培養(yǎng)30 h。

1.2.3 唾液酸乳糖及其中間產(chǎn)物的分析檢測 HPLC和LC-MS分析條件為色譜柱：Aminex HPX-87H Column，300 mm×7.8 mm；檢測器：示差折光檢測器；流動相：H2O+0.05 mol/L H2SO4；柱溫：40℃；進樣量：10 μL；流速：0.5 mL/min。

取誘導培養(yǎng)后的發(fā)酵液和菌體細胞，超聲破碎（功率500 W，振幅35%，每個循環(huán)超聲4 s，冷卻5 s，10 min），4℃，12 000 r/min下離心10 min，收集上清進行HPLC分析。用配置好的1 mg/mL的N-乙酰神經(jīng)氨酸、1 mg/mL的唾液酸乳糖的標品溶液作為對照以確定發(fā)酵液中相應產(chǎn)物的出峰位置。并對發(fā)酵液進行LC-MS分析，對產(chǎn)物進行進一步確定。根據(jù)N-乙酰神經(jīng)氨酸的分子量（311）、唾液酸乳糖的分子量（633）設定掃描質(zhì)量范圍100-700，負離

子模式，檢測N-乙酰神經(jīng)氨酸標品，再根據(jù)標品的信號大小設置SIM 碰撞誘導解離參數(shù)，進樣量為10 μL檢測發(fā)酵樣品。

2 結果

2.1 工程菌JM109/pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst的構建

2.1.1 重組質(zhì)粒pSTV29-neuB-neuC的構建及鑒定將PstⅠ/EcoRⅠ雙酶切處理過的質(zhì)粒pUC57-neuA-neuB-neuC和質(zhì)粒pSTV29與SolutionⅠ混合，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌JM109，獲得工程菌JM109/pSTV29-neuB-neuC。對陽性轉化子質(zhì)粒采用PstⅠ/EcoRⅠ雙酶切驗證，結果如圖2所示。從圖2中可以看出，在2 300 bp及3 000 bp左右出現(xiàn)兩條帶，與串聯(lián)基因neuB、neuC和質(zhì)粒pSTV29大小一致，說明重組質(zhì)粒pSTV29-neuB-neuC構建成功。

2.1.2 重組質(zhì)粒pSTV29-neuA-neuB-neuC的構建及鑒定 將PstⅠ/KpnⅠ雙酶切處理過的質(zhì)粒pUC57-neuA-neuB-neuC和 質(zhì) 粒pSTV29與SolutionⅠ 混合，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌JM109，獲得工程菌JM109/pSTV29-neuA-neuB-neuC。對陽性轉化子質(zhì)粒采用PstⅠ/KpnⅠ雙酶切驗證，結果如圖3所示。從圖中可以看出，在2 900 bp及3 000 bp出現(xiàn)兩條帶，與串聯(lián)基因neuA、neuB、neuC和質(zhì)粒pSTV29大小一致，說明重組質(zhì)粒pSTV29-neuA-neuB-neuC構建成功。

圖3 重組質(zhì)粒pSTV29-neuA-neuB-neuC酶切電泳圖

2.1.3 重組質(zhì)粒pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst的構建及鑒定 將KpnⅠ/SacⅠ雙酶切處理過的質(zhì)粒pSTV-29-neuA-neuB-neuC和質(zhì)粒pUC57-nst與SolutionⅠ混合，過夜連接，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌JM109，構建工程菌JM109/pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst。對陽性轉化子質(zhì)粒采用PstⅠ/KpnⅠ雙酶切驗證，結果如圖4所示。從圖4中可以看出，在3 900 bp及3 000 bp出現(xiàn)兩條帶，與串聯(lián)基因neuA、neuB、neuC、nst和質(zhì)粒pSTV29大小一致，說明重組質(zhì)粒pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst構建成功。

圖4 重組質(zhì)粒pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst酶切電泳圖

2.2 唾液酸乳糖及其中間產(chǎn)物的分析檢測

2.2.1 N-乙酰神經(jīng)氨酸和CMP-乙酰神經(jīng)氨酸的分析檢測 工程菌JM109/pSTV29-neuB-neuC發(fā)酵后，對發(fā)酵反應液超聲破碎，離心收集上清，HPLC檢測結果如圖5所示。由圖5-B可以看出對發(fā)酵液進行HPLC分析，在大約14 min處出現(xiàn)了預期的峰，這與圖5-A中N-乙酰神經(jīng)氨酸標品的出峰時間相同，可以判定構建的工程菌JM109/pSTV29-neuB-neuC可以合成N-乙酰神經(jīng)氨酸。

采用同樣的發(fā)酵和檢測方法，對工程菌JM109/ pSTV29-neuA-neuB-neuC合成CMP-乙酰神經(jīng)氨酸的情況進行分析，HPLC檢測工程菌JM109/pSTV29-neuA-neuB-neuC的發(fā)酵反應液在CMP-乙酰神經(jīng)氨酸的出峰位置處沒有吸收峰形成。

為了進一步確定所生成的產(chǎn)物是N-乙酰神經(jīng)氨酸，應用LC-MS對發(fā)酵產(chǎn)物進行質(zhì)譜分析。發(fā)酵樣

品檢測結果如圖6所示，根據(jù)N-乙酰神經(jīng)氨酸的結構及分子量，設置掃描質(zhì)量范圍為100-700，在負離子模式下，得到N-乙酰神經(jīng)氨酸標品的M/Z：334（M+Na）-。

圖5 N-乙酰神經(jīng)氨酸標品和發(fā)酵液液相色譜圖

如圖6-A，N-乙酰神經(jīng)氨酸標品的信號大小設置SIM 碰撞誘導解離參數(shù)為334，進樣量為10 μL。檢測發(fā)酵樣品，如圖6-B所示，發(fā)酵樣品出現(xiàn)的質(zhì)譜信號發(fā)現(xiàn)在M/Z：334.1（M+Na）-有離子峰，這與N-乙酰神經(jīng)氨酸標品離子峰大小一致，進一步證明了發(fā)酵液中的產(chǎn)物為N-乙酰神經(jīng)氨酸。

2.2.2 產(chǎn)物唾液酸乳糖的分析檢測 工程菌JM109/ pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst發(fā)酵后，超聲破碎，離心收集上清，發(fā)酵樣品檢測結果如圖7所示。由圖7-B可以看出對發(fā)酵液進行HPLC分析時，在大約8 min處出現(xiàn)了預期的峰，這與圖7-A中唾液酸乳糖標品的出峰時間相同，對照組中同樣在相同時間具有吸收峰，但是在8 min處圖7-B中峰面積與圖7-C中峰面積相比較，在8 min處圖7-B峰面積明顯偏大，因此可以判定構建的工程菌JM109/pSTV29-neuA-neuB-neuC-nst合成了唾液酸乳糖。

圖6 N-乙酰神經(jīng)氨酸標品和發(fā)酵樣品的質(zhì)譜分析

為了進一步確定所生成的產(chǎn)物是唾液酸乳糖，應用LC-MS對發(fā)酵產(chǎn)物進行質(zhì)譜分析。發(fā)酵樣品檢測結果如圖8所示，根據(jù)唾液酸乳糖的結構及分子量，設置掃描質(zhì)量范圍為100-700，在負離子模式下，得到唾液酸乳糖標品的M/Z：632（M-H）-。

圖7 唾液酸乳糖標品和發(fā)酵液液相色譜圖

根據(jù)標品的信號大小設置SIM 碰撞誘導解離參數(shù)為632，進樣量為10 μL檢測發(fā)酵樣品，如圖8-B所示，發(fā)酵樣品在出現(xiàn)的質(zhì)譜信號發(fā)現(xiàn)在M/Z：632（M-H）-有離子峰，這與唾液酸乳糖標品離子峰大小一致，而對照菌在相應的位置卻沒有離子峰出現(xiàn)，進一步證明了發(fā)酵液中的產(chǎn)物為唾液酸乳糖。

3 討論

在哺乳動物體內(nèi)CMP-乙酰神經(jīng)氨酸的生物合成通路受到N-葡萄糖胺異構酶的調(diào)節(jié)控制［13］，具體表現(xiàn)為CMP-乙酰神經(jīng)氨酸反饋抑制N-葡萄糖胺異構酶的活性。在微生物體內(nèi)這種反饋抑制途徑還沒得到證實，然而細菌來源的N-葡萄糖胺異構酶與哺乳動物來源的N-葡萄糖胺異構酶表現(xiàn)出較高的序列同源性，因此在微生物體內(nèi)也可能存在相似的反饋抑制途徑。這就可以解釋在串聯(lián)了neuA、neuB、neuC三個目的基因的重組菌中發(fā)酵后在在發(fā)酵液中檢測不到N-乙酰神經(jīng)氨酸且CMP-乙酰神經(jīng)氨酸的合成量較少。Fierfort［14］在同時引入neuA、neuB、neuC的工程菌中檢測不到N-乙酰神經(jīng)氨酸，本研究結果也證實了這個觀點。

圖8 唾液酸乳糖標品和發(fā)酵樣品的質(zhì)譜分析

以10 g/L乳糖為底物，180 r/min 34℃持續(xù)發(fā)酵30 h，唾液酸乳糖的合成量為2.45 g/L，Drouillard等［15］利用重組大腸桿菌采用高密度持續(xù)發(fā)酵的方法，唾液酸乳糖的合成量為34 g/L，與其相

比我們構建的重組菌由于沒有敲除乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶基因（nanA）、乙酰神經(jīng)氨酸激酶基因（nanK）等，導致合成的N-乙酰神經(jīng)氨酸通過其它途徑進行分解代謝，從而影響終產(chǎn)物唾液酸乳糖的累積量，此外發(fā)酵控制條件和選用的表達載體也會影響唾液酸乳糖的合成量。盡管如此，本研究仍對唾液酸乳糖的異源合成做出了有益探索。

4 結論

本試驗利用基因工程技術成功地將來源于空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni）的N-乙酰葡萄糖胺異構酶基因（neuC）、乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因（neuB）、CMP-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因（neuA）和來源于腦膜炎奈瑟氏菌（N. meningitidis）的唾液酸轉移酶基因（nst）克隆到大腸桿菌表達載體pSTV29中，在大腸桿菌JM109體內(nèi)構建了合成唾液酸乳糖的合成途徑，從而合成唾液酸乳糖。利用工程菌，34℃持續(xù)發(fā)酵30 h，唾液酸乳糖的合成量為2.45 g/L。

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（責任編輯 李楠）

The Construction of E.coli Engineering Strain for Sialyllactose Production

Jin Wenbin Zhang Xiaoxiao Li Yu Lu Fuping
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，the College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457）

Free sialylated oligosaccharides are known to have anti-infective and immunostimulating properties and also known to promote bifidobacterium proliferation, thus investigating the microbial synthetic route of sialylated oligosaccharides is of great value. Biosynthesis of sialyllactose involves N-acetylglucosamine-6-phosphate-epimerase（neuC）, sialic acid synthase（neuB）, CMP-Neu5Ac synthetase（neuA）and α-2, 3-sialyltransferase（nst）. We engineered a biosynthetic pathway sialyllactose production in E.coli JM109, using the expression vector pSTV29, by coexpressing the α-2, 3-sialyltransferase gene from Neisseria meningitidis with the neuA, neuB and neuC Campylobacter jejuni genes encoding CMP-NeuAc synthetase, sialic acid synthase and N-acetylglucosamine-6-phosphate-epimerase, respectively. Under the optimized fermentation conditions（inoculum volume 2%, 10g/L lactose, fermentation volume 50 mL/250 mL, temperature 34℃, rotation speed 180 r/min, fermentation time 30 h）, sialyllactose of 2.45 g/L was obtained. The above results provide a platform for exploring commercial production of sialylated oligosaccharides and its functional analogues in heterogeneous microbial hosts.

Sialyllactose E.coli Metabolic engineering

2014-05-04

國家高技術研究發(fā)展計劃“863計劃”資助項目（2012AA021502），教育部長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃項目（IRT1166）

靳文斌，男，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程，E-mail：jinwenbin-1988@163.com

李玉，女，教授，研究方向：應用微生物與酶工程；E-mail：liyu@tust.edu.cn