李輝劉洋白飛榮姚粟扎西·才吉程池

（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京 100015；2.玉樹藏族自治州三江源藥業(yè)有限公司，玉樹 810003）

野生冬蟲夏草伴生細菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性分析

李輝1劉洋1白飛榮1姚粟1扎西·才吉2程池1

（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京 100015；2.玉樹藏族自治州三江源藥業(yè)有限公司，玉樹 810003）

采用基于PCR擴增的變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）技術(shù)，研究8種不同地理來源野生冬夏草中伴生細菌的群落結(jié)構(gòu)，通過優(yōu)勢條帶切膠測序分析，確定了不同來源冬蟲夏草伴生優(yōu)勢細菌的種屬信息，分析結(jié)果表明冬蟲夏草中細菌群落多樣性豐富，不同來源冬蟲夏草的細菌多樣性指數(shù)（H’）、豐度（D）和均勻度（J）均有所不同，且伴生細菌群落相似性與樣品產(chǎn)地間的距離遠近呈一定的正相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)了冬蟲夏草樣品中的4種共有細菌Flavihumibacter petaseus、Sphingomonas aestuarii、Geobacillus pallidus和Methylovirgula ligni，為進一步研究伴生細菌在冬蟲夏草生長發(fā)育中所起的作用奠定了基礎(chǔ)。

冬蟲夏草 16S rRNA V3區(qū) DGGE 細菌群落

冬蟲夏草（Ophicordyceps sinensis）是冬蟲夏草菌寄生在蝙蝠蛾科幼蟲上形成的昆蟲和子座的復(fù)合體，其形成和成熟過程中伴隨著多種其它微生物的生長，這些微生物可產(chǎn)生多種功效性成分，能有效提升冬蟲夏草的保健和醫(yī)藥功能，在野生冬蟲夏草的形成過程中起著重要的作用［1，2］。

近年來，關(guān)于冬蟲夏及其微環(huán)境中微生物的研究已有大量文獻報道，但主要集中在真菌方面的研究。目前已經(jīng)解決了冬蟲夏草無性型方面的問題，并有10多種功能真菌被開發(fā)利用，如中國金孢霉（Chrysosporium sinense）、蝙蝠蛾被孢霉（Mortierella hepiali）、中國擬青霉（Paecilomyces sinensis）、蝙蝠蛾柱霉（Scytalidium hepiali）、中國彎頸霉（Tolypocladium sinense ）和蝙蝠蛾擬青霉Paecilomyces hepiali 等［3，4］。

然而，冬蟲夏草存在著很多重要的細菌資源有待去認識和開發(fā)利用?；谀壳皩σ吧x夏草中伴生細菌群落結(jié)構(gòu)的研究比較缺乏的狀況，本研究采用PCR-DGGE技術(shù)對不同來源的野生冬蟲夏草半生細菌群落結(jié)構(gòu)進行研究，旨在確定不同來源冬蟲

夏草中的群落差異和共有細菌菌群，旨為冬蟲夏草伴生細菌資源的挖掘與保護奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品1-7分別采集于我國冬蟲夏草代表性產(chǎn)區(qū)青海玉樹州、果洛州，四川康定、阿壩和雅拉雪山，以及云南白馬雪山的高原草甸，樣品8購買自玉樹藏族自治州蟲草交易市場（產(chǎn)地標注尼泊爾），詳見表1。

表1 冬蟲夏草樣品來源表

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 取8種不同來源的冬蟲夏草各一支，用無菌水沖洗后晾干，依次用70%乙醇，次氯酸鈉溶液（2.5%有效Cl-），70%乙醇分別浸泡3 min，5 min，30 s，最后無菌水淋洗5-7次，在無菌條件下晾干［5］。

1.2.2 總DNA提取 取經(jīng)滅菌處理后的冬蟲夏草樣品，按照文獻［6］中的方法提取樣品的總DNA。

1.2.3 16S rRNA基因V3可變區(qū)的PCR擴增 用通用引物對341f-GC和534r進行16S rRNA基因V3可變區(qū)片段的擴增。341f-GC：5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCCTACGGGAGGCAGCAG-3'（40個堿基GC夾）；534r：5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'。PCR反 應(yīng)50 μL體 系 包括10×PCR buffer（不含Mg2+）5.0 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL，Taq酶（2.5 U/μL）1.2 μL，模板各1 μL，上下游引物10 mmol/L各1 μL，無菌雙蒸水補齊至25 μL。PCR反應(yīng)程序如下94℃預(yù)變性5 min 后進入循環(huán)，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)，72℃再次延伸10 min 。

1.2.4 變性梯度凝膠電泳（DGGE） 樣品的16S rRNA基因V3可變區(qū)片段的擴增產(chǎn)物通過DGGE分析系統(tǒng)進行分離。丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性梯度為40%-60%。60℃恒溫，80 V下電泳16 h，電泳完畢后用SYBR green I（1×TAE，1∶10 000）染色45 min，通過凝膠成像系統(tǒng)（英國UVI）分析電泳結(jié)果。

1.2.5 群落多樣性分析 使用Quantity One軟件對DGGE膠圖進行計算；利用Shannon-Wiener多樣性指數(shù)、豐度（S）和Pielou均勻度指數(shù)比較各個樣品的細菌群落多樣性計算。

Shannon-Wiener指數(shù)（H’）計算公式：

H=-∑PilogPi

Pielou指數(shù)（J）計算公式：

J= （1-∑Pi2）/（1-1/S）

其中，S為DGGE條帶數(shù)量，Pi為第i條帶灰度占該泳道總灰度的比率。

1.2.6 DGGE條帶的回收、重新擴增、克隆、轉(zhuǎn)化和序列測定 在波長為 354 nm 紫外線下，切取DGGE 凝膠上的主要條帶，溶于 50 μL 無菌去離子水中，4℃過夜溶解。重擴增，擴增產(chǎn)物連接到載體pEASY-T1（TRANS），轉(zhuǎn)入E.coli感受態(tài)細胞，在LB固體培養(yǎng)基上37℃篩選培養(yǎng)16 h，挑取白色轉(zhuǎn)化子用含有氨芐青霉素抗性的 LB液體培養(yǎng)基37℃震蕩培養(yǎng)8 h。T-載體通用引物進行菌液 PCR，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，每個樣品3個陽性克隆交由生工生物工程（上海）有限公司完成測序。

1.2.7 16S rRNA基因V3可變區(qū)序列分析 所測得的16S rRNA基因V3可變區(qū)序列用DNASTAR軟件去除載體序列和GC夾子后，將有效序列在NCBI上進行比對，以其中同源性最高的序列為參考序列，相似性≥97%的序列視為同一序列型（Sequence type）。

2 結(jié)果

2.1 16S rRNA基因V3可變區(qū)的PCR擴增

8種冬蟲夏草樣品經(jīng)PCR擴增獲得16S rRNA基因V3可變區(qū)的序列片段條帶大小約為200 bp，條帶均單一明亮（圖1）。

2.2 不同來源冬蟲夏草的DGGE圖譜分析及細菌多樣性分析

PCR擴增產(chǎn)物DGGE后獲得8種冬蟲夏草的伴

生細菌DGGE指紋圖譜（圖2），每條泳帶代表一種冬蟲夏草的細菌DGGE指紋圖譜，不同位置的條帶代表不同種屬細菌，條帶的熒光強度則反應(yīng)了該細菌的豐富度，條帶信號越亮，表示該種屬細菌的相對數(shù)量越多。如圖2表明，8種不同來源冬蟲夏草的細菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異，并呈現(xiàn)出不盡相同的優(yōu)勢菌條帶，同時不同來源樣品中還存在5種共有的細菌群落。

圖1 16S rRNA基因V3可變區(qū)PCR擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中的電泳圖譜

8種冬蟲夏草的豐度、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)如表2，圖3-圖5所示。8種樣品的豐度在14-25之間，平均為20，說明冬蟲夏草樣品含有豐富的伴生細菌。從物種多樣性上來看，8種樣品的多樣性指數(shù)在2.36-3.103之間，具有較高的物種多樣性，物種多樣性變化趨勢與豐度相同，來自尼泊爾的樣品具有最高的細菌物種多樣性和豐度。8種樣品的均勻度，從趨勢上看不同于物種多樣性和豐富度，來源于玉樹郭欽的樣品具有最高的均勻度。

圖2 八種不同來源冬蟲夏草樣品伴生細菌 DGGE 分離圖譜及分析示意圖

2.3 不同來源冬蟲夏草的細菌群落結(jié)構(gòu)相似性分析

在DGGE圖譜中，不同樣品的共有條帶數(shù)目，可以反應(yīng)不同樣品之間細菌群落相似性。通過計算群落相似性系數(shù)并構(gòu)建聚類樹，可以得到不同來源冬蟲夏草的細菌群落結(jié)構(gòu)的聚類關(guān)系。從圖6可以看出來源于青海治多縣和果洛州樣品，以及來源于玉樹哈秀和郭欽的樣品均聚為一個分支，相似性系數(shù)分別為80.5%和73.1%，其他樣品間的相似性系數(shù)在45%-68%之間，細菌群落結(jié)構(gòu)相似性與樣品產(chǎn)地的遠近具有一定的正相關(guān)性。

表2 八種不同來源冬蟲夏草樣品的豐度（s）、Shannon-Wiener指數(shù)和Pielou指數(shù)列表

圖3 8種不同來源冬蟲夏草樣品的Simpson豐富度指數(shù)分析

2.4 不同來源冬蟲夏草的優(yōu)勢細菌群落結(jié)構(gòu)比較分析

為進一步研究不同冬蟲夏草樣品中細菌的群落組成，DGGE電泳后對其中12個優(yōu)勢條帶進行切膠、回收、克隆、測序（表3）。測序結(jié)果經(jīng)GenBank數(shù)

據(jù)庫比對后，序列相似性均大于97%，比對結(jié)果顯示8種冬蟲夏草樣品中中存在Methylovirgula、拜葉林克氏菌（Beijerinckia）、空氣芽孢桿菌（Aeribacillus）、噬菌弧菌（Bacteriovorax）、假單胞菌（Pseudomonas）、土地桿菌（Pedobacter）、肉食桿菌（Carnobacterium）、Flavihumibacter、Sphingopyxis等9個屬優(yōu)勢細菌，分屬于變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）3個類群，其中變形菌門組成最高為50%，擬桿菌門次之為33.3%，厚壁菌門占16.7%。

圖4 八種不同來源冬蟲夏草樣品的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)分析

圖5 八種不同來源冬蟲夏草樣品的Pielou均勻度指數(shù)分析

圖6 不同冬蟲夏草樣品細菌群落結(jié)構(gòu)相似性的聚類結(jié)果

8種不同樣品中的優(yōu)勢細菌種類存在明顯的差異（表3），但也存在一些共有的細菌種類。在所有樣品中均檢測到 Methylovirgula ligni、Aeribacillus pallidus、Flavihumibacter petaseus和 Pedobacter panaciterrae這4個種。

3 討論

基于PCR擴增的變性梯度凝膠電泳（PCRDGGE）技術(shù)無需對樣品中微生物進行培養(yǎng)，直接研究其基因指紋圖譜，具有檢測限低、易操作、可重復(fù)性強等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于復(fù)雜環(huán)境樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究［7-9］。冬蟲夏草是一個十分復(fù)雜的微生態(tài)環(huán)境，對其的研究會受到很多既定因素的影響，而PCR-DGGE技術(shù)能克服傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的局限性，在分析冬蟲夏草伴生細菌微生物群落結(jié)構(gòu)中具有十分重要的意義。

本研究首次將PCR-DGGE技術(shù)應(yīng)用于8種不同地理來源野生冬蟲夏草伴生細菌群落結(jié)構(gòu)研究，通過優(yōu)勢條帶切膠測序分析，確定了不同來源冬蟲夏草中伴生的優(yōu)勢細菌種屬信息，結(jié)果表明冬蟲夏草中存在豐富的細菌群落多樣性，不同來源冬蟲夏草的細菌多樣性指數(shù)（H’）、豐度（D）和均勻度（J）均有所不同，樣品之間伴生細菌群落相似性與樣品產(chǎn)地的距離遠近呈正相關(guān)，不同樣品既存在細菌種類和豐度上的差異，也存在一些共有的細菌種類，其中Flavihumibacter petaseus、Sphingomonas aestuarii、Geobacillus pallidus和 Methylovirgula ligni是不同來源冬蟲夏草中共有的伴生細菌。本研究證明，PCR-DGGE技術(shù)是一種快速有效地研究冬蟲夏草伴生細菌菌群結(jié)構(gòu)的技術(shù)。

與傳統(tǒng)方法相比，PCR-DGGE技術(shù)可對未培養(yǎng)微生物進行檢測，極大地拓展了對冬蟲夏草伴生細菌多樣性的研究。本研究中共檢測到Methylovirgula、拜葉林克氏菌（Beijerinckia）、空氣芽孢桿菌（Aeribacillus）、噬菌弧菌（Bacteriovorax）、假單胞菌（Pseudomonas）、土地桿菌（Pedobacter）、肉食桿菌（Carnobacterium）、Flavihumibacter、Sphingopyxis9個屬內(nèi)的12種細菌，其中除肉食桿菌（Carnobacterium）、假單胞菌（Pseudomonas）已有報道［10，11］從冬蟲夏草寄主腸道中分離到外，其他屬均為首次檢測到。

值得注意的是，本研究從8種不同來源的冬

蟲夏草樣品中均檢測到Flavihumibacter petaseus、Sphingomonas aestuarii、Geobacillus pallidus和Methylovirgula ligni四種伴生細菌，這些細菌資源是否普遍存在于冬蟲夏草中，在其形成過程中是否起著某種特定的促生作用，還需要進一步研究證實。

表3 優(yōu)勢條帶切膠測序比對分析結(jié)果

另外，本研究基于PCR-DGGE建立了冬蟲夏草伴生細菌菌群結(jié)構(gòu)分析方法，但還需要進一步廣泛收集不同的冬蟲夏草測試樣品，以獲得更豐富的研究數(shù)據(jù)，并結(jié)合傳統(tǒng)的分離純化方法獲得伴生細菌資源，為合理的開發(fā)和利用冬蟲夏草伴生細菌資源打下基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

野生冬蟲夏草伴生細菌群落多樣性豐富，其樣品產(chǎn)地間的距離遠近與伴生細菌群落結(jié)構(gòu)相似性呈一定的正相關(guān)，不同冬蟲夏草樣品中包含4種共有的伴生細菌類群，這是國內(nèi)外首次利用非培養(yǎng)方法針對野生冬蟲夏草伴生細菌群落多樣性進行的研究，具有重要的理論研究與實踐指導(dǎo)價值。

［1］Zhang YJ, Zhang S, Wang M, et al. High diversity of the fungal community structure in naturally-occurring Ophiocordyceps sinensis［J］. PLoS ONE, 2010, 5（12）：e15570.

［2］旺姆, 孫漫紅, 張永杰, 等. 西藏冬蟲夏草微生物區(qū)系初步研究［J］. 中國食用菌, 2006, 25（增刊）：6-8.

［3］蔣毅, 姚一建. 冬蟲夏草無性型研究概況［J］. 菌物系統(tǒng), 2003, 22（1）：161-176.

［4］戴如琴, 李曉明, 邵愛娟, 等.蝙蝠蛾擬青霉名稱的合格化［J］.菌物學(xué)報, 2008, 27（5）：641-644.

［5］劉洋, 左山, 鄒媛媛, 等.雜交玉米農(nóng)大108及其親本種子內(nèi)生細菌群落多樣性的研究［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 44（23）：4763-4771.

［6］白飛榮, 李輝, 劉洋, 等. 一種冬蟲夏草全基因組DNA的提取方法［J］.工業(yè)微生物, 2014, 44（1）：19-21.

［7］姚粟.芝麻香型白酒高溫大曲細菌群落多樣性研究［D］. 北京：北京林業(yè)大學(xué), 2013.

［8］向燕, 李建光, 楊興, 等.微生物制劑對養(yǎng)殖池塘細菌群落影響的PCR-DGGE分析［J］. 水生態(tài)學(xué)雜志, 2012, 33（2）：100-104.

［9］劉慧杰, 楊彩云, 田蘊, 等.基于PCR-DGGE技術(shù)的紅樹林區(qū)微生物群落結(jié)構(gòu)［J］.微生物學(xué)報, 2010, 50（7）：923-930.

［10］劉莉, 王中康, 俞和韋, 等.貢嘎蝠蛾幼蟲腸道細菌多樣性分析［J］.微生物學(xué)報, 2008, 18（5）：616-622.

［11］張宗豪, 馬少麗, 徐海峰.青海省冬蟲夏草寄主蝙蝠蛾幼蟲腸道菌群變化分析［J］.青海畜牧獸醫(yī)雜志, 2009, 39（6）：17-19.

（責(zé)任編輯 李楠）

Analysis of Bacterial Community Structure and Diversity in Wild Ophicordyceps sinensis

Li Hui1Liu Yang1Bai Feirong1Yao Su1，2Zahi Nagi2Cheng Chi1

（1. Chinese Research Institute of Food and Fermentation Industries Chinese industrial culture collection center，Beijing 100015；2. Yushu Tibetan Autonomous Prefecture of Sanjiang Source Pharmaceutical Co Ltd，Yushu 810003）

The bacterial community structure of eight wild Ophicordyceps sinensis were investigated using PCR-DGGE.DNA sequencing was proceeded to obtain dominant bacterial population information in different samples. The result of DGGE profile showed that all the samlples contained abundant bacterial community, different samples have some differences among the Shannon-winner index, Richess and evenness, significant differences were observed between samples from distinct locations. Flavihumibacter petaseus, Sphingomonas aestuarii, Geobacillus pallidus and Methylovirgula ligni were commonly detected in all samples, which laid a foundation for further studying on the roles of bacteria during the formation process of Ophicordyceps sinensis.

Ophicordyceps sinensis 16S rRNA V3 DGGE Bacterial community

2014-03-05

國家微生物資源平臺專項（NIMR2014-4），青海省科技計劃項目（2012-N-142，2012-N-153），中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院科技發(fā)展基金（博士基金）項目（2012KJFZ-BS-01）

李輝，碩士，工程師，研究方向：微生物學(xué)；E-mail：lihui@china-cicc.org

程池，男，教授級高級工程師，博士生導(dǎo)師，研究方向：食品工業(yè)微生物菌種資源管理與鑒定評估；E-mail：cheng100027@163.com