陳雨晴黃惠琴劉敏鮑時翔

（1.海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院，?？?570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點實驗室，海口 571101）

1株具有抗根結(jié)線蟲活性的紅樹林土壤放線菌的分離與鑒定

陳雨晴1，2黃惠琴2劉敏2鮑時翔2

（1.海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院，海口 570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點實驗室，?？?571101）

采用平板稀釋法，從海南省東寨港紅樹林根際土壤中分離得到110株放線菌；利用24孔板液體篩選模型，篩選出具有抗線蟲活性的放線菌菌株HA10401。該菌株發(fā)酵液在稀釋20倍和40倍時，抗根結(jié)線蟲校正死亡率分別為58.2%和52.6%。通過16S rDNA基因序列分析，菌株HA10401與鏈霉菌屬菌株 Streptomyces variabilis同源性最高（99.8%），在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚在同一分支內(nèi)，親緣關(guān)系最近。二者在形態(tài)特征、培養(yǎng)特征以及生理生化特征方面也基本一致，因此，鑒定菌株HA10401為變異鏈霉菌（Streptomyces variabilis）。本研究首次報道了其抗根結(jié)線蟲活性，值得進行更為深入的研究。

紅樹林 放線菌 鑒定 根結(jié)線蟲

根結(jié)線蟲是一類固著型內(nèi)寄生植物病原線蟲，在很多國家和地區(qū)均有發(fā)生，每年給全世界的農(nóng)林、園藝等產(chǎn)業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失［1］。根結(jié)線蟲病害在我國發(fā)生極為普遍，糧食作物、蔬菜、果樹、花卉等2 000多種植物幾乎均可受到侵染［2］，溫帶、亞熱帶和熱帶地區(qū)遭受病害尤為嚴重，有時作物的減產(chǎn)量可達到70%以上［3］。根結(jié)線蟲的防治非常困難，傳統(tǒng)的輪作、抗病育種方法并不能穩(wěn)定、高效地抵抗根結(jié)線蟲，而常使用的化學(xué)方法則會造成嚴重的環(huán)境污染［4］。因此，尋找一種比較科學(xué)的方法來防治根結(jié)線蟲極為重要，人們希望探索一些高效、低毒、低殘留并具有高選擇性的殺線劑。近年來，

生物防治越來越受到重視［5］，從微生物的代謝產(chǎn)物中分離具有抗線蟲活性物質(zhì)已成為最具有潛力的防治途徑之一。

放線菌在自然界中廣泛分布，且是抗生素的主要來源，近幾十年來具有生物活性的天然產(chǎn)物中，45%來自于放線菌［6］，它們能有效抑制某些危害農(nóng)作物的細菌、病毒和真菌等，被大量用于生物防治［7］，其中由放線菌產(chǎn)生的阿維菌素（Avermectins）已經(jīng)在抗線蟲方面得到了廣泛的應(yīng)用［8］。利用放線菌的次生代謝產(chǎn)物制備無污染、無殘留、可再生、難以使線蟲產(chǎn)生抗藥性的新型殺線蟲藥劑，已經(jīng)成為未來農(nóng)藥的重點發(fā)展方向［9］。紅樹林作為一種分布于熱帶和亞熱帶的特殊海岸潮間帶生態(tài)系統(tǒng)，周期性受潮水侵蝕，具有高水分、高鹽分、寡營養(yǎng)等特點，蘊含極為豐富且極具特色的微生物資源［10］，近年來關(guān)于紅樹林抗線蟲放線菌資源的開發(fā)已取得了廣泛的進展。魏華等［11］從海南東寨港紅樹林采集的土壤樣品中分離得到具有殺線蟲活性的放線菌Saccharopolyspora jiangxiensis，在菌株發(fā)酵液稀釋20倍后，抗根結(jié)線蟲校正死亡率高達70.5%；黃惠琴等［12］從該環(huán)境土壤樣品中篩選出一株具有較強抗根結(jié)線蟲放線菌Streptomyces aculeolatus，其抗根結(jié)線蟲活性也是首次被報道；Zeng等［13］從放線菌Streptomyces albogriseolus中分離得到新型活性化合物制霉色基素（Fungichromin B），進一步研究顯示該化合物具有廣泛的抗蟲譜。這些研究均表明了紅樹林抗根結(jié)線蟲放線菌資源的豐富性，大量潛在的高效抗線蟲資源還有待開發(fā)。本試驗從海南文昌東寨港紅樹林根際土壤中分離并篩選出具有高效抗根結(jié)線蟲活性的放線菌菌株，并對其進行形態(tài)、生理生化和分子鑒定，旨為新型抗線蟲藥劑的進一步開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣的采集 于2012年11月從海南東寨港的幾種不同紅樹根際采集土壤樣品，按照五點采樣法，分別采集0-5、5-10、10-20 cm深處的土壤樣品，混勻后裝入無菌袋內(nèi)，并置入冰盒中于4 h內(nèi)帶回實驗室處理。

1.1.2 培養(yǎng)基［14］分離培養(yǎng)基：腐植酸-維生素（HV）培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基、淀粉-天門冬素培養(yǎng)基，倒平板前向培養(yǎng)基中加入過濾除菌的100 μg/mL制霉菌素和100 μg/mL重鉻酸鉀，以抑制細菌和真菌的生長；發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母粉-淀粉液體培養(yǎng)基（玉米粉1.0%、酵母粉0.1%、黃豆粉1.0%、淀粉0.5%、KH2PO40.05%，pH7.2）。形態(tài)特征鑒定培養(yǎng)基：高氏一號合成培養(yǎng)基、酵母粉-淀粉培養(yǎng)基、燕麥汁培養(yǎng)基（ISP3）、土豆汁培養(yǎng)基、無機鹽淀粉培養(yǎng)基（ISP4）和甘油天門冬素培養(yǎng)基（ISP5）。培養(yǎng)基使用70%陳海水與30%蒸餾水配制。

1.1.3 供試線蟲 初篩時使用松材線蟲，將松材線蟲接種于長有鐮刀菌的PDA培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)5 d；復(fù)篩時使用根結(jié)線蟲，將含有卵塊的胡椒根沖洗干凈，使用滅菌牙簽挑取卵塊置于無菌水中28℃培養(yǎng)孵化，收集備用。

1.2 方法

1.2.1 放線菌的分離 使用3種預(yù)處理方法（1）風干：將采集的土壤樣品自然風干1周；（2）干熱：風干樣品120℃干熱處理1 h；（3）濕熱：風干樣品55℃水浴6 min。稱取處理樣品5 g，加入滅菌陳海水45 mL，180 r/min恒溫震蕩30 min制成水懸液，室溫靜置10 min使土壤沉淀，使用無菌陳海水將上清液稀釋至10-1、10-2、10-3倍，各吸取100 μL稀釋液涂布到分離培養(yǎng)基上，每個稀釋度3次重復(fù)。將平板于28℃下恒溫培養(yǎng)2-4周，待長出明顯菌落，挑取菌落在高氏一號培養(yǎng)基上進行純化，純化菌株用20%甘油凍存于-80℃冰箱。

1.2.2 菌株的發(fā)酵培養(yǎng) 將純化后的菌株挑取單菌落接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于28℃搖床中200 r/min培養(yǎng)約7 d，10 000 r/min離心2 min后，吸取上清液備用。

抗線蟲放線菌的篩選 線蟲的初篩和復(fù)篩均采用24孔板液體篩選模型［15］。初篩時，在每孔中加入400 μL（約200條）松材線蟲液、550 μL無菌水和50 μL發(fā)酵液，混合均勻，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后用倒置顯微鏡觀察，僵直或卷曲不動的線蟲視為被擊倒，以發(fā)酵培養(yǎng)基為對照，每個試驗重復(fù)3次，計算校正擊倒率和校正死亡率。向24孔

板中加入清水觀察線蟲恢復(fù)情況，不能恢復(fù)活性的視為死亡。

3.1 PBL和CBL基于MOOC概念的混合開放在線課程(MOOC)是指通過MOOC，使得不過在哪里都可以共享豐富的學(xué)習(xí)資源，包括關(guān)于超聲醫(yī)學(xué)相關(guān)課程內(nèi)容的文本以及重要知識點的歸納。所謂MOOC概念的混合式教學(xué)法是指網(wǎng)絡(luò)教學(xué)、LBL、問題學(xué)習(xí)PBL、CBL等在MOOC平臺上的匯集成一個整體。它分為基礎(chǔ)理論階段和實踐階段。激發(fā)學(xué)生的興趣愛好是第一階段的側(cè)重點。雖然LBL非計算機專業(yè)仍是目前教育模式的主體，但是在利用動態(tài)圖像及視頻等相關(guān)技術(shù)手段時，應(yīng)當注意適度添加教師面部特征以及教師適中的語速，不僅能夠提高學(xué)生對學(xué)習(xí)知識的積極性和興趣，也可以讓學(xué)生充分利用業(yè)余時間進行預(yù)習(xí)、自學(xué)和實踐。

校正擊倒率（%）=（處理擊倒率-對照擊倒率）/（1-對照擊倒率）×100%

校正死亡率（%）=校正擊倒率×（1-恢復(fù)率）

對初篩中校正死亡率80%以上的菌株使用根結(jié)線蟲進行復(fù)篩，方法同上，并將活性菌株繼代培養(yǎng)5代，測試菌株發(fā)酵液的抗線蟲遺傳穩(wěn)定性。

1.2.3 發(fā)酵液處理時間對線蟲活性的影響 在不同的時間內(nèi)（2、4、8、12 和 24 h）觀察活性菌株的發(fā)酵液對線蟲的影響，計算校正擊倒率和校正死亡率。

1.2.4 菌株的形態(tài)和培養(yǎng)特征觀察 形態(tài)特征：采用插片培養(yǎng)法［16］觀察菌株的形態(tài)特征，28℃培養(yǎng)14 d，取出蓋玻片分別在光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下觀察菌株形態(tài)特征。培養(yǎng)特征：將菌株接種于放線菌形態(tài)特征鑒定培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7-15 d，并記錄菌株的氣生菌絲、基內(nèi)菌絲及色素產(chǎn)生情況等特征。

1.2.5 菌株的生理生化鑒定 分別對菌株的碳源利用、纖維素分解、H2S產(chǎn)生、黑色素產(chǎn)生、硝酸鹽還原等方面進行生理生化測試［17］，并分別在4、10、15、20、28、37、40、45℃條件下進行溫度耐受性試驗，分別在4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的pH值下進行pH耐受性試驗。以上測試均培養(yǎng)20 d，每5 d觀察1次。

1.2.6 16S rDNA序列分析和進化樹的構(gòu)建 使用細菌基因組DNA 提取試劑盒提取菌株的總DNA，通用引物27f（5'-AGAGTTTGATCMTGCCTCAG-3'）和1492r（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）用于進行PCR擴增菌株16S rDNA序列，PCR反應(yīng)為50 μL體系：模板DNA 1 μL，2×Es Taq MasterMix 25 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，ddH2O 22 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 5 min，94℃ 1 min，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)，72℃ 10 min。PCR擴增產(chǎn)物使用1%凝膠電泳檢測后，送至生工生物工程（上海）有限公司測序。測序結(jié)果提交至EzTaxon核酸序列庫（http：//eztaxon-e.ezbiocloud.net/）進行比對，使用MEGA5.0軟件進行多序列比對，用Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［18］。

2 結(jié)果

本研究共分離得到110株放線菌，初篩時獲得27株線蟲校正死亡率在80%以上放線菌；復(fù)篩試驗中將發(fā)酵液稀釋40倍、處理時間24 h時，獲得根結(jié)線蟲校正死亡率在50% 以上的菌株 2株，其中菌株HA10401校正擊倒率為58.4%，校正死亡率為52.6%；在發(fā)酵液稀釋20倍時，校正死亡率上升到58.2%。對該菌株連續(xù)繼代培養(yǎng) 5 次，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液抗蟲活性穩(wěn)定。將稀釋40倍的發(fā)酵液在不同的時間段內(nèi)處理根結(jié)線蟲，觀察發(fā)酵液對線蟲活性的影響情況。由圖1可以看出，隨著時間的延長，線蟲校正死亡率表現(xiàn)出增長的趨勢。

圖1 處理時間對線蟲死亡率的影響

2.2 活性菌株形態(tài)和生理生化特征

菌株HA10401在6種形態(tài)鑒定培養(yǎng)基上均生長良好，形成發(fā)達的氣生菌絲和基內(nèi)菌絲，氣生菌絲呈灰色或灰白色，基內(nèi)菌絲呈棕色或者黃色。孢子絲螺旋形，孢子卵形，表面帶短刺。在6種培養(yǎng)基上均不產(chǎn)生明顯的可溶性色素。

菌株HA10401能利用D-果糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、肌醇等，不能利用蔗糖、棉籽糖，不產(chǎn)生黑色素，淀粉水解、明膠液化、硝酸鹽不還原，具體情況，見表1。

2.3 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析

將菌株HA10401的16S rDNA經(jīng)PCR擴增后進行測序，得到長度為1 332 bp的序列（GenBank登錄號KJ523176），將該序列與EzTaxon核酸序列庫的相關(guān)菌株進行相似性比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株與Streptomyces variabilis NRRL B-3984T同源性最高，

為99.8%。選取9株同源性高的模式菌株，利用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2所示，菌株HA10401與菌株Streptomyces variabilis NRRL B-3984T在系統(tǒng)發(fā)育樹上處于同一分支，親緣關(guān)系最近。

表1 菌株 HA10401 的生理生化特征

2.4 菌株的鑒定結(jié)果

菌株HA10401與Streptomyces variabilis同源性最高（99.8%），且在發(fā)育樹上處于同一個分支。HA-10401可以水解淀粉、纖維素，液化明膠，但不能還原硝酸鹽；可以利用D-甘露醇、L-鼠李糖和L-肌醇，但不能利用蔗糖和棉籽糖。將菌株HA10401與Streptomyces variabilis的形態(tài)和生理生化特征進行比較［19］，除了Streptomyces variabilis的最高生長溫度為45℃，二者在各方面基本一致。綜合以上形態(tài)、生理生化特征和16S rDNA序列分析［20］，將菌株HA10401鑒定為Streptomyces variabilis。

3 討論

松材線蟲和根結(jié)線蟲均為植物寄生性線蟲，在生理結(jié)構(gòu)、代謝規(guī)律和生活習(xí)性等方面有一定的相似性。根結(jié)線蟲要從植物病根中獲取，目前尚不能人工培養(yǎng)，不能滿足大量的篩選需求［3］，而松材線蟲培養(yǎng)技術(shù)比較成熟，使用鐮刀菌來培養(yǎng)松材線蟲，繁殖時間短，易培養(yǎng)，可在短時間內(nèi)（3-5 d）獲得大量供試線蟲，因此，本試驗中使用松材線蟲為初篩線蟲，而根結(jié)線蟲在復(fù)篩試驗中才采用。

圖2 基于16S rDNA的菌株HA10401與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

紅樹林由于生境的特殊性，具有豐富而獨特的生物多樣性和天然產(chǎn)物資源［21］，在陸地天然產(chǎn)物的開發(fā)趨于飽和的狀態(tài)下［22］，具有更大的發(fā)現(xiàn)新型抗線蟲產(chǎn)物的潛力。根據(jù)菌株HA10401的形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，將其鑒定為Streptomyces variabilis。曾有報道從該菌發(fā)酵液中分離到新型抗生素variapeptin，該復(fù)合物能有效對抗革蘭氏陽性菌，并對哺乳動物顯示有細胞毒性［23］；Pan等［24］從Streptomyces variabilis中分離的天然產(chǎn)物ammosamide D也對MIA PaCa-2胰腺癌細胞系有一定的細胞毒性。而關(guān)于該菌株的抗根結(jié)線蟲活性在本研究中進行了首次報道，具有進一步開發(fā)的潛能。

4 結(jié)論

本試驗從海南東寨港紅樹林植物根際土壤中分離放線菌，采用24孔板液體篩選模型篩選出具有較高抗線蟲活性的放線菌菌株HA10401。該菌株發(fā)酵液在稀釋40倍、處理時間24 h時，線蟲校正擊倒率為58.4%，校正死亡率為52.6%，在發(fā)酵液稀釋20倍時，校正死亡率為58.2%。對菌株HA10401的形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定結(jié)果顯示，其孢子絲螺旋形，孢子卵形，表面帶短刺，能利用D-甘露醇、L-

鼠李糖和L-肌醇等，但不能利用蔗糖和棉籽糖，能水解淀粉、纖維素，明膠液化。菌株的16S rDNA序列與Streptomyces variabilis NRRL B-3984T同源性最高（99.8%），在系統(tǒng)發(fā)育樹上處于同一分支。綜合形態(tài)、生理生化特征及16S rDNA序列分析，將菌株HA10401鑒定為變異鏈霉菌（Streptomyces variabilis）。

［1］史學(xué)群, 宋海超, 劉柱. 海南省土壤拮抗放線菌分離方法初探［J］. 中國農(nóng)學(xué)通報, 2006, 22（10）：431-435.

［2］曾慶飛. 根結(jié)線蟲拮抗放線菌的篩選及菌株HA10002和DA09202活性物質(zhì)的研究［D］. ?？冢汉Ｄ洗髮W(xué), 2011.

［3］劉維志. 植物病原線蟲學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社, 2000：56-58.

［4］汪來發(fā), 楊寶君, 李傳道. 根結(jié)線蟲生物防治研究進展［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版, 2002, 26（1）：64-68.

［5］孔祥義, 陳綿才. 根結(jié)線蟲病防治研究進展［J］. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué), 2006, 26（2）：83-88.

［6］Davies J. Specialized microbial metabolites：functions and origins［J］. The Journal of Antibiotics, 2013, 66（7）：361-364.

［7］Berdy J. Bioactive microbial metabolites［J］. The Journal of Antibiotics, 2005, 58（1）：1-26.

［8］蔣琳, 馬承鑄. 生物農(nóng)藥研究進展［J］. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2000, 16（增刊）：73-77.

［9］Kruger GR, Xing L, LeRoy AR, et al. Resistance in soybean under midwest conditions［J］. Crop Science, 2008, 48（2）：716-726.

［10］Rodrigues KF, Petrini O. Biodiversity of endophytic fungi in tropical region［M］//Hyle KD. Biodiversity of tropical microfungi. Hong Kong：Hong Kong University Press, 1997：57-69.

［11］魏華, 劉敏, 鮑時翔, 等. 1 株抗根結(jié)線蟲紅樹林放線菌的篩選與鑒定［J］. 微生物學(xué)雜志, 2012, 32（4）：13-16.

［12］黃惠琴, 袁維道, 魏華, 等. 一株抗根結(jié)線蟲放線菌的篩選與鑒定［J］. 生物技術(shù)通報, 2013（11）：176-180.

［13］Zeng Q, Huang H, Zhu J, et al. A new nematicidal compound produced by Streptomyces albogriseolus HA10002［J］. Antonie Van Leeuwenhoek, 2013, 103（5）：1107-1111.

［14］魏華. 根結(jié)線蟲紅樹林放線菌的分離、篩選及三株活性菌株的鑒定［D］. ?？冢汉Ｄ洗髮W(xué), 2012.

［15］雷敬超. 殺線蟲海洋放線菌的篩選及菌株 HA110711 的分類鑒定［D］. 儋州：華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007.

［16］徐麗華, 李文均, 劉志恒, 等. 放線菌系統(tǒng)學(xué)：原理, 方法及實踐［M］. 北京：科學(xué)出版社, 2007.

［17］阮繼生, 黃英. 放線菌快速鑒定與系統(tǒng)分類［M］.北京：科學(xué)出版社, 2011：69-82.

［18］田鵬, 劉占林. 分子系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建的簡易方法［J］. 生物信息學(xué), 2009, 7（3）：232-233.

［19］Meleigy MA, Mokhtar MM, Mohamed HF, Salem M. Morphological, biochemical and sequence-based identification of some selenium tolerant actinomycetes［J］. New York Science Journal, 2011；4（8）：20-26

［20］王意敏, 劉志恒. 放線菌的多相分類［J］. 微生物學(xué)通報, 1999, 26（2）：137.

［21］Costanza R, d’Arge R, De Groot R, et al. The value of the world’s ecosystem services and natural capital［J］. Nature, 1997, 387（6630）：253-260.

［22］Koehn FE, Carter GT. The evolving role of natural products in drug discovery［J］. Nature Reviews Drug Discovery, 2005, 4（3）：206-220.

［23］Nakagawa M, Hayakawa Y, Adachi K, et al. A new depsipeptide antibiotic, variapeptin［J］. Agricultural and Biological Chemistry, 1990, 54（3）：791-794.

［24］Pan E, Jamison M, Yousufuddin M, et al. Ammosamide D, an oxidatively ring opened ammosamide analog from a marine-derived Streptomyces variabilis［J］. Organic Letters, 2012, 14（9）：2390-2393.

（責任編輯 李楠）

Isolation and Identification of an Actinomycetes Strain Against Rootknot Nematode from Mangrove Soil

Chen Yuqing1.2Huang Huiqin2Liu Min2Bao Shixiang2
（1. College of Environment and Plant Protection，Hainan University，Haikou 570228；2. Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops of Agriculture Ministry，Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，CATAS，Haikou 571101）

110 Actinomycetes strains were isolated by plate dilution method and anti-root-knot nematode strain HA10401 was screened by 24-well plate fluid model from mangrove soil in Dongzhaigang National Nature Reserve, Hainan Province. While the fermentation broth was diluted by 20 times and 40 times, the mortality rates against nematode were 58.2% and 52.6%, respectively. Phylogenetic analysis based on the 16S rRNA gene sequence showed that strain HA10401 was closely related to Streptomyces variabilis with the highest similarity of 99.8%, and the two strains formed a cluster in the phylogenetic tree. The morphological, cultural and biochemical characteristics were basically accorded with Streptomyces variabilis. As a result, strain HA10401 was identified as Streptomyces variabilis, and its anti-root-knot nematode activity was first reported in this study and worth further research.

Mangrove Actinomycetes Identification Root-knot nematode

2014-03-10

國家“973”計劃項目（2013CB127500），國家自然科學(xué)基金項目（31170062），國家“948”項目（2011-G25），公益性行業(yè)科研專項（201403075），海南省重大科技項目（ZDZX2013023-1），中央級公益性科研院所基金項目（ITBB11-0302）

陳雨晴，女，碩士研究生，研究方向：微生物資源與利用；E-mail：chenyuqingmz@126.com

鮑時翔，男，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：微生物資源與利用；E-mail：bsxitbb@ 163.com