宮曉寧 袁佐清 白蕓

（山東理工大學生命科學學院，淄博 255049）

PFOS對東亞三角渦蟲HSP70蛋白及基因表達的影響

宮曉寧 袁佐清 白蕓

（山東理工大學生命科學學院，淄博 255049）

全氟辛烷磺酸（Perfluorooctane sulfonate，PFOS）是一種持續(xù)的有機污染物，是全氟化合物（Perfluorinated chemicals，PFCs）在環(huán)境中的代表性物質(zhì)。以低等三胚層動物渦蟲作為試驗材料，使用Western blot及RT-PCR技術探究PFOS對渦蟲HSP70蛋白及基因表達的影響。結(jié)果表明，PFOS短時間處理能誘導渦蟲hsp70 mRNA表達量升高，渦蟲再生10 d mRNA表達受到抑制，HSP70蛋白表達量在渦蟲再生4 d和7 d時隨PFOS濃度顯著上升，其它組變化不明顯，PFOS對mRNA和蛋白表達量趨勢影響不一致，可能少量PFOS能抑制HSP70蛋白翻譯，藥物在渦蟲體內(nèi)積累量增加，蛋白高表達抵御毒性傷害。

PFOS 三角渦蟲 HSP70 RT-PCR Western blot

以全氟辛烷磺酸鹽（Perflourooctane，PFOS）為代表的全氟化合物（PFcs），曾被作為無毒化合物使用了50多年，使用范圍涉及生產(chǎn)生活的諸多方面［1-3］。PFOS具有穩(wěn)定的C-F結(jié)構，不易降解，具有生物積累作用，能夠通過食物鏈富集，從陸地到海洋，從低等藻類到高等哺乳類和鳥類都能檢測到PFOS的存在［4］。已知PFOS 集中分布于肝臟、腎臟、肺臟、血液等部位［5，6］，損害生物體的內(nèi)臟器官［5，7-9］，并對發(fā)育生殖過程具有毒害作用。毒性機理和藥代動力學研究顯示，PFOS能夠?qū)w外培養(yǎng)的細胞造成氧化壓力，破壞細胞膜，改變基因表達，損傷基因結(jié)構等［9-12］，但對其毒性作用原理仍不明確。

目前，對PFcs的研究多集中于小白鼠、魚類等脊椎動物，在無脊椎動物方面的研究仍很匱乏。本試驗以渦蟲為對象，其作為低等扁形動物，對環(huán)境變化十分敏感，并且具有強大的再生能力，是研究再生與凋亡平衡的良好材料。渦蟲暴露于高濃度PFOS中，產(chǎn)生一種外界環(huán)境壓力，而hsp70正是一種生物體應對外界壓力的標志基因［13］。本研究通過使用Western blot及RT-PCR技術檢測PFOS誘導完整渦蟲和再生渦蟲HSP70蛋白及基因表達的變化，旨在初步探究PFOS對渦蟲的毒性作用。

1 材料與方法

1.1 材料

東亞三角渦蟲采自博山泉河頭的泉水中，22℃涼開水培養(yǎng)，試驗前饑餓7 d處理。PFOS產(chǎn)自ALORICH公司，DMSO（Dimethyl Sulfoxide）產(chǎn)自Klontech公司。RNA抽提液Trizol購自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑、dNTP、Taq酶等均購自Thermo公司，一抗和二抗分別為Santa Cruz生物技術公司生產(chǎn)的HSP70/HSC70（sc-33575）和bovinerabbit IgG-HRP（sc-2370），Bioss生 產(chǎn) 的Anti-beta-Actin（Loading Control）（bs-0061R）。DAB顯色液購自天根公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR用渦蟲的處理 PFOS以0.005%的DMSO溶液溶解，配置為0、0.5、1、5、15和30 mg/L 6個濃度，每個濃度3個處理，每個處理10條渦蟲，每天更換1次培養(yǎng)溶液。處理1、4和10 d后取渦蟲提總RNA。再生渦蟲自耳突下緣切去頭部，PFOS處理方式與完整渦蟲的相同。

1.2.2 渦蟲總RNA的提取及cDNA的合成 將10條渦蟲置于1.5 mL離心管中，吸干水，液氮中迅速冷凍，使用塑料杵子研磨成粉末，加入0.2 mL Trizol，繼續(xù)研磨成糊狀，4℃ 12 000 r/min離心5 min，取上清液加入1/5體積三氯甲烷，4℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清加入等體積異丙醇，4℃ 12 000 r/min離心10 min，棄掉上清，加入1 mL 70%乙醇洗滌沉淀，4℃ 12 000 r/min離心5 min，棄乙醇，干燥皿中干燥1 h，加入適量無RNase水溶解。使用Reverse Transcriptase M-MLV進行渦蟲總RNA反轉(zhuǎn)錄，合成第一鏈cDNA。

1.2.3 PCR及電泳 自NCBI數(shù)據(jù)庫取得Djhsp70 mRNA全長序列，設計一對引物如下：hsp70 sense：5'-GGAGATACGCATTTAGGC-3'，hsp70 anti-sense：5'-TCAACTGGTTCCAAGGTC-3'，內(nèi)參β-actin sense［14］：5'-GGATGATGAGATGCGATGTTG-3'，β-actin antise-nse：5'-ATGCCAGGTCCAGATTCGTCA-3'。PCR反應程序為：94℃ 5 min；94℃ 50 s，52℃ 50 s，72℃60 s，30個循環(huán)；72℃ 10 min。保存電泳圖片并使用軟件進行亮度分析。

1.2.4 Western blot用渦蟲的處理及蛋白提取 以0、0.5、1、5和10 mg/L 5個濃度的PFOS溶液處理渦蟲，每個濃度3個處理，每個處理30條渦蟲，每天更換一次培養(yǎng)液，在1、4和7 d三個時間點取渦蟲提蛋白樣品，試驗分再生組與非再生組。提取蛋白過程為：渦蟲放入1.5 mL EP管，洗凈，將水吸干，液氮中瞬時冷凍，加適量PBS（M/V=1∶100，PBS 0.01 mol/L，pH7.4），用塑料杵子研磨至糊狀，4℃10 000 r/min離心30 min，取上清，4℃ 10 000 r/min離心15 min，取上清分裝保存。

1.2.5 Western blot檢測 渦蟲體內(nèi)HSP70蛋白變化趨勢以Western blot法進行檢測，β-Actin作內(nèi)參。蛋白樣品以10% SDS-PAGE膠電泳（Bio-Rad100-120型電泳儀，Bio-Rad miniprotea垂直電泳槽），半干法轉(zhuǎn) 膜（15 V，18 min，Bio-Rad Trans-Blot SD Cell），PBST漂洗一遍，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，4℃一抗孵育12 h，PBST漂洗3遍，4℃二抗孵育10 h，PBST漂洗數(shù)遍，DAB顯色。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR結(jié)果

PFOS誘導完整渦蟲hsp70 mRNA相對表達量變化見圖1和圖2。完整渦蟲的RT-PCR結(jié)果（圖1）顯示，在1 d時，1-30 mg/L組呈現(xiàn)高表達，表達量超過對照組的1.5倍，到4 d和10 d時這種高表達不明顯。濃度為30 mg/L的PFOS超出渦蟲的承受能力，在處理10 d時，渦蟲大量死亡，無法完成RNA提取，此組渦蟲hsp70表達量沒有數(shù)據(jù)。再生渦蟲的RT-PCR結(jié)果（圖2）表明，再生渦蟲對PFOS更加敏感，30 mg/L PFOS處理1 d造成渦蟲大量死亡，10 mg/L PFOS處理10 d造成渦蟲大量死亡，所以將PFOS最高濃度調(diào)為8 mg/L。誘導再生渦蟲1 d時，與對照組相比除5 mg/L組以外，hsp70 mRNA表達量均下降，4 d時，各濃度PFOS對hsp70基因表達量無顯著影響，10 d時，PFOS抑制hsp70的表達，并有一定濃度相關性。

2.2 Western blot結(jié)果

對于完整渦蟲，HSP70蛋白表達量變化與PFOS處理濃度存在一定相關性（圖3），多數(shù)處理條件下，PFOS誘導使渦蟲HSP70蛋白表達量略有增加，僅0.5

mg/L處理1 d組以及10 mg/L處理1 d和4 d組表達量下降，最多下降50%?？傮w來說，PFOS誘導沒有使渦蟲HSP70蛋白表達明顯變化。再生渦蟲暴露于10 mg/L PFOS 7 d時毒害作用最大，死亡率達到50%。并且再生渦蟲HSP70蛋白變化十分顯著（圖4），誘導1 d時各誘導濃度的渦蟲HSP70蛋白表達變化不顯著；誘導再生渦蟲4 d時，各組HSP70的量隨PFOS的濃度增加而升高，5 mg/L組達到最高，為對照組的8倍，再生7 d HSP70呈先下降后上升的趨勢，1 mg/L PFOS處理組表達量極低，到5 mg/L PFOS處理組表達量最高，為對照組的5倍。

圖1 完整渦蟲hsp70 mRNA相對表達量變化

圖2 渦蟲再生過程中hsp70 mRNA相對表達量變

圖3 完整渦蟲暴露于各濃度PFOS中HSP70蛋白相對表達量變化

圖4 再生渦蟲暴露于各濃度PFOS中HSP70蛋白相對表達量變化

3 討論

PFOS能引起眾多基因表達量變化，Hu等［15］將小鼠癌細胞暴露于高濃度PFOS中，約400個基因表達受到顯著影響，這些基因涉及脂肪酸同化酶、細胞色素450以及激素調(diào)節(jié)等。有試驗表明PFOS能直接破壞DNA結(jié)構［16］，但也有試驗顯示PFOS不造成基因的損傷［16］，而是具有細胞毒性［10］。PFOS的毒性機制雖然還沒有完全清楚，但

大量試驗表明，其主要作用是造成細胞的氧化壓力，體外培養(yǎng)的細胞和動植物個體試驗均顯示，PFOS誘導能造成活性氧（ROS）含量升高［17］，過氧化氫酶，超氧化物歧化酶等抗氧化酶類表達量均顯著增加［12，17-20］。hsp70是生物體應對外界壓力的標志性基因，具有抗氧化的作用。本試驗顯示，完整渦蟲短時間暴露于PFOS中，誘導hsp70表達，但暴露時間延長，逐步呈抑制表達狀態(tài)，可能是PFOS在渦蟲體內(nèi)積累量少時，能誘導hsp70表達，隨積累量增加，又存在抑制表達的作用。Anne等［21］的試驗中大西洋鮭暴露于15.1 mg/L和25.0 mg/L PFOS中1 d，hsp70 mRNA表達量顯著增加，暴露于PFOS中2 d時，25.0 mg/L組hsp70表達量較15.1 mg/L組下降，與本試驗結(jié)果一致。

本試驗分別檢測了hsp70 mRNA和蛋白表達量變化，通過比較發(fā)現(xiàn)hsp70 mRNA和蛋白表達量變化趨勢不一致，完整渦蟲暴露于PFOS中1 d時，hsp70 mRNA表達量上升，但對應HSP70蛋白不存在顯著增加，再生渦蟲長時間暴露于高濃度的PFOS中hsp70 mRNA表達量受到抑制，但對應的蛋白表達量增加數(shù)倍?？赡艽嬖赑FOS對蛋白表達的抑制作用，低濃度的PFOS能通過某種作用，在mRNA高表達的情況下降低蛋白表達量，而高濃度的PFOS不存在這種抑制作用。

本試驗中觀察到，高濃度長時間PFOS處理完整渦蟲，會造成渦蟲軀體出現(xiàn)孔洞、殘缺以至完全解體，再生渦蟲比完整渦蟲更敏感，推測試驗過程PFOS對渦蟲的氧化壓力是存在的，并且能引起渦蟲的凋亡，hsp70基因受到少量PFOS誘導作用而激活轉(zhuǎn)錄，但在蛋白表達過程中被PFOS抑制，蛋白量沒有顯著變化，大量PFOS 抑制基因的轉(zhuǎn)錄，但對蛋白表達沒有影響，所以HSP70蛋白表達量上升。另外，渦蟲在再生過程中，hsp70的表達量會有顯著升高，并且可能與再生早期干細胞的遷移聚集有關，而與細胞分裂分化無關，因此hsp70的表達在再生48 h時開始下降［22］，可能是本試驗中造成完整渦蟲和再生渦蟲基因表達不同的原因。

4 結(jié)論

PFOS刺激渦蟲能夠引起渦蟲的應激反應，影響hsp70基因的轉(zhuǎn)錄，但mRNA量和蛋白量不成線性關系，可能存在PFOS對蛋白表達的抑制作用；低劑量PFOS對hsp70的影響大于高劑量，誘導轉(zhuǎn)錄抑制蛋白量，而高劑量PFOS作用正好相反。

［1］Sinclair E, Mayack DT, Roblee K, et al. Occurrence of perfluoroalkyl surfactants in water, fish, and birds from New York State［J］. Arch Environ Contam Toxicol, 2006, 50（3）：398-410.

［2］Jin YH, Liu W, Sato I, et al. PFOS and PFOA in environmental and tap water in China［J］. Chemosphere, 2009, 77（5）：605-611.

［3］Pan G, You C. Sediment-water distribution of perfluorooctane sulfonate（PFOS）in Yangtze River Estuary［J］. Environmental Pollution, 2010, 158（5）：1363-1367.

［4］Houde M, Martin JW, Letcher RJ, et al. Biological monitoring of polyfluoroalkyl substances：a review［J］. Environmental Science & Technology, 2006, 40：3463-3473.

［5］Luebker DJ, Hansen KJ, Bass NM, et al. Interactions of fluorochemicals with rat liver fatty acid-binding protein［J］. Toxicology, 2002, 176（3）：175-185.

［6］Andersden ME, Clewell HJ, Tan YM, et al. Pharmacokinetic modeling of saturable, renal resorption of perfluoroalkylacids in monkeys-probing the determinants of long plasma half-lives［J］. Toxicology, 2006, 227（1-3）：156-164.

［7］Anne EL, Jerry LC, John LB, et al. Evaluation of placental and lactational pharmacokinetics of PFOA and PFOS in the pregnant, lactating, fetal and neonatal rat using a physiologically based pharmacokinetic model［J］. Reproductive Toxicology, 2012, 33（4）：468-490.

［8］John LN, Katherine KC, Susan AB, et al. Effects of perfluorooctane sulfonate on mallard and northern bobwhite quail exposed chronically via the diet［J］. Environmental Toxicology and Pharmacology, 2007, 23（1）：1-9.

［9］Eriksen KT, Raaschou-Nielsen O, S?rensen M, et al. Genotoxic potential of the perfluorinated chemicals PFOA, PFOS, PFBS, PFNA and PFHxA in human HepG2 cells［J］. Mutation Research, 2010, 700（1-2）：39-43.

［10］Florentin A, Deblonde T, Diguio N, et al. Impacts of two peruorinated compounds（PFOS and PFOA）on human hepatoma cells：Cytotoxicity but no genotoxicity?［J］. International Journal

of Hygiene and Environmental Health, 2011, 214（6）：493-499.

［11］Xie W, Ludewig G, Wang K, et al. Model and cell membrane partitioning of perfluorooctanesulfonate is independent of the lipid chain length［J］. Colloids and Surfaces B：Biointerfaces, 2010, 76（1）：128-136.

［12］Hu WY, Jones PD, Celius T, et al. Identification of genes responsive to PFOS using gene expression profiling［J］. Environmental Toxicology and Pharmacology, 2005, 19（1）：57-70.

［13］Basu N, Todgham AE, Ackerman PA, et al. Heat shock protein genes and their functional significance in fish［J］. Gene, 2002, 295（2）：173-183.

［14］Yuan ZQ, Zhao BS, Zhang JY, Zhang SC. Characterization and expression of djpreb Gene in the planarian Dugesia jiaoniea［J］. Molecular Biology, 2010, 44（l）：8-13.

［15］Hu WY, Jones PD, Coen WD, et al. Comparison of gene expression methods to identify genes responsive to perfluorooctane sulfonic acid［J］. Environmental Toxicology and Pharmacology, 2005, 19（1）：153-160.

［16］Lu LP, Xu LH, Kang TF, Cheng SY. DNA damage due to perfluorooctane sulfonate based on nanogold embedded in nanoporous poly pyrrole film［J］. Applied Surface Science, 2013, 284：258-262.

［17］Liu CS, Yu K, Shi XJ, et al. Induction of oxidative stress and apoptosis by PFOS and PFOA in primary cultured hepatocytes of freshwater tilapia（Oreochromis niloticus）［J］. Aquatic Toxicology, 2007, 82（2）：135-143.

［18］Panaretakis T, Shabalina IG, Grander D, et al. Reactive oxygen species and mitochondria mediate the induction of apoptosis in human hepatoma HepG2 Cells by the rodent peroxisome proliferator and hepatocarcinogen, perfluorooctanoic acid［J］. Toxicology and Applied Pharmacology, 2001, 173（1）：56-64.

［19］Xu DM, Li CD, Chen H, Shao B. Cellular response of freshwater green algae to perfluorooctanoic acid toxicity［J］. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2013, 88：103-107.

［20］Santos MA, Pacheco M, Ahmad I, Anguilla L. Antioxidants responses to in situ bleached kraft pulpmill effluent outlet exposure［J］. Environment International, 2004, 30（3）：301-308.

［21］Kr?vel AV, S?fteland L, Torstensen B, Olsvik PA. Transcriptional effects of PFOS in isolated hepatocytes from Atlantic salmon Salmo salar L［J］. Comparative Biochemistry and Physiology Part C：Toxicology & Pharmacology, 2008, 148（1）：14-22.

［22］Ma KX, Chen GW, Lou H, F EI LN. Cloning and expression analysis of hsp70 gene from freshwater planarian Dugesia japonica［J］. Biologia, 2009.64（5）：1018-1024.

（責任編輯 馬鑫）

Effects of PFOS on Expression of HSP70 in Planarian Dugesia japonica

Gong Xiaoning Yuan Zuoqing Bai Yun
（School of Life Science，Shandong University of Technogy，Zibo 255049）

Perfluorooctane sulfonate（PFOS）is a persistent organic pollutant and has been found to be the predominant perfluorinated chemicals（PFCs）in the environment. In this study, we used planarians Dugesia japonica, which belong to the phylum Platyhelminthes, class Turbellaria, as an animal assay to evaluate the toxicological effects of PFOS on protein and mRNA expression of HSP70. The results indicated that the expression of hsp70 mRNA of planarians increased exposed to PFOS in short time and decreased when planarians regenerated of 10-days. However, protein expression of HSP70 increased significantly after regenerating planarians exposed to PFOS for 4- and 7-days, and other groups were not influenced significantly. The trend of mRNA expression were inconsistent with protern. It may be that little PFOS would inhibit the translation of HSP70, and the number of HSP70 increased to protect from toxicity of PFOS as that was accumulated in planarians.

PFOS Planatian HSP70 RT-PCR Western blot

2014-02-12

國家自然科學基金資助項目（31100377），山東省自然科學基金資助項目（ZR2011CQ018）

宮曉寧，男，碩士研究生，研究方向；毒理學；E-mail：gongxiaoning321@163. com

袁佐清，女，博士，副教授，研究方向：毒理學；E-mail：yuanzuoqing2008@126.com