于曉玲阮孟斌王樹昌彭明

（1.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，?？?570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，?？?571101）

木薯干旱響應(yīng)基因MeHDS1的克隆與分析

于曉玲1，2阮孟斌2王樹昌2彭明2

（1.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，?？?570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海口 571101）

HD-Zip是植物中所特有的轉(zhuǎn)錄因子，在植物體響應(yīng)環(huán)境因子過程中起著重要的作用。以木薯cDNA為模板，利用RT-PCR技術(shù)從木薯中克隆了一個(gè)HD-Zip家族成員基因全長，命名為MeHDS1。序列分析結(jié)果表明，MeHDS1具有822個(gè)氨基酸，分子量89.07 kD，等電點(diǎn)為5.79，其開放閱讀框長2 469 bp，具有典型HD結(jié)構(gòu)域及START結(jié)構(gòu)域。該轉(zhuǎn)錄因子與棉花GL2蛋白的同源性很高，推斷其同屬第IV亞家族。MeHDS1蛋白內(nèi)含有一個(gè)核定位信號，亞細(xì)胞定位試驗(yàn)結(jié)果也證明，MeHDS1蛋白定位于細(xì)胞核與細(xì)胞壁中。實(shí)時(shí)熒光PCR分析表明，該基因在木薯根部表達(dá)量最高，受干旱誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。通過對其生物信息學(xué)分析及其在木薯中表達(dá)譜分析結(jié)果表明，MeHDS1可能作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子參與木薯非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)。

HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子 木薯 表達(dá)分析 亞細(xì)胞定位

木薯（Manihot esculenta Crantz），是大戟科植物，原產(chǎn)于南美洲亞馬遜河盆地，一年生木本灌木，是世界上第5大糧食作物，是非洲一些國家人們生存的主要食物來源［1］。木薯最大的優(yōu)點(diǎn)是不與其他糧食作物爭地，在其他作物無法生長的干旱地區(qū)，可以很好的生長。這一特性值得人們進(jìn)行研究?？购迪嚓P(guān)基因的表達(dá)需經(jīng)歷逆境信號的接受、轉(zhuǎn)導(dǎo)、誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄以及功能基因的轉(zhuǎn)錄后3個(gè)不同水平的調(diào)節(jié)。在逆境條件下，逆境相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子能與順式作用元件結(jié)合，從而調(diào)節(jié)功能基因的表達(dá)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，它們在轉(zhuǎn)基因植物中的過量表達(dá)會(huì)激活許多抗逆功能基因的同時(shí)表達(dá)。

HD-ZIP家族這一植物界獨(dú)有的轉(zhuǎn)錄因子，包含有單一的homeodomain（HD）［2］與一個(gè)亮氨酸拉鏈形成二聚體結(jié)構(gòu)（b-zip）［3］。擬南芥中有48個(gè)成員［3，4］，蛋白參與植物器官組織的發(fā)育過程、激素

作用途徑、以及對環(huán)境條件的反應(yīng)過程［5］。根據(jù)結(jié)構(gòu)域的保守性、基因結(jié)構(gòu)及獨(dú)特的生理功能，HDZIP可分為4個(gè)亞家族。其中，HD-Zip IV的結(jié)構(gòu)與HD-Zip III相似，只是缺少一個(gè)MEKHLA結(jié)構(gòu)域。這類蛋白與GL2家族相似性很高，也被命名為HDZip GL2［6］。HD-Zip IV的特征是具有TAAA core，其功能可能調(diào)控植物表皮細(xì)胞的分化［7］。科學(xué)家已經(jīng)從擬南芥［5，8，9］、棉花［10］、水稻［11］、玉米［12］等不同植物中克隆得到GL2類轉(zhuǎn)錄因子，并對其功能進(jìn)行了研究，但在木薯中尚未有相關(guān)研究報(bào)道。本研究從木薯中分離得到1個(gè)GL2類轉(zhuǎn)錄因子基因MeHDS1，探討該基因在不同組織中的表達(dá)差異及其對逆境脅迫的反應(yīng)，并對該蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位鑒定，旨在為MeHDS1基因的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

木薯華南124（SC124）由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院木薯種質(zhì)資源圃提供；煙草（Nicotiana tabacum L.）由本實(shí)驗(yàn)室保存；載體pCAMBIA1300：GFP由本試驗(yàn)室保存；引物合成及基因克隆測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 MeHDS1基因克隆 采用改良的Tris方法［13］提取木薯葉片與根部混合樣品總RNA，依照M-MLV reverse transcriptase試劑盒（TIANGEN）操作說明合成第一鏈cDNA。根據(jù)HD-Zip基因家族結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，對木薯序列數(shù)據(jù)庫（http：//www.phytozome.net/cass ava.php）中序列進(jìn)行BLAST比對，獲得一個(gè)與植物中HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子具有較高同源性的cDNA序列。利用軟件Vector NTI Advance 10設(shè)計(jì)引物：5'-TGTCGACGTGGTGAAACTT AATTTTAAG-3'（含有Sal I位點(diǎn)）；5'-TGGATCCCACAAAAGACCAGTTTAT-3'（含有BamH I位點(diǎn)），以第一鏈cDNA為摸板，通過高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：98℃10 s，55℃ 10 s，72℃ 2 min，35個(gè) 循 環(huán)；72℃5 min。PCR產(chǎn)物純化后連接到pMD18-T載體上，送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序，獲得的具有完整開放閱讀框的基因序列進(jìn)行下面進(jìn)一步的分析。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 利用在線軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析：（1）基因結(jié)構(gòu)域分析（http：//www.ncbi. nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）；（2）預(yù)測MeHDS1分子量及等電點(diǎn)：Compute pl/Mwtool，ExPASy軟件（http：//au.expasy.org/tools/pi_tool.html）；（3） 轉(zhuǎn)錄因子核定位信號預(yù)測：PSORT（http：//psort.hgc. jp/）；（4）蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)預(yù)測（http：//www.sbg. bio.ic.ac.uk/phyre2/）。

1.2.3 表達(dá)模式分析 待木薯SC124生長3個(gè)月（株高約1 m）后，選取長勢相近的植株進(jìn)行斷水干旱處理，以正常澆水的植株作為對照處理。每個(gè)處理3盆植株，平行3次重復(fù)。12 d后，分別提取木薯SC124的根、不同位置葉片、混合葉片總RNA，經(jīng)DNaseI消化后，反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA。采用qPCR的方法對MeHDS1基因的表達(dá)譜進(jìn)行分析。

1.2.4 植物表達(dá)載體構(gòu)建 中間載體pMD18-MeHDS1和植物表達(dá)載體pCAMBIA1300：GFP質(zhì)粒各約2 μg，經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I和Sal I 37℃消化3 h后，凝膠回收目的條帶；經(jīng)T4 DNA連接酶16℃連接過夜后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切、PCR鑒定，最終陽性克隆命名為pCAMBIA1300∷GFP∷MeHDS1。

將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體通過凍融法（液氮中5 min，42℃水浴5 min）轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞，在含有Rif+25 mg/L、Kan+50 mg/L和Chl+25 mg/L的YEB平板上培養(yǎng)，PCR鑒定為陽性的克隆，可進(jìn)行后續(xù)的亞細(xì)胞定位試驗(yàn)。

1.2.5 亞細(xì)胞定位 采用6 000 r/min離心10 min，收集LBA4404/P1300∷GFP∷MeHDS1（OD600為0.8）菌體，利用10 mmol/L MgCl2（+100 μmol/L AS）緩沖液重懸菌體，采用針筒注射的方法，注射煙草葉片背面細(xì)胞，共培養(yǎng)72 h后，采用共聚焦顯微鏡觀察，拍照分析。

2 結(jié)果

2.1 MeHDS1基因克隆與序列分析

國家以改善孤殘兒童成長環(huán)境、提高孤殘兒童生活質(zhì)量為目標(biāo)，提出“十一五”[1]和“十二五”兒童福利機(jī)構(gòu)建設(shè)藍(lán)天計(jì)劃暨兒童福利機(jī)構(gòu)設(shè)備配置實(shí)施方案[2]（以下簡稱“藍(lán)天計(jì)劃”）。切實(shí)加強(qiáng)兒童福利機(jī)構(gòu)基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)，保障孤殘兒童的集中養(yǎng)護(hù)、救治、教育和康復(fù)。

通過RT-PCR方法獲得一個(gè)來源于木薯SC124品種的，具有完整開放閱讀框（open reading frame，ORF），長2 469 bp的基因序列。該基因序列經(jīng)過結(jié)構(gòu)域分析（圖1）發(fā)現(xiàn)其包含一個(gè)HD 結(jié)構(gòu)域（長

59個(gè)氨基酸）、一個(gè)START結(jié)構(gòu)域（長229個(gè)氨基酸）及一個(gè)LZ區(qū)域。NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST-p結(jié)果表明，該序列與葡萄HD-Zip基因（GenBank序列號為XP_002272264）具有很高的同源性（93%）。

圖1 MeHDS1氨基酸序列（A）及蛋白保守結(jié)構(gòu)域（B）分析

序列分析表明：MeHDS1基因編碼822個(gè)氨基酸，預(yù)測其分子量為89.07 kD，等電點(diǎn)為5.79。在基因內(nèi)發(fā)現(xiàn)一個(gè)核定位信號（P113-PRKKRYH），符合轉(zhuǎn)錄因子細(xì)胞區(qū)室定位特征；通過對MeHDS1蛋白的空間結(jié)構(gòu)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)其具有3個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)（圖2）。

圖2 MeHDS1蛋白空間結(jié)構(gòu)預(yù)測

BLAST-p分析結(jié)果表明，MeHDS1蛋白與棉花GL2蛋白的同源性很高，因此推測其可能屬于HD-Zip IV亞家族成員。將MeHDS1氨基酸序列與GenBank中已登錄的、已知功能的擬南芥HD-Zip IV亞家族成員進(jìn)行序列比對，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果（圖3）顯示，MeHDS1與GL2基因同源性最高，因此進(jìn)一步推斷MeHDS1可能是HD-Zip IV亞家族GL2類轉(zhuǎn)錄因子。

圖3 MeHDS1與其他物種已知為HD-Zip IV家族系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

2.2 表達(dá)模式分析

選取生長3個(gè)月，長勢均勻的木薯SC124，進(jìn)行干旱處理，干旱12 d后，提取葉片、葉柄和根的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。針對基因區(qū)特異性片段設(shè)計(jì)引物，采用Real-time PCR手段分析MeHDS1基因在木薯不同組織中的表達(dá)模式，結(jié)果（圖4-A）顯示：干旱處理12 d的木薯不同組織中，MeHDS1基因的表達(dá)量存在差異，在葉中的表達(dá)量明顯高于根中；干旱處理后，MeHDS1基因在根與葉片組織中的表達(dá)量都有不同程度的增加，但增加的幅度在根中較葉片中要大。

圖4 q-PCR分析MeHDS1基因表達(dá)模式

2.3 植物表達(dá)載體構(gòu)建

利用帶有酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到2 469 bp的MeHDS1基因的cDNA編碼序列，條帶單一，回收后送往測序，驗(yàn)證序列為正確序列。將目的片段純化后，用限制性內(nèi)切酶BamH I和Sal I酶切（圖5-A），回收目標(biāo)片段（圖5-A-MeHDS1箭頭所示）；同時(shí)，將pCAMBIA1300∷GFP用限制性內(nèi)切酶BamH I和Sal I酶切（圖5-A），回收回收目標(biāo)大片段（圖5-A-1300箭頭所示）；將MeHDS1目標(biāo)片段與pCAMBIA1300∷GFP大片段利用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，于帶有Kan+抗性的LB平板上篩選陽性克隆。將PCR/酶切鑒定為陽性的克隆質(zhì)粒（圖5-B）進(jìn)行測序，結(jié)果表明序列是正確的，無移碼突變，命名為pCAMBIA1300∷MeHDS1∷GFP。采用凍融法將pCAMBIA1300∷MeHDS1∷GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404菌株，用于后續(xù)功能分析。

圖5 限制性雙酶切圖

2.4 亞細(xì)胞定位

本試驗(yàn)將構(gòu)建好的帶有1300∷GFP∷MeHDS1表達(dá)框的植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。采用注射方法轉(zhuǎn)化煙草葉片，共培養(yǎng)72 h。將共培養(yǎng)后的葉片經(jīng)20%甘油處理后，進(jìn)行壓片，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。熒光分析結(jié)果（圖6）表明：融合了GFP的MeHDS1蛋白在煙草葉片細(xì)胞的細(xì)胞

壁及核內(nèi)表達(dá)，初步表明MeHDS1蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)和細(xì)胞壁上。

圖6 MeHDS1蛋白的亞細(xì)胞定位

3 討論

木薯屬于典型的抗旱、耐貧瘠作物［14］。我國南方地區(qū)，在其他作物無法生長的邊緣地帶都可以見到它們的身影，其作用機(jī)理尚無確切的報(bào)道。針對木薯抗旱基因的克隆及抗逆作用機(jī)理的研究，無論是對其他作物的遺傳改良還是自身品種改良都具有尤為重要的作用。

本研究自SC124木薯品種中克隆得到一個(gè)干旱脅迫下差異表達(dá)基因的MeHDS1。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，該蛋白具有一個(gè)核定位信號；基因的亞細(xì)胞定位試驗(yàn)結(jié)果表明MeHDS1在核及細(xì)胞壁中得到表達(dá)，因此推測，MeHDS1可能是一種轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子是細(xì)胞中重要的調(diào)節(jié)機(jī)制［15］，目前得到的HD-Zip家族成員多是定位于細(xì)胞核中［16］。

MeHDS1蛋白空間結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，該蛋白具有1個(gè)保守的HD結(jié)構(gòu)域、1個(gè)LZ區(qū)域、1個(gè)START結(jié)構(gòu)域（Steroidogenic acute regulatory protein-related lipid transfer）。因此，初步推斷該基因應(yīng)該屬于HDZip家族中的一員；空間結(jié)構(gòu)分析顯示MeHDS1蛋白具有典型的3個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)，HD-zip家族多是該結(jié)構(gòu)［5］。另外，通過BLAST分析得知，MeHDS1蛋白與棉花GL2、小麥TaGL9及擬南芥AtGL2都具有很高的同源性。因此，我們推斷MeHDS1蛋白可能屬于HD-Zip IV亞家族。

HD-Zip IV這類蛋白與GL2家族相似性很高，也被命名為HD-Zip GL2［6］，它的特征是具有TAAA core，其功能可能調(diào)控植物表皮細(xì)胞的分化［7］。干旱脅迫下，木薯根系中MeHDS1蛋白表達(dá)顯著升高，我們推測干旱脅迫下該蛋白可能參與根細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究基于木薯SC124 cDNA，利用RTPCR技術(shù)成功克隆獲得1個(gè)HD-Zip家族成員基因MeHDS1。序列分析表明，其編碼822個(gè)氨基酸，分子量89.07 kD，等電點(diǎn)為5.79，其開放閱讀框長2 469 bp，具有典型HD結(jié)構(gòu)域及START結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，其與棉花GL2蛋白的同源性很高，推斷其同屬第IV亞家族。生物信息學(xué)分析表明MeHDS1蛋白內(nèi)含有一個(gè)核定位信號，通過亞細(xì)胞定位試驗(yàn)證明了此推斷，該蛋白在細(xì)胞核中優(yōu)勢表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果表明：MeHDS1基因在葉片中的表達(dá)量比根部高；干旱脅迫可不同程度提高該基因的表達(dá)，且MeHDS1基因在根部表達(dá)量升高的幅度較葉片組織增幅要大；干旱脅迫條件下，木薯植株頂端功能葉中MeHDS1基因的表達(dá)量顯著高于底部葉片。將MeHDS1基因構(gòu)建了植物過量表達(dá)載體，并成功在煙草葉片中實(shí)現(xiàn)表達(dá)。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Cloning and Functional Analysis of MeHDS1 from Cassava Responsing Drought

Yu Xiaoling1，2Ruan Mengbin2Wang Shuchang1，2Peng Ming2
（1. College of Agriculture，Hainan University，Haikou 570228；2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，CATAS，Haikou 571101）

The HD-Zip transcription factors are unique to the plant kingdom. They play important roles in plant responsing to the environmental factors. Based on the cDNA of cassava, using RT-PCR technology, one gene sequence was obtained, named it as MeHDS1. The sequence was analyzed, we got a 2 469 bp gene which have integrated ORF, MeHDS1 encoded a protein which contained 822 amino acids（89.07 kD）with an isoelectric point of 5.79. MeHDS1 have typical HD-domain, START domain. It has high homology to GL2 gene of cotton and Arabidopsis, so it might belong to HD-Zip IV subfamily. There have a nuclear localization signal in MeHDS1 protein, and which was localized in the nucleus and cell wall by subcellular localization assay in tobacco epidermal cells. Real-time PCR results showed that, MeHDS1 was upregulated under drought, and its variation of expression was more highly in root cells than that in leaves cells. Through its bioinformatics and expression analysis, we concluded that MeHDS1 may be involved in cassava abiotic stress responsed as a transcription factor.

HD-Zip transcription factor Cassava Expression analysis Subcellular localization

2014-02-28

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（2010CB126601），海南省重大科技專項(xiàng)（ZDZX2013023-1-10）

于曉玲，女，博士研究生，副研究員，研究方向：農(nóng)業(yè)生物技術(shù)；E-mail：lingdang01@126.com

彭明，男，博士，研究員，研究方向：植物遺傳學(xué)；E-mail：mmpeng_2000@yahoo.com