張昌明　張婉芬　鄭春霞　徐　峰　曾彩虹　劉志紅

大量研究表明microRNAs(miRNAs)參與腎臟發(fā)育和腎臟疾病的形成[1-3]。miRNAs表達(dá)或功能異常亦可導(dǎo)致局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)的發(fā)生[4-8]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SGS患者腎小球miRNA-30家族表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而引起足細(xì)胞Notch1和p53信號(hào)通路活化，從而導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡增加和誘發(fā)小鼠蛋白尿的發(fā)生[7]。Gebeshuber等[8]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SGS患者腎小球中miRNA-193a表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照和其他腎臟疾病患者，其通過(guò)抑制足細(xì)胞WT1、PODXL和NPHS1的表達(dá)而參與FSGS的發(fā)生。但是目前尚缺乏FSGS患者腎組織miRNAs表達(dá)譜的系統(tǒng)性分析。本研究通過(guò)TaqMan低密度芯片和qRT-PCR方法系統(tǒng)性分析了FSGS患者腎組織miRNAs表達(dá)情況及其與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)一組可能參與FSGS發(fā)病機(jī)制的miRNAs。

對(duì)象和方法

病例選擇FSGS入選標(biāo)準(zhǔn)：性別不限，年齡18～60歲，腎活檢明確診斷為特發(fā)性FSGS。腎活檢時(shí)蛋白尿定量≥3.5 g/d，血清白蛋白(Alb)≤30 g/L，血清肌酐(SCr)≤265.2 μmol/L。近3月未接受激素、環(huán)磷酰胺等免疫抑制劑治療。排除繼發(fā)性FSGS。正常對(duì)照入選標(biāo)準(zhǔn)：南京軍區(qū)南京總醫(yī)院泌尿外科明確診斷為腎癌的患者，年齡18～60歲，尿常規(guī)和尿沉渣陰性，血常規(guī)和血生化無(wú)明顯異常。所有入選者均簽署書(shū)面知情同意書(shū)。

臨床資料收集所有入組病例，收集記錄以下臨床數(shù)據(jù)：年齡、性別、24h尿蛋白定量、Alb、SCr、血尿素氮(BUN)、總膽固醇(CH)、三酰甘油(TG)和腎活檢組織中腎小球節(jié)段硬化的比例。

腎組織標(biāo)本收集FSGS患者腎組織收集：FSGS患者于B超引導(dǎo)下行負(fù)壓吸引法經(jīng)皮腎穿刺活檢術(shù)。在保證正常病理形態(tài)學(xué)檢查并不增加患者活檢風(fēng)險(xiǎn)的情況下，留取長(zhǎng)約1 cm的腎臟新鮮組織，立即置入1 ml RNA-later保存液中，-20℃保存?zhèn)溆?。正常?duì)照腎組織收集：腎癌患者行腎臟切除術(shù)過(guò)程中，腎臟離體后立即在遠(yuǎn)離腫瘤部位切取少許腎組織，置入1 ml RNA-later保存液中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

腎組織總RNA提取采用miRNeasy Mini Kit (Cat#217004，QIAGEN,Germany)并且根據(jù)廠商提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程抽提腎組織總RNA，抽提所得總RNA經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent t￣e￣c￣h￣n￣o￣l￣o￣g￣i￣e￣s，US)質(zhì)檢合格后備用。

TaqMan低密度芯片檢測(cè)將提取的腎組織總RNA，按FSGS和正常對(duì)照分別進(jìn)行混合，送Invitrogen公司行TaqMan低密度芯片檢測(cè)。芯片版本為T(mén)aqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v 3.0，采用7900HT PCR 系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)(Applied biosystems)。以U6 RNA為內(nèi)參，2[-ΔΔCT]方法計(jì)算各miRNAs的變化倍數(shù)。

差異表達(dá)miRNAs的驗(yàn)證差異表達(dá)miRNAs的驗(yàn)證采用qRT-PCR方法。10 μl逆轉(zhuǎn)錄體系包括：5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液(Takara)2 μl，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Takara)0.5 μl，dNTPs(Takara，10 mmol/L)1 μl，莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物(Applied Biosystems)1 μl，RNA 2 μl，DEPC水3.5 μl。反應(yīng)條件為：16℃，42℃，30 min，30 min，85℃，5 min。所得到的cDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?0 μl定量PCR體系包括：10×PCR緩沖液(Takara)2 μl，dNTPs(Takara，10 mmol/L)0.4 μl，MgCl2(Takara，25 mmol/L)1.2 μl，Taq酶(Takara)0.3 μl，TaqMan探針(Applied Biosystems)0.33 μl，水14.77 μl，cDNA 1 μl。反應(yīng)條件為：95℃，5 min，然后95℃，60℃，15s，1 min進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。所有的PCR反應(yīng)均行3副孔。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)分析腎組織miRNAs表達(dá)水平與臨床病理指標(biāo)間的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

基本臨床資料選取6例FSGS患者的腎活檢組織用于TaqMan低密度芯片分析。其中男性4例，女性2例；平均年齡29.05歲。3例正常對(duì)照，男性2例，女性1例，平均年齡35.32歲。qRT-PCR驗(yàn)證時(shí)選取FSGS患者14例，正常對(duì)照15例，兩組年齡、性別匹配。FSGS患者Alb水平顯著低于正常對(duì)照，SCr、BUN水平顯著高于正常對(duì)照。所有驗(yàn)證病例基本臨床資料見(jiàn)表1。

表1　局灶節(jié)段性腎小球硬化患者基本臨床資料

FSGS患者腎組織miRNAs低密度芯片檢測(cè)結(jié)果及差異miRNAs的篩選該芯片總共檢測(cè)754個(gè)miRNAs，本研究中正常對(duì)照腎組織中檢測(cè)到358個(gè)miRNAs，F(xiàn)SGS腎組織中檢測(cè)到427個(gè)miRNAs，檢出率分別為47%和57%(圖1A)。在正常對(duì)照和FSGS腎組織中共同檢測(cè)到的miRNAs有334個(gè)(圖1B)。FSGS患者和正常對(duì)照腎組織miRNAs表達(dá)存在明顯差異(圖1C)。以miRNAs變化倍數(shù)>2倍且Ct值<30作為篩選條件，在FSGS患者腎組織中差異表達(dá)的miRNAs共139個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的miRNAs有109個(gè)，下調(diào)的miRNAs有30個(gè)，圖1C和表2展示了部分差異表達(dá)的miRNAs。

圖1　TaqMan低密度芯片結(jié)果

FSGS患者腎組織miRNAs表達(dá)水平的驗(yàn)證進(jìn)行獨(dú)立樣本驗(yàn)證的miRNAs共23個(gè)(表2)，包括：(1)TaqMan低密度芯片中變化倍數(shù)>5倍且Ct值<30的miRNAs(17個(gè)，分別為miRNA-10a，miRNA-10b，miRNA-125b，miRNA-146a，miRNA-146b，miRNA-150，miRNA-155，miRNA-16，miRNA-186，miRNA-194，miRNA-200a，miRNA-200c，miRNA-204，miRNA-21，miRNA-214，miRNA-29c和miRNA-30d)；(2)與免疫反應(yīng)相關(guān)的miRNAs(miRNA-101[9,10])；(3)腎組織富集或在人、大鼠和小鼠腎臟中保守的miRNAs 5個(gè)，分別為miRNA-141，miRNA-192，miRNA-196a，miRNA-215和miRNA-27b[1,11])。qRT-PCR結(jié)果顯示，與正常對(duì)照相比，F(xiàn)SGS患者腎組織miRNA-155、miRNA-194和miRNA-215表達(dá)明顯升高，升高倍數(shù)分別為6.68，3.26和3.90(表2，圖2)。此外，我們之前的研究發(fā)現(xiàn)FSGS患者腎小球中miRNA-30d表達(dá)下調(diào)[7]，血漿miRNA-186表達(dá)上調(diào)[12]，尿液miRNA-196a表達(dá)上調(diào)[13]，因此我們特別關(guān)注這3個(gè)miRNAs在FSGS患者腎組織中的表達(dá)情況。qRT-PCR結(jié)果表明，與正常對(duì)照相比，F(xiàn)SGS患者腎組織中miRNA-30d、miRNA-186和miRNA-196a表達(dá)均無(wú)明顯變化(P值分別為0.669，0.198和0.134)。

FSGS患者腎組織miRNAs表達(dá)與臨床病理指標(biāo)相關(guān)性分析我們進(jìn)一步探討了腎組織miRNA-155，miRNA-194和miRNA-215表達(dá)變化與臨床病理指標(biāo)之間的相關(guān)性。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示FSGS患者腎組織miRNA-215變化倍數(shù)與血清CH、腎小球節(jié)段硬化比例呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.632和0.590，P值分別為0.015和0.026(圖3)。腎組織miRNA-215變化倍數(shù)與蛋白尿的相關(guān)系數(shù)為0.524，P值為0.055，差異尚未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。腎組織miRNA-155和miRNA-194變化倍數(shù)與患者年齡、性別、尿蛋白定量、Alb、SCr、BUN、CH、TG、腎小球節(jié)段硬化比例均無(wú)相關(guān)性。

表2　qRT-PCR驗(yàn)證的miRNAs及其變化

圖2　腎組織miRNA-155、miRNA-194和miRNA-215的表達(dá)變化

圖3　FSGS患者腎組織miRNA-215表達(dá)變化與總膽固醇、腎小球節(jié)段硬化比例、尿蛋白的相關(guān)性

討　　論

FSGS是臨床常見(jiàn)的腎病綜合征病理類型，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。研究表明，某些miRNAs如miRNA-30家族，miRNA-193a在FSGS患者腎小球足細(xì)胞中表達(dá)異常，通過(guò)調(diào)控足細(xì)胞中關(guān)鍵基因及相關(guān)信號(hào)通路，引起足細(xì)胞損傷、蛋白尿，而參與FSGS的發(fā)病[7,8]。系統(tǒng)、全面的掃描和分析FSGS患者腎組織miRNAs表達(dá)譜，尋找其中差異表達(dá)的miRNAs能為探尋FSGS發(fā)病機(jī)制提供新的思路。

本研究采用TaqMan低密度芯片和qRT-PCR對(duì)FSGS患者腎組織miRNAs的表達(dá)情況進(jìn)行了系統(tǒng)掃描和分析，發(fā)現(xiàn)FSGS患者腎組織miRNA-155、miRNA-194和miRNA-215表達(dá)明顯上調(diào)。更為重要的是，F(xiàn)SGS患者腎組織miRNA-215的表達(dá)變化與腎小球節(jié)段硬化比例正相關(guān)，與尿蛋白水平也有正相關(guān)趨勢(shì)。并且這些表達(dá)上調(diào)的miRNAs要么與免疫相關(guān)(miRNA-155)，要么在腎臟中特異性的富集(miRNA-194和miRNA-215)，表明它們與FSGS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并可能成為FSGS治療的新的靶點(diǎn)。

FSGS的發(fā)生與免疫功能的異常，尤其是T細(xì)胞功能異常密切相關(guān)[14,15]。復(fù)發(fā)的患者CD8+T細(xì)胞增加，血清白細(xì)胞介素2(IL-2)，可溶性IL-2受體和干擾素γ(IFN-γ)等細(xì)胞因子分泌增加，表明Th1細(xì)胞的活化[16]；而IL-13、腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平的增加，則表明Th2細(xì)胞也參與腎病綜合征患者的發(fā)病過(guò)程[17,18]；另外復(fù)發(fā)的患者T細(xì)胞中核因子κB(NF-κB)的DNA結(jié)合活性增加也表明了T細(xì)胞的活化[19]。除此之外，復(fù)發(fā)患者IL-1和IL-8水平的增加，表明單核細(xì)胞也是活化的[20]。本研究TaqMan低密度芯片結(jié)果中篩選出的多個(gè)在FSGS患者腎組織中表達(dá)上調(diào)的miRNAs都是與免疫功能有關(guān)的，包括miRNA-125b，miRNA-146a，miRNA-146b，miRNA-150，miRNA-155，miRNA-16，miRNA-196a和 miRNA-21[21]。qRT-PCR驗(yàn)證后miRNA-155在FSGS患者腎組織中表達(dá)仍上調(diào)，表明其在FSGS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮了一定作用。研究發(fā)現(xiàn)LPS或脂蛋白刺激單核細(xì)胞或者巨噬細(xì)胞后miRNA-155表達(dá)上調(diào)，表明了其與先天免疫反應(yīng)之間的聯(lián)系；而miRNA-155基因敲除小鼠出現(xiàn)免疫缺陷和對(duì)細(xì)菌感染的保護(hù)性防御反應(yīng)的缺失，則表面miRNA-155參與調(diào)節(jié)獲得性免疫反應(yīng)中的T細(xì)胞和B細(xì)胞效應(yīng)[21]。另外miRNA-155還參與T細(xì)胞的分化，如miRNA-155基因敲除小鼠的幼稚T細(xì)胞更傾向于分化為T(mén)h2細(xì)胞而非Th1細(xì)胞，同時(shí)伴隨著Th2細(xì)胞因子IL-4，IL-5和IL-10的產(chǎn)生增多[21]。有研究發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等腎臟固有細(xì)胞表面表達(dá)IL-4、IL-10、IL-13[22,23]和TNF-α[24]等多種細(xì)胞因子受體，因此miRNA-155可能通過(guò)調(diào)節(jié)全身或者腎臟局部的免疫反應(yīng)而參與FSGS的發(fā)生。當(dāng)然上述關(guān)聯(lián)在FSGS發(fā)病機(jī)制中的作用還需大量的基礎(chǔ)研究去證實(shí)。

miRNA-194和miRNA-215是腎臟特異性富集的miRNAs[11]。它們的前體miRNA-194-1和miRNA-215都位于1號(hào)染色體上，兩者之間僅相差195個(gè)堿基對(duì)，在它們的上游有多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，包括Nkx-2.5/Csx，SRY和CAAT等[11]，表明這兩個(gè)miRNAs可能受到相同的轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。本研究中也發(fā)現(xiàn)FSGS患者腎組織中這兩個(gè)miRNAs都是上調(diào)的。Wang等[25]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-192/215家族參與調(diào)節(jié)近端腎小管上皮細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)并介導(dǎo)TGF-β1/CTGF誘導(dǎo)的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化過(guò)程。Mu等[26]則發(fā)現(xiàn)高糖條件下，miRNA-215通過(guò)調(diào)節(jié)β-catenin信號(hào)通路參與TGF-β1誘導(dǎo)的小鼠系膜細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，可能參與了糖尿病腎病的發(fā)生。Lin等[27]發(fā)現(xiàn)miRNA-194通過(guò)調(diào)節(jié)ITSN1基因加強(qiáng)ITSN1/WNK依賴的內(nèi)吞作用，而高鉀能提高皮質(zhì)集合管miRNA-194的表達(dá)。miRNA-194和miRNA-215在FSGS的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮什么作用尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。FSGS患者腎組織中miRNA-194和miRNA-215的上調(diào)受哪些因素的調(diào)控，它們又通過(guò)調(diào)節(jié)哪些靶基因來(lái)參與FSGS的發(fā)生等問(wèn)題需要我們更嚴(yán)謹(jǐn)細(xì)致的基礎(chǔ)研究工作來(lái)解決。

我們之前的研究發(fā)現(xiàn)FSGS患者腎小球中miRNA-30家族表達(dá)下調(diào)[7]，本研究則發(fā)現(xiàn)FSGS患者腎組織中miRNA-30d表達(dá)無(wú)變化，之所以存在這一差異可能是因?yàn)楸狙芯渴褂玫氖悄I組織，而不是微分離的腎小球。miRNA-30家族在腎臟中含量豐富，且在腎小球足細(xì)胞、壁層上皮細(xì)胞、部分腎小管細(xì)胞都有表達(dá)[7]，這種表達(dá)變化的差異表明它們?cè)诓煌?xì)胞類型中可能發(fā)揮不同的作用。我們還檢測(cè)過(guò)FSGS患者血漿中的miRNAs表達(dá)情況[12]，發(fā)現(xiàn)血漿miRNA-186表達(dá)上調(diào)，但是并不清楚其是否來(lái)自于腎臟細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)FSGS患者腎組織中miRNA-186表達(dá)并無(wú)明顯變化。進(jìn)一步原位雜交結(jié)果顯示，即使使用較高濃度(300 nmol/L)的miRNA-186探針腎組織中也僅能發(fā)現(xiàn)較弱的雜交信號(hào)，并且FSGS患者和正常對(duì)照之間信號(hào)強(qiáng)度和分布無(wú)明顯差別，表明兩者腎組織中miRNA-186表達(dá)水平較低，F(xiàn)SGS患者血漿中表達(dá)上調(diào)的miRNA-186并不是來(lái)源于腎臟。同樣FSGS患者尿液miRNA-196a表達(dá)上調(diào)并可能作為FSGS疾病活動(dòng)的生物標(biāo)志物[13]，而腎組織中miRNA-196a表達(dá)并無(wú)變化，表明尿液中表達(dá)上調(diào)的miRNAs-196a可能也非來(lái)源于腎臟細(xì)胞。這些結(jié)果表明系統(tǒng)而全面的腎組織miRNAs表達(dá)分析，能為探尋血漿、尿液等體液中差異表達(dá)的miRNAs的來(lái)源提供依據(jù)。

研究miRNAs表達(dá)的技術(shù)平臺(tái)有很多種，本研究所使用的低密度芯片和qRT-PCR技術(shù)具有其優(yōu)越性。低密度芯片是一種高通量、省時(shí)有效的檢測(cè)手段，可以同時(shí)檢測(cè)754個(gè)人類miRNAs，在8h內(nèi)完成從逆轉(zhuǎn)錄到獲得定量PCR數(shù)據(jù)的全部過(guò)程。而qRT-PCR則是miRNAs定量的金標(biāo)準(zhǔn)，兩者都使用莖環(huán)狀的引物，具有高度的特異性[28]。兩者聯(lián)合應(yīng)用來(lái)發(fā)現(xiàn)和篩選差異表達(dá)的miRNAs能提供可靠的結(jié)果。通過(guò)這兩種方法我們也確實(shí)篩選到3個(gè)在FSGS患者腎組織中表達(dá)上調(diào)的miRNAs。

當(dāng)然，本研究也有一些不足之處。首先，本研究的樣本量較小，還需要擴(kuò)大樣本量對(duì)本文的結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證。其次，本文僅對(duì)FSGS患者腎組織miRNAs表達(dá)譜進(jìn)行了掃描，尚未對(duì)這些miRNAs在FSGS發(fā)病機(jī)制中的作用進(jìn)行研究。最后，本研究檢測(cè)的是整個(gè)腎組織中miRNAs的表達(dá)情況，并沒(méi)有探討這些miRNAs在各種腎臟細(xì)胞中的分布情況。盡管如此，本研究通過(guò)比較FSGS患者和正常對(duì)照腎組織中miRNAs的表達(dá)情況，獲得了一些可能參與FSGS發(fā)病的miRNAs，為我們的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。進(jìn)一步對(duì)目標(biāo)miRNAs的功能、定位及導(dǎo)致其在腎臟表達(dá)變化的原因做深入探討， 有助于加深我們對(duì)FSGS發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

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