秦黎 尹菁

1 江蘇省醫(yī)療器械檢驗(yàn)所 （南京 210033）

2 江蘇省食品藥品檢驗(yàn)所 （南京 210008）

0.引言

乙二胺四乙酸(EDTA)鹽作為一次性使用真空采血管中的抗凝劑在臨床上應(yīng)用廣泛。由于EDTA 對(duì)血細(xì)胞形態(tài)影響很小，因此適用于血細(xì)胞計(jì)數(shù)，特別是血小板計(jì)數(shù)。常用的EDTA 有二鈉、二鉀和三鉀鹽。乙二胺四乙酸二鈉鹽與氟化鈉混合添加的采血管還可用于血糖檢測(cè)?？鼓枰銐蛄康腅DTA，但過量的EDTA 會(huì)改變血細(xì)胞形態(tài)學(xué)，因而有必要控制真空采血管中EDTA 鹽的含量。[1]

目前常用的EDTA 檢測(cè)方法有滲透壓法[2]和滴定法，這兩種方法的專屬性較差，不能區(qū)分EDTA 與其他金屬絡(luò)合劑，尤其在有氟化鈉存在時(shí)可能對(duì)檢測(cè)有影響；靈敏度較低，對(duì)于公稱容量較小，EDTA 含量較低的樣品，在測(cè)定中可能存在較大誤差。通過比較參考文獻(xiàn)中的幾種色譜條件[3][4][5]，本文建立了一種專屬性強(qiáng)，靈敏度高，且準(zhǔn)確方便的高效液相色譜測(cè)定方法。

1.儀器與試藥

島津20AB 高效液相色譜儀（日本）；BT125D電子天平（德國Sartorius）；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純乙二胺四乙酸二鈉二水合物（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，純度≥99.0%，批號(hào)：T20090303）

一次性使用真空采血管均由蘇州魚躍醫(yī)療科技有限公司提供，樣品1（含EDTA-Na2,批號(hào)：130402，公稱容量為2ml，每毫升血液中含EDTA1.4mg～2.0mg），樣品2（含EDTA-Na2/氟化鈉,批號(hào)：130403，公稱容量為2ml，每毫升血液中含EDTA1.2mg～2.0mg；氟化鈉2mg～4mg）

2.色譜條件

色譜柱：Venusil MP C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇-25%四丁基氫氧化銨-88%甲酸-水(20:1.3:0.6:980)（pH3.5）；檢測(cè)波長：254nm；柱溫：30?C; 流速: 0.6 mL/min; 進(jìn)樣量：20 μl。

供試品溶液：取一次性使用真空采血管一支，用少量水洗滌數(shù)次，將內(nèi)含的添加劑定量轉(zhuǎn)移至20ml 量瓶，用水定容，搖勻，精密量取5ml至50ml 量瓶，精密加0.1mol/L 的三氯化鐵溶液1ml，用水定容，搖勻（乙二胺四乙酸二鈉濃度約為20μg/ml）。

該色譜條件下，乙二胺四乙酸鐵絡(luò)合物峰的理論板數(shù)為15000 左右，與相鄰峰的分離度良好，見圖1。

圖1. 高效液相色譜圖

3.方法學(xué)考察

3.1 線性范圍與定量限

精密稱取乙二胺四乙酸二鈉二水合物約100mg，加水溶解，并定容至100ml，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別精密量取5ml、4ml、3ml、2ml、1ml、0.5ml、0.2ml 至50ml 量 瓶，各 精 密加0.1mol/L 的三氯化鐵溶液1ml，用水定容，搖勻，作為線性范圍供試液。結(jié)果表明乙二胺四乙酸二鈉在4μg～100μg/ml 濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r=1.0000）。

將對(duì)照品儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋后，精密量取適量至50ml 量瓶，同法操作，得到S/N 為10 時(shí)，定量限為0.04μg/ml

3.2 精密度試驗(yàn)

取樣品2 供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，RSD為0.1%，表明進(jìn)樣精密度良好。取同一批供試品，按上述方法配制供試液共6 份，含量測(cè)定結(jié)果的平均值為1.85mg/ml，RSD 為1.5%（n=6）,表明本方法重復(fù)性良好。

3.3 回收率試驗(yàn)

精密量取乙二胺四乙酸二鈉對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，按含量測(cè)定結(jié)果的80%，100%，120%，按處方量添加同樣濃度梯度的氟化鈉作為空白背景，每個(gè)濃度測(cè)定3 份樣品，計(jì)算回收率，結(jié)果3 種濃度的平均回收率為97.4%

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品2 供試品溶液，分別在0,1,2,4,8 小時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定乙二胺四乙酸二鈉含量，計(jì)算峰面積的變化程度。結(jié)果RSD 為0.7%，表明乙二胺四乙酸二鈉溶液在室溫條件下8 小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

4.含量測(cè)定

按上述方法檢測(cè)樣品1，樣品2 兩個(gè)品種的一次性使用真空采血管，乙二胺四乙酸二鈉二水合物的含量分別為1.64mg/ml，1.87mg/ml。

5.討論

由于乙二胺四乙酸二鈉鹽在酸性條件下能與多種金屬離子螯合，選擇了CuCl2和FeCl3分別加入對(duì)照品溶液進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)，結(jié)果顯示CuCl2與EDTA 生成的絡(luò)合物峰形不如EDTA 與Fe 的絡(luò)合物好，響應(yīng)值也較低。

試驗(yàn)中比較了流動(dòng)相pH 分別為3.5，5.0 和6.0時(shí)的色譜行為，結(jié)果顯示pH 為3.5 時(shí)，色譜峰峰形最好，且溶液的穩(wěn)定性也最佳。

試驗(yàn)中同時(shí)用該方法測(cè)定了含EDTA 二鉀和三鉀鹽的一次性真空采血管，均能獲得較好的峰形和結(jié)果，同樣沒有相鄰雜質(zhì)峰干擾。

[1] 朱虎定，孫小燕. 含添加劑真空采血管對(duì)生化結(jié)果的影響分析[J]. 基層醫(yī)學(xué)論壇，2012,16（16）2133-2134.

[2] 駱紅宇，孫光宇. 滲透壓法測(cè)定一次性使用真空采血管中EDTA-K2 含量[J]. 生物醫(yī)學(xué)工程研究，2006，第3 期，182-183.

[3] 刁志忠，韓繼永，陳祥峰.HPLC 法測(cè)定注射用泮托拉唑鈉中乙二胺四乙酸二鈉的含量[J]. 藥物分析雜志，2011，31（2）：282-284.

[4] 耿志旺，劉蔚，劉茜，等.HPLC 法測(cè)定丙泊酚注射液中乙二胺四乙酸二鈉含量[J]. 藥物分析雜志，2011，31（3）：586-588.

[5] 盧京光，裴琳，周景岳，等.反相離子對(duì)色譜法測(cè)定硫普羅寧注射液中乙二胺四醋酸鹽的含量[J]. 藥物分析雜志，2011，31（4）：772-775.