苗舒越，張運(yùn)海，高 飛

(1．中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所，江蘇省醫(yī)用光學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇蘇州215163;2．中國科學(xué)院長春光學(xué)精密機(jī)械與物理研究所，吉林長春130033;3．中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049)

1 引言

激光掃描共聚焦顯微鏡［1］(Laser Scanning Confocal Microscopy)是研究微細(xì)結(jié)構(gòu)的有效技術(shù)手段和必備的大型科學(xué)儀器，在生物和工業(yè)檢測(cè)［2－3］領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。光譜成像技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)空間圖像和光譜數(shù)據(jù)的統(tǒng)一［4］，共聚焦顯微鏡中光譜成像技術(shù)的引入［5］，使得共聚焦顯微鏡在保持高清晰度和層析成像能力的基礎(chǔ)上，能夠?qū)M織樣本中的不同熒光成分進(jìn)行選擇性成像，為開展各種復(fù)雜的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)［6－9］奠定了基礎(chǔ)。

光譜選擇是激光掃描共聚焦光譜成像系統(tǒng)的基礎(chǔ)?，F(xiàn)有光譜選擇的實(shí)現(xiàn)方式有多通道探測(cè)器與移動(dòng)狹縫兩種。多通道探測(cè)器方式使用很多個(gè)單元光電倍增管(Photomultiplier Tube)組成陣列式光譜儀，按光譜進(jìn)行分段觀測(cè)，以實(shí)現(xiàn)特定譜段的選擇，蔡司(Zeiss)與尼康(Nikon)的共聚焦顯微鏡均采用此方式，由于PMT價(jià)格較昂貴，因此這種方式的設(shè)計(jì)制造成本較高;出射狹縫方式則是在光譜帶位置處設(shè)置一個(gè)可移動(dòng)狹縫，通過改變狹縫的寬度和狹縫相對(duì)于光譜帶的位置，從而實(shí)現(xiàn)特定譜段的選擇，該方式熒光選擇靈活性好，實(shí)現(xiàn)方便，設(shè)計(jì)制造成本較低。

2 原理及方案

樣本發(fā)出的激發(fā)熒光經(jīng)棱鏡分光后成像于譜面上，譜面處設(shè)置有兩個(gè)可以獨(dú)立移動(dòng)的縫片，通過控制兩個(gè)縫片的相對(duì)移動(dòng)，改變狹縫的寬度和狹縫的位置，從而只允許特定波段的熒光通過，如圖1(a)所示。系統(tǒng)中設(shè)計(jì)了三路這樣的光譜選擇通道，狹縫1的兩縫片表面鍍有反射膜，將到達(dá)縫片表面的光反射至通道 2、3，狹縫 1、2、3 分別選擇 PMT1、PMT2、PMT3上接收的光譜范圍，如圖1(b)所示。各通道觀測(cè)整個(gè)波段中的一部分，以實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)不同波段的熒光進(jìn)行成像。

圖1 基于可移動(dòng)狹縫的光譜選擇原理圖

項(xiàng)目組設(shè)計(jì)的光譜成像系統(tǒng)要求工作波長范圍為400～700 nm，最小光譜帶寬應(yīng)優(yōu)于5 nm，光譜帶寬范圍5～300 nm可調(diào)。通過計(jì)算得出，每個(gè)狹縫寬度的可調(diào)范圍為 0．04～6 mm，調(diào)節(jié)增量為 0．01 mm。

為保證位置精度，縫片由單步移動(dòng)2．5μm的步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)，主控單元選用ARM芯片，其同時(shí)對(duì)三路通道的步進(jìn)電機(jī)進(jìn)行控制。每個(gè)狹縫的控制模塊均構(gòu)成一個(gè)獨(dú)立的伺服控制系統(tǒng)，其中旋轉(zhuǎn)編碼器和光耦開關(guān)用來實(shí)現(xiàn)位置反饋。編碼器通過角度檢測(cè)反饋絕對(duì)位置，步進(jìn)電機(jī)根據(jù)負(fù)反饋進(jìn)行數(shù)次調(diào)整，以達(dá)到精確定位;光耦開關(guān)則在系統(tǒng)啟動(dòng)時(shí)精確定位縫片的初始原點(diǎn)位置并實(shí)時(shí)檢測(cè)當(dāng)前處于工作位置的狹縫，控制系統(tǒng)框圖如圖2所示。

圖2 出射狹縫控制系統(tǒng)框圖

3 設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)

3．1 步進(jìn)電機(jī)控制

步進(jìn)電機(jī)的控制信號(hào)需要兩路，如圖3所示。一個(gè)CW脈沖使步進(jìn)電機(jī)正轉(zhuǎn)一個(gè)步距角，一個(gè)CCW脈沖使步進(jìn)電機(jī)反轉(zhuǎn)一個(gè)步距角，其中CW脈沖與CCW脈沖同一時(shí)刻只能有一個(gè)存在，在步進(jìn)電機(jī)正轉(zhuǎn)脈沖后需要等待一定的時(shí)間才能發(fā)送反轉(zhuǎn)脈沖，脈沖的頻率決定了步進(jìn)電機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)的速度。

圖3 步進(jìn)電機(jī)控制時(shí)序

控制脈沖信號(hào)由作為主控單元的ARM生成，利用ARM控制器的GPIO輸出口，輸出兩路脈沖信號(hào)。在軟件上保證兩路脈沖信號(hào)不能同時(shí)存在，脈沖個(gè)數(shù)以及脈沖頻率可設(shè)定，控制電路如圖4所示。

圖4 ARM和電機(jī)驅(qū)動(dòng)器連接原理圖

3．2 編碼器設(shè)計(jì)

編碼器的輸出信號(hào)為SSI同步串行信號(hào)，輸出格雷碼，SSI實(shí)際為兩對(duì)RS422，一對(duì)時(shí)鐘觸發(fā)，一對(duì)數(shù)據(jù)發(fā)送。SSI的時(shí)序如圖5所示，時(shí)鐘信號(hào)從ARM控制器發(fā)出，以編碼器的總位數(shù)輸出N個(gè)中斷的脈沖，編碼器的絕對(duì)位置值由時(shí)鐘信號(hào)觸發(fā)，從格雷碼的高位(MSB)開始，輸出與時(shí)鐘信號(hào)同步的串行信號(hào)。不傳送信號(hào)時(shí)，時(shí)鐘和數(shù)據(jù)位均是高位，在時(shí)鐘信號(hào)的第一個(gè)下降沿，當(dāng)前位置值被儲(chǔ)存，從時(shí)鐘信號(hào)上升沿開始，數(shù)據(jù)信號(hào)開始傳送，一個(gè)時(shí)鐘脈沖同步一個(gè)數(shù)據(jù)。

圖5 SSI時(shí)序圖

利用ARM的GPIO模擬SSI時(shí)序，通過RS422芯片，實(shí)現(xiàn)差分時(shí)鐘信號(hào)的產(chǎn)生以及差分?jǐn)?shù)據(jù)信號(hào)的接收。原理電路如圖6所示，RS422芯片選擇MAX3488，供電電壓3．3 V。MAX3488的單端信號(hào)輸入口DI連接ARM的GPIO輸出口，以接收時(shí)鐘信號(hào);單端信號(hào)輸出口RO連接ARM的GPIO輸入口，將編碼器絕對(duì)位置信號(hào)傳送給ARM控制器。

圖6 編碼器與ARM連接原理圖

3．3 光耦開關(guān)設(shè)計(jì)

光耦開關(guān)選用歐姆龍的EE－SX770A，該型號(hào)的光電開關(guān)在擋光的情況下是工作狀態(tài)，輸出有效低電平;在通光的情況下是非工作狀態(tài)，輸出高電平。通過檢測(cè)輸出口的高低電平可以判斷光電開關(guān)的工作狀態(tài)，從而可以檢測(cè)相關(guān)機(jī)構(gòu)的特定位置。檢測(cè)輸出口高低電平的電路如圖7所示，利用ARM的GPIO輸入口檢測(cè)高低電平，中間利用光耦器件將光電開關(guān)側(cè)的電路與ARM側(cè)的電路隔離開來以避免光電開關(guān)側(cè)的高電平電壓損壞ARM芯片。

圖7 光電開關(guān)和ARM連接原理圖

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

狹縫位置和光譜波長之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系是實(shí)現(xiàn)基于可變移動(dòng)狹縫光譜掃描技術(shù)的基礎(chǔ)，因此首先進(jìn)行狹縫位置標(biāo)定實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中使用汞燈及激光作為標(biāo)定光波，有405 nm、435．8 nm、485 nm、546．1 nm、578 nm、638 nm共6種波長，同時(shí)接收6種光波，在CCD上觀察到6個(gè)波長點(diǎn)，計(jì)算各波長點(diǎn)在空間上的相對(duì)位置，得出的實(shí)際位置與理論波長位置存在偏差。如圖8所示，以546．1 nm波長點(diǎn)為坐標(biāo)原點(diǎn)，黑線為理論波長位置，散點(diǎn)為三個(gè)通道的實(shí)測(cè)位置。

圖8 波長位置理論值與三通道實(shí)測(cè)值

使用三次多項(xiàng)式擬合，對(duì)波長位置進(jìn)行修正，得到擬合波長曲線后，轉(zhuǎn)換為電機(jī)控制表，進(jìn)行縫片位置控制實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)表明每個(gè)縫片對(duì)于6個(gè)波長點(diǎn)均可準(zhǔn)確對(duì)心，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)于縫片位置的精確控制，其中一個(gè)縫片的位置控制如圖9所示。

通過對(duì)兩個(gè)縫片的位置進(jìn)行協(xié)調(diào)控制，本文所設(shè)計(jì)的狹縫控制系統(tǒng)能夠自由精確地控制出射狹縫的位置與寬度。最終進(jìn)行實(shí)際成像實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)使用萊卡顯微鏡自帶的樣本玻片，其含有三種熒光染料，它們分別由波長為405 nm、488 nm與638 nm的激光激發(fā)。控制三個(gè)出射狹縫，使三路通道的接收熒光波長范圍分別為410～460 nm、540～600 nm以及650～700 nm。實(shí)驗(yàn)成像如圖10所示，實(shí)驗(yàn)表明本文設(shè)計(jì)的狹縫控制系統(tǒng)能夠同時(shí)對(duì)同一樣本中不同波段的熒光成分進(jìn)行成像。

圖9 縫片位置控制實(shí)驗(yàn)

圖10 三路通道同時(shí)成像實(shí)驗(yàn)

5 結(jié)論

本文設(shè)計(jì)的激光掃描共聚焦光譜成像狹縫控制系統(tǒng)，通過伺服控制的方式，利用ARM芯片控制步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)縫片運(yùn)動(dòng)，并由編碼器和光耦開關(guān)提供位置負(fù)反饋，可精確設(shè)置出射狹縫的中心位置與寬度，從而實(shí)現(xiàn)了激發(fā)熒光中不同波長成分的選擇，其中每個(gè)出射狹縫的寬度在0．04～6 mm范圍可調(diào)，調(diào)節(jié)增量為0．01 mm，通過ARM主控單元的協(xié)調(diào)，系統(tǒng)能夠同時(shí)對(duì)三路通道中的狹縫進(jìn)行控制?？p片位置控制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該控制系統(tǒng)能夠精確控制縫片的位置，實(shí)現(xiàn)了波長選擇的功能;實(shí)際成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該系統(tǒng)能夠同時(shí)對(duì)同一樣本中不同的熒光成分進(jìn)行成像，提高了對(duì)于熒光樣品觀測(cè)的靈活性與觀察效果。

［1］ James B P．Handbook of biological confocal microscopy［M］．3rd ed．New York:Springer，2006:338 －348．

［2］ QIU Li－ rong，LIJia，ZHAOWei－ qian，et al．Laser confocal measurement system for curvature radii of lenses［J］．Opt．Precision Eng．，2013，21(2):246 － 252．(in Chinese)邱麗榮，李佳，趙維謙，等．激光共焦透鏡曲率半徑測(cè)量系統(tǒng)［J］．光學(xué) 精密工程，2013，21(2):246－252．

［3］ GUO Jun － jie，QIU Li－ rong，WANG Yun，et al．Laser differential cofocal sensor for ICF capsule measurement［J］．Opt．Precision Eng．，2013，21(3):644 － 651．(in Chinese)郭俊杰，邱麗榮，王允，等．用于慣性約束聚變靶丸測(cè)量的激光差動(dòng)共焦傳感器［J］．光學(xué) 精密工程，2013，21(3):644－651．

［4］ LIU Yu － juan，CUI Ji－ cheng，BAYANHESHIG，et al．Design and application of imaging spectrometer with convex grating［J］．Opt．Precision Eng．，2012，20(1):52 －57．(in Chinese)劉玉娟，崔繼承，巴音賀希格，等．凸面光柵成像光譜儀的研制與應(yīng)用［J］．光學(xué) 精密工程，2012，20(1):52－57．

［5］ Zhang Y H，Hu B，Dai Y K，et al．A new multichannel spectral imaging laser scanning confocalmicroscope［J］．Computational and Mathematical Methods in Medicine，2013，2013:1 －8．

［6］ Micheal B S，David M H，Jerilyn A T，et al．Hyperspectral confocal microscope ［J］．Appl．Opt．，2006，45:6283－6291．

［7］ Mazza D，Cella F，Vicidomini G，et al．Role of three － dimensional bleach distribution in confocal and two－photon fluorescence recovery after photobleaching experiments［J］．Appl．Opt．，2007，46:7401 －7411．

［8］ Kim SH，Choi D S，Kim D S．Single － molecule detection of fluorescence resonance energy transfer using confocal microscopy［J］．J．Opt．Soc．Korea，2008，12:107 －111．

［9］ Egidijus A，Bosanta R B，Christophor D，et al．Stimulated emission depletion microscopy with a supercontinuum source and fluorescence lifetime imaging［J］．Optical Society of America，2008，33(2):113 －115．