楊 卓， 楊學(xué)義， 劉獻(xiàn)明， 楊紅兵

(1．洛陽師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院 河南洛陽471022;2．洛陽師范學(xué)院 生命科學(xué)系 河南 洛陽471022)

0 引言

鋅是人體必須的微量元素之一，缺鋅將導(dǎo)致免疫力低下、生長發(fā)育緩慢，而攝入過多又會(huì)引起急、慢性中毒，嚴(yán)重者會(huì)致人死亡［1］．文獻(xiàn)［2］顯示我國兒童、青少年人群中缺鋅現(xiàn)象比較普遍，且年齡越小缺鋅越嚴(yán)重．因此，建立簡便、快速、準(zhǔn)確、靈敏的定量檢測人體中鋅含量的方法，給人們及時(shí)合理補(bǔ)鋅進(jìn)行一定的指導(dǎo)是一項(xiàng)非常有意義和有必要的工作．目前已報(bào)道痕量鋅的測定方法主要有:分光光度法［3－4］、熒光分析法［5－6］、色譜法［7］、電化學(xué)分析法［8－9］、原子吸收法［10－11］和共振散射法［12］等．分光光度法僅限于有顏色或有顏色變化的體系，熒光分析法僅限于有熒光或有熒光變化的體系，應(yīng)用受限;色譜法因其儀器和日常維護(hù)較昂貴，普及較為困難;電化學(xué)分析法因受限于電極材料而重現(xiàn)性和選擇性有待提高;原子吸收法是國家標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)定的鋅測定方法，但其存在前處理步驟繁瑣、污染較大且待測鋅元素易損失等缺點(diǎn)．共振rayleigh散射法(resonance rayleigh scattering，RRS)是一種新近發(fā)展起來的靈敏而簡易的分析技術(shù)，因其對(duì)于分子間靜電引力、氫鍵作用、疏水作用、聚集作用等弱結(jié)合力引起的相互作用十分敏銳，而備受關(guān)注［13－14］．基于此，本文研究了Zn(II)-1，10-鄰菲啰啉(phen)-曙紅Y(EY)三元體系，結(jié)果表明:在 pH 2．8～4．5的 Britton-Robinson(BR)緩沖溶液中，1，10-phen與Zn(II)形成二價(jià)螯合陽離子后，通過靜電引力和疏水作用力與EY陰離子反應(yīng)形成Zn(II):phen:EY為1∶2∶2的離子締合物，導(dǎo)致體系的熒光猝滅，二級(jí)散射(SOS)和倍頻散射(FDS)增強(qiáng)，RRS顯著增強(qiáng)，且在一定范圍內(nèi)Zn(II)濃度與熒光、散射強(qiáng)度均成線性關(guān)系．本文研究了該三元體系的熒光和散射光譜，其中RRS法具有更高的靈敏度，所以，本文以RRS法為例考察了體系的最佳反應(yīng)條件、靈敏度及選擇性，探討了三元體系的反應(yīng)機(jī)理及RRS增強(qiáng)的原因．發(fā)現(xiàn):在0．1～8 μmol/L范圍內(nèi)Zn(II)濃度與RRS強(qiáng)度成正比，檢出限可達(dá)0．71 ng/mL(325 nm)和0．49 ng/mL(560 nm)，并且具有較好的選擇性，用于人發(fā)中鋅含量的測定，結(jié)果令人滿意，據(jù)此發(fā)展了一種靈敏、簡便、快速測定鋅的RRS方法．

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 主要儀器和試劑

Hitachi F－4500型熒光分光光度計(jì)(狹縫寬度為10 nm，光電倍增管負(fù)電壓為400 V);UV－8500型紫外－可見分光光度計(jì);PHS-3C型酸度計(jì)．

Zn(II)標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取0．548 8 g二水合醋酸鋅(含量＞99．8%)，加入適量水溶解，轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，定容并搖勻，濃度為1．0 ×10－2mol/L;曙紅 Y 溶液:1．0 ×10－3mol/L;1，10-鄰菲羅啉溶液:1．0 ×10－3mol/L;上述溶液在使用時(shí)逐級(jí)稀釋成所需濃度的工作溶液．BR緩沖溶液:0．2 mol/L的NaOH溶液與0．04 mol/L H3PO4、H3BO4和HAc的混合酸按一定比例混合，并用酸度計(jì)校正．實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水，所用試劑均為分析純．

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

依次準(zhǔn)確移取一定量的Zn(II)標(biāo)準(zhǔn)溶液、1．0 ×10－4mol/L 的1，10-鄰菲羅啉溶液1．5 mL、pH 3．90 的BR 緩沖溶液0．6 mL和1．0×10－4mol/L的曙紅Y溶液2．0 mL于10．0 mL干燥潔凈的比色管中，定容后搖勻，放置2 min后于熒光分光光度計(jì)上以λem=λex方式進(jìn)行同步掃描，記錄RRS光譜，然后于560 nm處測定體系的RRS強(qiáng)度IRRS和試劑空白的RRS強(qiáng)度I0RRS，且ΔIRRS=IRRS－I0RRS;以 λem=2λex和 λem=方式連續(xù)測量體系的散射強(qiáng)度ISOS和IFDS，繪制SOS和FDS光譜圖，并分別于480 nm/240 nm和350 nm/700 nm處測量體系的散射強(qiáng)度ISOS和IFDS及試劑空白的散射強(qiáng)度I0SOS和I0FDS，ΔISOS=ISOS－I0SOS，ΔIFDS=IFDS－I0FDS;記錄反應(yīng)體系的熒光光譜．

2 結(jié)果與討論

2．1 熒光光譜

圖1是Zn(II)-1，10-phen-EY體系的熒光光譜，由圖1可知:Zn(II)本身無熒光，1，10-phen在紫外區(qū)390 nm有弱熒光，當(dāng)Zn(II)與1，10-phen共存時(shí)，其熒光特征變化不大;EY具有較強(qiáng)的熒光，其最大激發(fā)波長(λex)和最大發(fā)射波長(λem)分別位于544 nm和564 nm;當(dāng)Zn(II)-1，10-phen-EY共存時(shí)，發(fā)生明顯的熒光猝滅現(xiàn)象，最大λex和λem分別藍(lán)移至519 nm和542 nm，另在542 nm處產(chǎn)生共振熒光峰(λex=λem=542 nm)，并且熒光猝滅的程度在一定范圍內(nèi)與Zn(II)的濃度呈線性關(guān)系，該方法對(duì)于Zn(II)的檢出限為3．04 ng/mL，故可利用該體系建立熒光猝滅法測定Zn(II)的含量．

圖1 Zn(II)-1，10-phen-EY體系的熒光光譜圖Fig．1 Fluorescence spectra of the Zn(II)-1，10-phen-EY system

2．2 二級(jí)和倍頻散射光譜

圖2是體系的二級(jí)和倍頻散射光譜，由圖2可知:Zn(II)、1，10-phen和EY本身的SOS和FDS強(qiáng)度極其微弱，當(dāng)Zn(II)與1，10-phen共存時(shí)，SOS和FDS仍很微弱;當(dāng)Zn(II)-1，10-phen-EY共存時(shí)，體系的SOS和FDS強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，SOS和FDS散射峰(λem/λex)分別位于480 nm/240 nm，540 nm/270 nm，350 nm/700 nm，390 nm/780 nm，420 nm/840 nm，其散射強(qiáng)度較試劑空白分別增大 7．4，1．3，12．8，9．9，7．7 倍，因此選擇 480 nm/240 nm SOS散射峰和350 nm/700 nm FDS散射峰作為測量波長，且該兩波長處散射強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)與Zn(II)濃度成線性關(guān)系，檢出限分別為3．92 ng/mL和6．11 ng/mL，據(jù)此可建立SOS和FDS法測定Zn(II)的含量．

圖2 Zn(II)-1，10-phen-EY體系的二級(jí)和倍頻散射光譜圖Fig．2 Secondary scattering and double frequency scattering spectra of the Zn(II)-1，10-phen-EY system

2．3 RRS 光譜

圖3是Zn(II)-1，10-phen-EY體系的RRS光譜，可以看出:1)Zn(II)和1，10-phen單獨(dú)存在時(shí)的RRS光強(qiáng)度極其微弱;2)當(dāng)Zn(II)與1，10-phen共存時(shí)，RRS強(qiáng)度仍很微弱;3)EY本身在534 nm處有較強(qiáng)的RRS;4)當(dāng)Zn(II)-1，10-phen-EY共存時(shí)，體系的RRS急劇增強(qiáng)，并在325 nm和560 nm出現(xiàn)新的RRS峰，且兩波長處RRS強(qiáng)度的變化在一定范圍內(nèi)均與Zn(II)濃度成線性關(guān)系，故可利用該三元體系建立RRS法測定Zn(II)的含量;由于560 nm的線性關(guān)系較好，且靈敏度較高，檢出限可達(dá)0．49 ng/mL，所以選擇560 nm作為測量波長．

圖3 Zn(II)-1，10-phen-EY體系的共振rayleigh散射光譜圖Fig．3 Resonance rayleigh scattering spectra of the Zn(II)-1，10-phen-EY system

2．4 最佳的反應(yīng)條件

RRS法測定Zn(II)的靈敏度高于熒光猝滅法、SOS法和FDS法，因此以RRS法為例討論體系的反應(yīng)條件、反應(yīng)的機(jī)理、方法的選擇性和分析應(yīng)用．

2．4．1 酸度的影響 以BR緩沖溶液為酸度介質(zhì)，考察了溶液酸度改變對(duì)體系RRS強(qiáng)度的影響(圖4)．隨著溶液pH的增加，體系的RRS強(qiáng)度先增加后減小，而試劑空白的RRS強(qiáng)度逐漸降低，因此，體系的散射強(qiáng)度最大且穩(wěn)定的酸度范圍是pH 2．8～4．5，本實(shí)驗(yàn)選用pH 3．90．在最佳的酸度條件下，實(shí)驗(yàn)了BR緩沖溶液用量對(duì)RRS強(qiáng)度的影響，發(fā)現(xiàn):最佳BR緩沖溶液用量為0．5～0．7 mL，本實(shí)驗(yàn)選用0．6 mL．

2．4．2 1，10-phen及EY用量的影響 試驗(yàn)中分別考察了濃度均為1．0×10－4mol/L的1，10-phen和EY用量對(duì)體系RRS強(qiáng)度的影響，結(jié)果如圖5、6所示．隨著1，10-phen或EY用量的增加，體系的RRS強(qiáng)度均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢．當(dāng)1，10-phen或EY用量較低時(shí)，反應(yīng)未完全，離子締合物的濃度較低，體系的RRS強(qiáng)度較低;隨著1，10-phen或EY用量增大，離子締合物的濃度增加，體系的RRS強(qiáng)度逐漸增大;當(dāng)1，10-phen或EY用量超過一定范圍時(shí)，其大的分子結(jié)構(gòu)及分子間作用力阻礙離子締合物的形成，體系的RRS強(qiáng)度逐漸降低．另外，隨EY用量的增加，試劑空白的散射強(qiáng)度也逐漸增大．因此，最佳的1，10-phen用量范圍為1．0～2．0 mL，本實(shí)驗(yàn)選用1．5 mL;最佳的 EY 用量范圍為1．3 ～3．0 mL，本實(shí)驗(yàn)選用2．0 mL．

2．4．3 離子強(qiáng)度的影響 以0．1 mol/L NaCl為例考察了離子強(qiáng)度對(duì)RRS強(qiáng)度的影響，如圖7所示，隨著NaCl濃度的增加，溶液離子強(qiáng)度逐漸增大，而體系的RRS強(qiáng)度顯著降低，由此可見:離子強(qiáng)度對(duì)體系的RRS強(qiáng)度具有明顯的影響，體系的離子強(qiáng)度應(yīng)越低越好．

圖4 酸度的影響Fig．4 Effect of pH

圖6 曙紅Y濃度的影響Fig．6 Effect of the EY concentration

圖5 1，10-phen濃度的影響Fig．5 Effect of the 1，10-phen concentration

圖7 離子強(qiáng)度的影響Fig．7 Effect of the ionic strength

2．4．4 體系的穩(wěn)定性 試驗(yàn)研究了體系的穩(wěn)定性(圖8)，結(jié)果表明:1)反應(yīng)溫度在20～30℃時(shí)，體系較為穩(wěn)定且RRS強(qiáng)度較大;當(dāng)溫度低于20℃或高于30℃時(shí)，體系的RRS強(qiáng)度均顯著降低;2)在20～30℃的條件下該體系在2 min內(nèi)反應(yīng)完全，此后可穩(wěn)定2 h，然后略有增加．這可能是由于放置時(shí)間過長離子締合物聚集造成的．因此，實(shí)驗(yàn)均在常溫下且試劑加完混勻2 min后進(jìn)行測定．

圖8 體系的穩(wěn)定性Fig．8 Stability of the system

3 分析應(yīng)用

3．1 方法的靈敏度

在最佳的反應(yīng)條件下，研究了體系的熒光、SOS、FDS和RRS法的一元線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限，見表1．發(fā)現(xiàn):1)RRS法測定Zn(II)的靈敏度高于熒光猝滅法、SOS法及FDS法;2)RRS法在560 nm處比在325 nm處具有較高的靈敏度和較好的線性．

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的有關(guān)參數(shù)和方法的檢出限Tab．1 Analytical parameters of the calibration graphs and the detection limits

3．2 方法的選擇性

在最佳的實(shí)驗(yàn)條件下，按RRS法考察了方法的選擇性，結(jié)果表明:對(duì)于含Zn(II)5．0×10－6mol/L的測定體系，當(dāng)相對(duì)誤差控制在±5%范圍內(nèi)時(shí)，下列倍量的離子不干擾測定:人血清白蛋白、I-(20)，色氨酸(22)，蘇氨酸(32)，酪氨酸(16)，Co(II)、抗壞血酸(6)，葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖(40)，α-淀粉酶、Br－(100)，Ba(II)(80)，Ca(II)(600)，K(I)、Mg(II)、SO2－4(400)，CO2－4、HCO－3、NO－2、SO2－3、NH+4(200)，F(xiàn)－(300)，Cl－(1 000)，Mn(II)、Cd(II)(3)，Cu(II)用 5%硫脲溶液掩蔽(6．4)，F(xiàn)e(III)用 5%酒石酸鉀鈉掩蔽(4．2)，Sr(II)(5)，Ni(II)(2．4)，pb(II)(3．2)．由此可見，該體系具有較好的選擇性，可用于實(shí)際樣品的測定．

3．3 實(shí)際樣品的測定

取健康成人發(fā)樣，先后用肥皂和洗衣粉各洗滌3次，再用自來水和二次蒸餾水洗凈，烘干剪碎．準(zhǔn)確稱取處理好的人發(fā)樣0．2 g于小燒杯中，加入5 mL混合酸(HClO4∶HNO3=1∶5)，蓋上表面皿，低溫加熱消化并蒸發(fā)至近干．冷卻后，用蒸餾水溶解過濾，調(diào)濾液pH約為4后轉(zhuǎn)移入50 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻．準(zhǔn)確移取該溶液適量于10 mL比色管中，加入掩蔽劑，按實(shí)驗(yàn)方法中的RRS法測定試樣中鋅含量，結(jié)果見表2．

表2 實(shí)際樣品的測定結(jié)果Tab．2 Determination results of practical samples

4 反應(yīng)機(jī)理和共振Rayleigh散射增強(qiáng)的原因

4．1 離子締合物的組成

分別用摩爾比法和等摩爾連續(xù)變化法測定了離子締合物的組成(圖9和圖10)，結(jié)果表明Zn(II):phen:EY=1∶2∶2．反應(yīng)機(jī)理探討如下:一個(gè)二價(jià)鋅離子存在4個(gè)雜化空軌道;一個(gè)phen分子中含有兩個(gè)帶有孤對(duì)電子的N配位原子，當(dāng)兩者共存時(shí)，一個(gè)二價(jià)鋅離子可以和兩個(gè)phen分子配位形成較為穩(wěn)定的二價(jià)陽離子螯合物．水溶液中，曙紅 Y的分子結(jié)構(gòu)式見圖11，存在以下4種型體:H3L+、H2L、HL－和 HL2－，pKa1=－2．10、pKa2=2．85 和 pKa3=4．95［15］，當(dāng)溶液的 pH 在3．85 ～3．95(pKa2+1 ＜ pH ＜ pKa3－1)時(shí)，HL－為主要存在型體，且當(dāng)溶液的pH為3．90(pH=(pKa2+pKa3)/2)時(shí)，HL－型體的量達(dá)到最大．因此，在pH 3．90的弱酸介質(zhì)中，Zn(II)與phen先形成二價(jià)螯合陽離子，再進(jìn)一步與一價(jià)大陰離子EY依靠靜電引力和疏水作用力形成離子締合物，其結(jié)構(gòu)式如圖12所示．

圖9 摩爾比法Fig．9 Method of molar ratio

圖10 等摩爾連續(xù)變化法Fig．10 Method of continuous variations of equimolar

圖11 水溶性曙紅Y的分子結(jié)構(gòu)式Fig．11 Structure of EY water soluble

圖12 離子締合物的結(jié)構(gòu)式Fig．12 Structure of ion-association complex

4．2 共振Rayleigh散射增強(qiáng)的原因

圖13是Zn(II)-1，10-phen-EY體系的共振 rayleigh散射光譜圖與吸收光譜圖的比較，可以看出，體系的共振rayleigh散射光譜均位于吸收帶中，并且325 nm和560 nm的RRS峰分別位于吸收峰300 nm和548 nm附近，因此散射和光吸收之間發(fā)生共振而產(chǎn)生增強(qiáng)的rayleigh散射，這是散射增強(qiáng)的重要原因之一．

另外，根據(jù)簡化的rayleigh散射公式IRRS=KMI0c可知，當(dāng)測定條件(K、I0)和溶液濃度(c)一定時(shí)，散射光強(qiáng)度(IRRS)和粒子分子量(M)成正比，因此三元離子締合物的形成使得分子量大幅的增加，這是導(dǎo)致散射增強(qiáng)的又一重要原因．

圖13 Zn(II)-1，10-phen-EY體系的共振rayleigh散射光譜圖與吸收光譜圖的比較Fig．13 Comparison of the RRS spectrum and the absorption spectrum of Zn(II)-1，10-phen-EY system

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