吳路民 劉偉芬 李祿輝

（1.輔仁藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河南 鹿邑477293；2.河南省醫(yī)藥學(xué)校，河南 開封475004）

1 衍生技術(shù)

隨著液相色譜技術(shù)的發(fā)展， 要求使用通用型的高靈敏檢測器，但迄今為止，高效液相色譜還沒有一個(gè)足以同氣相色譜相比擬的通用型檢測器。 為了擴(kuò)大高效液相色譜的適用范圍，提高檢測靈敏度和改善分離效果，采用化學(xué)衍生法是一個(gè)行之有效的途徑。 化學(xué)衍生法是借助化學(xué)反應(yīng)給樣品化合物接上某個(gè)特定基團(tuán)，從而改善樣品混合物的檢測性能和分離效果。

高效液相色譜的化學(xué)衍生法是指在一定條件下利用某種試劑(一般稱作化學(xué)衍生試劑或標(biāo)記試劑)與樣品組分在色譜分離之前或分離之后發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而使得反應(yīng)產(chǎn)物有利于色譜檢測或分離。 簡言之，化學(xué)衍生法主要有以下幾個(gè)目的：

（1）提高對樣品的檢測靈敏度；

（2）改善樣品混合物的分離度；

（3）適合于進(jìn)一步作結(jié)構(gòu)鑒定，如質(zhì)譜，紅外或核磁共振等。

衍生主要分為紫外和熒光衍生， 下面我們將介紹這兩種衍生方法。

1.1 紫外衍生技術(shù)

紫外衍生即加入發(fā)色團(tuán)使正常形式下不能被檢測的物質(zhì)能夠檢測。 發(fā)色團(tuán)應(yīng)具有較大的摩爾吸收系數(shù)，使其吸收光譜能盡量提高檢測靈敏度，使背景噪音變小。

一般情況下用于紫外衍生的試劑要有兩個(gè)重要的官能團(tuán)。第一個(gè)用于控制試劑與被測物反應(yīng)，第二個(gè)用于紫外檢測，即發(fā)色團(tuán)。

常用的紫外衍生試劑有4-溴甲基-7 甲氧基香豆醛、 對-(9-葸酰氧基)苯甲酰甲基溴化物、對-硝基芐基-N，N，-二異丙基異脲、3，5-二硝基芐基-N，N’-二異丙基異脲、溴化對-溴苯甲酰甲基、卜氨基萘(1.NA)、3，5-二硝基氯芐，4-二甲基胺偶氮苯-4-亞磺?；?卜萘異氰酸酯、對-硝基芐基羥胺鹽酸鹽、3，5-二硝基芐基羥胺鹽酸鹽、N-琥鉑酰亞胺基-對-硝基苯醋酸酯、N-琥鉑酰亞胺基-3，5-二硝基苯醋酸酯等。

1.2 熒光衍生技術(shù)

高效液相色譜的熒光檢測器比紫外檢測器靈敏度更高。具有強(qiáng)紫外吸收的化合物檢測靈敏度可達(dá)ng 級水平， 而熒光衍生物的檢測水平一般為10-12.1044mol／L 靈敏度比紫外檢測器提高10-100 倍。HPLC 結(jié)合熒光檢測方法所具有的高選擇性、高靈敏度以及試樣用量少的特性， 使得其對各種復(fù)雜生物樣品中的分析物測定變得更加靈敏、準(zhǔn)確、快速。 但熒光檢測器要求被檢測樣品能被激發(fā)產(chǎn)生熒光。 對于熒光較弱或不產(chǎn)生熒光的樣品靈敏度則很低，甚至不能被檢測。 為了擴(kuò)大檢品范圍，提高檢測靈敏度，常采用熒光衍生法。

衍生化反應(yīng)的關(guān)鍵是衍生試劑的選擇，從實(shí)際分離和檢測經(jīng)驗(yàn)方面考慮，用于熒光衍生化反應(yīng)的衍生化試劑應(yīng)具備下列條件：（1）試劑應(yīng)具有較大的摩爾吸光系數(shù)。（2）試劑應(yīng)具有良好的發(fā)光發(fā)色性能，與分析物結(jié)合后不減弱。 （3）衍生試劑對某一官能團(tuán)的衍生反應(yīng)具有高度選擇性。（4）過量衍生試劑易從反應(yīng)產(chǎn)物中分離，衍生物應(yīng)具有好的色譜分離穩(wěn)定性。 （5）在溫和條件下能夠很快定量地生成衍生物。 （6）形成的衍生物的熒光信號應(yīng)遠(yuǎn)高于溶劑的背景吸收，對比明顯且檢測靈敏度高。 （7）試劑合成方法簡單，原料易得、毒性小。 （8）生成的衍生物在甲醇或乙睛溶液中有足夠的溶解度。 （9）衍生物對光有足夠穩(wěn)定性。

目前常用的熒光衍生化試劑有：熒光胺、鄰苯二甲醛、丹酰氯、4-氯-7-硝基-2，1，3-苯駢惡二唑等。 熒光胺是最常用的熒光衍生化試劑，可同伯胺及大多數(shù)氨基酸反應(yīng)，反應(yīng)迅速，衍生物具有高的熒光強(qiáng)度，而試劑本身則迅速水解為不發(fā)熒光的產(chǎn)物，是一種理想的柱前衍生化試劑；丹酰氯是應(yīng)用最廣的熒光衍生試劑，常用于含氨基藥物的測定，同伯胺和仲胺都能反應(yīng)，也可用于含酚羥基的藥物如雌激素的測定；鄰苯二甲醛，常用于伯胺類及氨基酸類化合物的熒光分析。胺類化合物的衍生試劑還有熒光素異硫氰酸酯、芴代甲氧基酰氯、4-氯-7-硝基.2，1，3.苯駢惡二唑、6-氨基喹啉琥珀酰亞胺碳酸酯等。 目前已開發(fā)出一些醇和酸的衍生化試劑。 醇、酚的衍生試劑有：羰基氯類，芴代甲氧基酰氯；磺酰氯類，丹酰氯，鹵代三嗪類，1-乙氧基-4-(二氯.三嗪)萘(EDTN)；羧酸類化合物的衍生試劑有：4-溴甲基.7-甲氧基香豆素，7-N-哌嗪-4-二甲氨基苯駢呋喃重氮、9-葸重氮甲烷、4-氨甲基.6，7-二甲基香豆素、9-(2-羥乙基).吖啶酮等。 羰基化合物的衍生試劑還有肼類，如DNs.H、CEOC.H；氨基類，如氨基甲基芘等。

衍生化反應(yīng)從是否形成共價(jià)鍵來說，可分為兩種：標(biāo)記和非標(biāo)記反應(yīng)，標(biāo)記反應(yīng)是在反應(yīng)過程中，被分析物與標(biāo)記試劑之間形成共價(jià)鍵。而所有其它類型的反應(yīng)，如形成離子對、光解、氧化還原反應(yīng)、電化學(xué)反應(yīng)等都是非標(biāo)記反應(yīng)。另一種區(qū)分衍生化反應(yīng)是根據(jù)衍生反應(yīng)的場所，分為柱前衍生化，柱上衍生化和柱后衍生化三種。從是否與儀器聯(lián)機(jī)的角度來分有在線和離線兩種。 目前在HPLC 中以離線的柱前衍生法(簡稱柱前衍生法)與在線的柱后衍生法(簡稱柱后衍生法)使用居多。

柱前衍生是在色譜分離前，預(yù)先將樣品進(jìn)行衍生，然后根據(jù)衍生物性質(zhì)進(jìn)行色譜分離并檢測的方法，其優(yōu)點(diǎn)是勿需考慮衍生反應(yīng)的動力學(xué)因素，衍生化試劑、反應(yīng)條件和反應(yīng)時(shí)間的選擇不受色譜系統(tǒng)的限制，不需附加儀器設(shè)備。缺點(diǎn)是操作過程較繁瑣，容易影響定量分析的準(zhǔn)確性， 且衍生反應(yīng)形成的副產(chǎn)物可能對色譜分離造成較大干擾，從而影響分析結(jié)果。 但使用柱前衍生化方法衍生效率高，所以柱前衍生仍是目前分離分析中最常用的方法之一。

柱后衍生是將混合樣品先經(jīng)色譜柱分離，再進(jìn)行熒光標(biāo)記，最后進(jìn)入檢測器檢測的方法，是液相色譜中比較常用的一種手段。 在分離柱和檢測器之間連接一個(gè)小型反應(yīng)通道，反應(yīng)混合物以恒定的速度流過，使得衍生反應(yīng)的操作簡便、重現(xiàn)性好，并且可連續(xù)反應(yīng)，便于實(shí)現(xiàn)分析自動化，因此引起了許多分析專家的興趣。 但由于反應(yīng)是在色譜系統(tǒng)中進(jìn)行，對衍生試劑、反應(yīng)時(shí)間和其它反應(yīng)條件均有嚴(yán)格限制，需要通過控制反應(yīng)通道的尺寸、流動相的流量以及反應(yīng)通道的溫度來實(shí)現(xiàn)在特定溫度下特定時(shí)間內(nèi)的反應(yīng)，所以在一定程度上限制了它的廣泛應(yīng)用。

2 色譜聯(lián)用技術(shù)

由于色譜和各種光譜、質(zhì)譜手段的多樣性，包含了各種各樣的聯(lián)用方式和技術(shù)，包括不同色譜技術(shù)之間的聯(lián)用等。 由于對分析要求的日益增高和各種微量、高通龜色譜及光譜、電子計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，每種聯(lián)用均得到較大發(fā)展，其中最引人注目的是色譜與質(zhì)譜的成功聯(lián)用與多維色譜技術(shù)。

2.1 多維色譜技術(shù)

常規(guī)的以一維色譜為核心的分析方法由于峰容量的限制，樣品分析時(shí)要么采用繁瑣的預(yù)處理方法，要么采用選擇性的檢測器，否則色譜峰重疊不可避免。 為了解決這方面的共性問題，建立多維分離方法十分必要。多維色譜分離技術(shù)是將樣品注入呈正交分布的多個(gè)分離體系中，樣品中各組分以進(jìn)樣點(diǎn)為原點(diǎn)在多維的分離方向上展開。 多維液相色譜在不同的分離階段采用不同的分離模式，而分離階段的數(shù)日多少被稱為維度。 對于柱串聯(lián)色譜系統(tǒng)而言，其維度依據(jù)所連接分離模式的數(shù)目可以是2.3，或更多。 因此，多維分離系統(tǒng)提供了比一維系統(tǒng)更多的分離空間，允許組分峰沿著各分離維的坐標(biāo)方向展開，從而減少了峰重疊。

多維色譜實(shí)現(xiàn)的關(guān)鍵技術(shù)在于樣品在兩種分離模式之間的轉(zhuǎn)換，接口與控制技術(shù)是該項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用的瓶頸。 Ste-ven[91]綜述了多維液相色譜分離在生物醫(yī)學(xué)和藥物分析中的應(yīng)用，指出在多維色譜法中樣品使用的不僅僅是一種分離機(jī)制，任何一種分離機(jī)制都被看成是獨(dú)立的分離維數(shù)，被測物的分析可以通過離線收集或直接在線完成。

2.2 色譜／質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

在色譜／質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)中，氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC/MS）是開發(fā)最早的色譜聯(lián)用儀器，現(xiàn)已廣泛用于藥物濫用監(jiān)測、興奮劑檢測、臨床疾病診斷、藥動學(xué)研究等體內(nèi)藥物分析。 液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HP I-C/MS）的發(fā)展主要體現(xiàn)在液相色譜通過各種連接口與各種質(zhì)譜的聯(lián)用上。 目前，大氣壓下的液相色譜與質(zhì)譜的聯(lián)用接口主要是電噴霧接口（ESI）和大氣壓下化學(xué)電離接口（APCI），其原理是利用氣體輔助（或加高壓）下流動相進(jìn)行噴霧，將溶劑揮發(fā)掉，同時(shí)，流動相中的溶質(zhì)分子在大氣壓下進(jìn)行電離。 這種方式在很大程度上解決了使用LC/MS 時(shí)對流動相的限制問題， 靈敏度也得到了很大的提高。 HPLC/MS技術(shù)可以用來對新藥研發(fā)的各個(gè)階段進(jìn)行整體分析，并測定和評價(jià)這些新的化學(xué)實(shí)體的各種物理和化學(xué)性質(zhì)。 此外，一系列的藥物代謝和藥動學(xué)實(shí)驗(yàn)需要測定藥物的吸收、分布、代謝和排泄的特征，以及分析藥動學(xué)（PK）參數(shù)。 藥物代謝研究是LC/MS 的一個(gè)重要的應(yīng)用方面，LC/MS 除了可確定分子量以外，還可以根據(jù)特異性斷裂規(guī)律推導(dǎo)出部分結(jié)構(gòu)共至是完整的結(jié)構(gòu)。LC/MS 鑒定藥物代謝產(chǎn)物主要包括以下幾個(gè)步驟：測定原形藥物的質(zhì)譜；選擇準(zhǔn)分子離子、加合離子和主要的碎片離子進(jìn)行多級質(zhì)譜分析；選擇原形藥物的主要中性丟失，測定生物樣品的中性丟失譜，圖譜中的離子即為原形藥物和可能的代謝物的分子離子；選擇主要的子離子測定生物樣品的母離子譜，所得母離子即為各個(gè)代謝物；測定生物樣品中所有可能代謝物的子離子譜，解譜得到代謝物的結(jié)構(gòu)。 串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）是將一個(gè)質(zhì)量選擇的操作接到另一個(gè)質(zhì)量選擇的后面， 在單極質(zhì)譜給出化合物相對分子量的信息后，對準(zhǔn)分子離子進(jìn)行多極裂解，進(jìn)而獲得豐富的化合物碎片信息，確認(rèn)目標(biāo)化合物，對目標(biāo)化合物定量。 HPLC/MS/MS 聯(lián)用技術(shù)在新藥研發(fā)和藥物研究方面已成為一種很重要的應(yīng)用技術(shù)。大部分的候選藥物的分析方法都是以GC 或HPLC 為基礎(chǔ)的，并且這種技術(shù)已經(jīng)使藥物代謝并入藥物的研發(fā)過程中。 MS/MS 與單級MS 相比，能明顯改善信號的信躁比，具有更高的靈敏度及選擇性，其檢測水平可以達(dá)到pg 級，其高靈敏度和寬選擇性使得血漿中的藥物分析發(fā)展成為快速、定量的分析。 當(dāng)前，CE 的檢測通常由紫外、二極管陣列或激光誘導(dǎo)熒光等檢測器來完成。 近年來，由于MS 能提供更為豐富的有關(guān)相對分子質(zhì)量和分子結(jié)構(gòu)的信息， 已經(jīng)成為CE 的最重要的檢測技術(shù)之一，CE/MS聯(lián)用技術(shù)得到很大的發(fā)展。 CE/MS 聯(lián)用中，主要離子化手段有快原子轟擊（FAB）和電噴霧電離（ESI）離子化；而CE 的分離模式則主要集中在CZE，MEKC，毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）和毛細(xì)管等速電泳（CITP）等。CE/MS 聯(lián)用的關(guān)鍵問題是CE 和MS 的接口技術(shù)。 當(dāng)前主要采用無鞘接口、液體接界和鞘式液體接界等接口技術(shù)。CE/MS 雖然發(fā)展很快，但是現(xiàn)階段，該技術(shù)的應(yīng)用廣度離常規(guī)定量檢測還有很大距離。 主要問題是：較低的樣品利用率以及由此產(chǎn)生的較弱的濃度靈敏度；與LC／MS 相比有更大的檢測波動性； 分離靈敏度過于依賴樣品基底離子強(qiáng)度等，解決這些問題必將是未來CE／MS 聯(lián)用技術(shù)發(fā)展的重點(diǎn)。

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