吳雪萍 馬海濤 馮艷微 劉相全① 潘 英

(1. 廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 南寧 530004;2. 山東省海洋資源與環(huán)境研究院 山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點實驗室 煙臺 264006)

縊蟶(Sinonovacula constrictaLamarck)俗稱蟶子,屬于軟體動物門(Mollusca)、瓣鰓綱(Lamellibranchia)、異齒亞綱(Heterodonta)、簾蛤目(Veneroida)、竹蟶科(Solenidae)、縊蟶屬(Sinonovacula), 在中國和日本沿海均有分布, 為廣溫廣鹽性的海產(chǎn)雙殼貝類。其肉味鮮美, 營養(yǎng)豐富, 具有食用和藥用價值, 是中國四大養(yǎng)殖貝類之一。近年來, 無序養(yǎng)殖、盲目移種, 以及海洋資源的過度捕撈和海水環(huán)境污染的加劇, 造成縊蟶種質(zhì)資源混雜和野生群體數(shù)量衰減(劉博等,2013)。

微衛(wèi)星DNA是指以少數(shù)幾個核苷酸(多數(shù)為2—6個)為單位的多次串聯(lián)重復(fù)的DNA序列, 亦稱簡單重復(fù)序列(simple sequence repeats, SSR)、短串聯(lián)重復(fù)(short tandem repeats, STR)、簡單序列長度多態(tài)性(simple sequence length polymorphism, SSLP)等。由于其遵循孟德爾遺傳規(guī)律, 具有共顯性、高度多態(tài)性、數(shù)量豐富、可重復(fù)性強等特點, 已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于貝類遺傳多樣性分析及遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等方面的工作。關(guān)于縊蟶微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā), 僅有少數(shù)學(xué)者作了相關(guān)報道: 牛東紅等(2008)利用磁珠富集法和PCR篩選法開發(fā)了18對微衛(wèi)星引物; Jiang等(2010)利用磁珠富集法開發(fā)了14對微衛(wèi)星引物; 劉博等(2012)從EST數(shù)據(jù)庫中開發(fā)了14對多態(tài)性引物并對樂清灣縊蟶群體進(jìn)行多樣性分析。但這些標(biāo)記遠(yuǎn)不能滿足其遺傳圖譜構(gòu)建及數(shù)量性狀位點定位(QTL)等方面的研究,急需開發(fā)出更多的微衛(wèi)星標(biāo)記。本研究利用磁珠富集和PCR篩選相結(jié)合的方法, 快速分離得到12對微衛(wèi)星引物并在長竹蟶(Solen strictus)、大竹蟶(Solen grandis)和小刀蟶(Cultellus attenuatus)進(jìn)行通用性分析。

1 材料與方法

1.1 材料

縊蟶、長竹蟶及大竹蟶活體樣品均采自山東省煙臺市, 小刀蟶活體樣品采自東營市, 取其閉殼肌保存于75%酒精中, –20°C備用。

1.2 縊蟶基因組DNA的提取及酶切

利用北京天根海洋動物組織基因組提取試劑盒提取縊蟶基因組DNA后, 再用限制性核酸內(nèi)切酶Sau3AI對至少5μg的DNA進(jìn)行酶切, 反應(yīng)總體積50μL, 包含: 10×buffer (TaKaRa) 5μL, DNA模板40μL,Sau3AI 0.6μL, 超純水4.4μL。經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠檢測酶切完全后, 使用生工生物(上海)有限公司的SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行回收400—1000bp片段。

1.3 接頭序列的制備及連接

等摩爾混合兩條寡核苷酸鏈SauA: 5’-GATCGT CGGTACCGAATTCT-3’,SauB: 5’-GTCAAGAATTC GGTACCGTCGAC-3’, 經(jīng)95°C變性10min后, 室溫放置4—5小時使其復(fù)性。回收產(chǎn)物與雙鏈接頭的連接采用10μL的反應(yīng)體系, 包含: 接頭5μL; 膠回收DNA 3μL; 10×buffer (Takara) 1μL; T4連接酶(Takara)1μL, 16°C過夜連接。

1.4 第一次PCR擴增及純化

PCR反應(yīng)的總體積為25μL: 去離子水13.6μL;5×buffer (promega) 5μL; dNTP 1μL; Mg2+2μL;SauA(10μmol/L) 2μL; 目標(biāo)DNA 100ng;Taq酶(promega)0.4μL。

PCR程序為94°C預(yù)變性5min, 94°C 50s, 60°C 50s, 72°C 1min, 30個循環(huán), 最后72°C延伸10min。

1.5 磁珠富集

磁珠(Promega)上包被的鏈霉親和素(Strep tavidin)可與探針(CA)16和(GA)16上的生物素(biotin)結(jié)合, 從而通過磁力將探針連同所需的微衛(wèi)星序列一同分離出來。

1.5.1 PCR產(chǎn)物變性與雜交 探針雜交體系為100μL: PCR純化產(chǎn)物10μL, 生物素標(biāo)記的DNA探針(CA)16和(GA)16各200pmol, 20×SSC 15μL。雜交液放入PCR儀中95°C變性5min, 迅速置于冰上冷卻后, 68°C溫浴1h。

1.5.2 磁珠準(zhǔn)備 取一管新鮮的磁珠(Promega),輕柔混勻磁珠懸浮液, 吸取100μL放入1.5mL滅菌離心管中, 在磁力架上除去上清后, 用100μL 0.5×SSC清洗3次并除去上清。

1.5.3 富集

(1) 將雜交混合液加入到磁珠管中, 25°C放置30min, 每10min 混勻1次, 除去上清;

(2) 用100μL 6×SSC, 室溫清洗2次, 每次4min;

(3) 用100μL 3×SSC, 68°C清洗2次, 每次13min;

(4) 用 100μL 6×SSC, 室溫清洗2次, 每次8min。

1.5.4 捕獲含微衛(wèi)星序列的單鏈DNA 除去上清,加入30μL滅菌水, 轉(zhuǎn)入PCR管, 95°C熱洗脫10min,迅速吸取上清液至另一滅菌1.5mL離心管中, 即為雜交后單鏈DNA。

1.6 第二次PCR擴增含微衛(wèi)星序列的DNA片段

以SauA為引物, 對富集的DNA單鏈片段進(jìn)行PCR擴增, 25μL反應(yīng)體系:SauA 2μL, 5×buffer(Promega) 5μL, dNTP 1μL, Mg2+2μL, 目標(biāo)DNA 6μL,Taq酶0.4μL。1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后經(jīng)生工生物(上海)柱式PCR純化試劑盒去除多余的dNTP、SauA等, 置于4°C備用。

1.7 富集片段的T載體連接和轉(zhuǎn)化

使用 pMDTM20-T Vector Cloning Kit (Takara)對純化后的DNA片段進(jìn)行連接。載體連接的反應(yīng)體系為10μL: pMDTM20-T Vector 1μL; solution I 5μL; 純化DNA 4μL。16°C反應(yīng)連接過夜。將全部連接產(chǎn)物加入到100μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中, 37°C振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)1h, 菌液涂于含有IPTG、X-gal的氨芐青霉素抗性LB平板上, 37°C培養(yǎng)12h, 挑取陽性克隆在含LB液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素抗性)的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中, 37°C培養(yǎng)12h。用載體引物M13-47、RV-M及無生物素標(biāo)記的探針序列(CA)12或(GA)12對隨機挑選的白斑克隆進(jìn)行PCR菌落鑒定。擴增得到的PCR產(chǎn)物通過1.2%瓊脂糖電泳檢測后, 克隆中若存在相應(yīng)微衛(wèi)星核心, 每條產(chǎn)物帶應(yīng)為2條或2條以上。將符合上述條件的菌落送往上海英俊生物公司測序。

1.8 引物設(shè)計

測序結(jié)果用SSR Hunter軟件查找含有微衛(wèi)星核心的序列, Primer Premier 5.0 (http://www.premierbiosoft.om/)軟件進(jìn)行引物設(shè)計, 并挑選部分引物送生工生物(上海)有限公司進(jìn)行合成。

1.9 引物篩選及檢測

利用三個樣品對合成引物進(jìn)行退火溫度梯度PCR擴增, PCR反應(yīng)體系10μL包括: 模板DNA 100ng,引物F 10μmol/L, 引物R 10μmol/L, 10×Buffer 1μL,dNTP 2mmol/L, MgCl21.5mmol/L,Taq0.25 U。PCR反應(yīng)程序: 94°C, 3min, 94°C, 45s, 退火溫度45s, 72°C,45s, 35個循環(huán)數(shù), 72°C終延伸5min。通過瓊脂糖凝膠電泳, 選出能獲得清晰條帶的引物, 并確定每對引物的最適退火溫度。然后用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳, 以縊蟶30個個體進(jìn)行群體多態(tài)性分析。

用軟件MICROSATELLITE ANALYSER (MSA)(Dieringeret al, 2003)統(tǒng)計每個微衛(wèi)星位點的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測雜合度(He)及期望雜合度(Ho); 用GENEPOP v.4.1.4 (Rousset, 2008)進(jìn)行每個微衛(wèi)星位點哈迪-溫伯格平衡指數(shù)計算以及位點間連鎖不平衡分析; 用軟件CERVUS 3.0 (Marshallet al, 1998)分析各微衛(wèi)星位點的多態(tài)信息含量值(Polymorphic Information Content, PIC)。

1.10 近緣種中的通用性研究

篩選出的12對縊蟶微衛(wèi)星引物, 在長竹蟶、大竹蟶及小刀蟶各12個個體中進(jìn)行PCR擴增, 8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳, 硝酸銀染色檢測擴增結(jié)果。掃描儀記錄電泳圖譜, 根據(jù)電泳圖譜分析各個微衛(wèi)星位點在三個近緣種中的擴增情況。

2 結(jié)果

2.1 測序結(jié)果分析

32個縊蟶測序樣品中, 有21個含有微衛(wèi)星序列,共設(shè)計出17對引物。依據(jù)Weber等(1990)提出的微衛(wèi)星的劃分標(biāo)準(zhǔn), 微衛(wèi)星的類型包括完美型(perfect)、非完美型(imperfect)和復(fù)合型(compound)。完美型微衛(wèi)星是指無中斷的重復(fù)序列, 非完美型是指具有1個或者多個中斷的重復(fù)序列, 復(fù)合型則為3個以下的非重復(fù)堿基間隔不同的重復(fù)序列或者不間隔直接相連。其中完美型占52.38%, 非完美型占33.33%, 復(fù)合型占14.29%。這些微衛(wèi)星含的重復(fù)單元觀察到的有CA、GA、TG、AG、TACA、AAC、CAAG,其中CA重復(fù)次數(shù)最低為5次, 最高可達(dá)58次; TG最低為7次, 最高為37次。

2.2 多態(tài)性微衛(wèi)星位點的篩選結(jié)果

經(jīng)篩選后得到12個多態(tài)微衛(wèi)星位點(表1)。所有位點在縊蟶30個個體中進(jìn)行擴增, 經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(圖1)。結(jié)果顯示: 每個位點的觀測等位基因數(shù)為2—15個, 有效等位基因數(shù)為1.0339—8.8063個; 觀測雜合度(Ho)為0.0333—1.0000, 平均觀測雜合度為0.7525; 期望雜合度(He)為0.0333—0.9020, 平均期望雜合度為0.6866; 多態(tài)信息含量(PIC)為0.0320—0.8680。所有位點中, 有8個位點屬于高度多態(tài)位點(PIC>0.5), SC1-5和SC4-6屬于低度多態(tài)位點(PIC<0.25); 經(jīng)Bonferroni校正后, 無顯著偏離哈迪-溫伯格平衡的位點; 連鎖不平衡檢驗結(jié)果表明, 位點間不存在連鎖不平衡現(xiàn)象。

2.3 縊蟶微衛(wèi)星引物對長竹蟶、大竹蟶及小刀蟶的通用性

對所有引物在近緣種長竹蟶、大竹蟶和小刀蟶的通用性情況進(jìn)行了分析, 結(jié)果顯示: 長竹蟶中, 共有8對引物擴增出了相應(yīng)大小的產(chǎn)物, 位點SC1-7、SC1-12、SC4-4、SC4-6表現(xiàn)為單態(tài), 位點SC1-4、SC2-8、SC3-1、SC3-14表現(xiàn)出了高度多態(tài)性(PIC>0.5);大竹蟶中, 有8對引物可擴增出目的條帶, 位點SC1-12、SC3-1、SC3-14、SC4-4表現(xiàn)為單態(tài), 而位點SC3-4、SC3-7、SC4-6表現(xiàn)出了高度多態(tài)性(PIC>0.5), SC2-9為低態(tài)位點(PIC<0.25); 小刀蟶中,共有7對引物擴增出了目的條帶, 位點SC1-12、SC3-4表現(xiàn)為單態(tài), 而位點SC1-7、SC2-9、SC3-1、SC3-14表現(xiàn)出了高度多態(tài)性(PIC>0.5), SC4-6為低態(tài)位點(PIC<0.25)(表2)。

3 討論

3.1 縊蟶微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選結(jié)果分析

真核動物基因組中, 認(rèn)為二核苷酸序列(CA)n(Brenneret al, 1993)或者(GA)n(Zhanet al, 2005)的重復(fù)十分豐富, 每50—150kb就會在哺乳動物基因組中出現(xiàn)一次(Oritet al, 1997)。本研究以生物素標(biāo)記的(CA)16和(GA)16為探針, 通過磁珠富集縊蟶微衛(wèi)星序列, 并采用三引物法篩選陽性克隆, 篩選的66個白斑菌落中, 檢測出32個陽性克隆含有微衛(wèi)星片段,陽性克隆率為48.48%。這一方法可提高檢測陽性克隆中的微衛(wèi)星序列的準(zhǔn)確性, 也可專一確定核心序列(CA)n或者(GA)n, 此次也檢測出三堿基、四堿基重復(fù)元件。Winter等(1992)認(rèn)為不同物種間3種類型的微衛(wèi)星(完美型、非完美型和復(fù)合型)在真核生物基因組中存在差異, 完美型所占比例一般顯著高于非完美型。在縊蟶中, 這3種類型所占比例分別為52.38%、33.33%和14.29%, 與其他水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物的研究結(jié)果一致(趙瑩瑩等, 2006)。

圖1 SC3-14、SC4-4在30個縊蟶個體中的PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of two loci (SC3-14, SC4-4) in 30 S. constricta individuals

3.2 縊蟶微衛(wèi)星標(biāo)記在近緣種中的通用性分析

微衛(wèi)星側(cè)翼序列在屬內(nèi)種間和有較近親緣關(guān)系的種間相當(dāng)保守, 并且在有較遠(yuǎn)親緣關(guān)系的分類群中也具有一定的保守性(Ricoet al, 1996)。海薩等(2009)用10對伊犁鱸(Perca schrenkii)引物在河鱸(P.fluviatilis)中有4對適用, 而在黃金鱸(P. flavescens)中有2對。本實驗中, 12對縊蟶微衛(wèi)星引物在同屬的長竹蟶及大竹蟶中均有8對引物可擴增, 擴增效率為66.67%, 表現(xiàn)出了很高的通用性, 其中均有4對引物屬于單態(tài); 在不同亞科的小刀蟶中也有7對引物可擴增, 擴增效率為58.33%, 其中2對引物屬于單態(tài)。該結(jié)果表明這些微衛(wèi)星位點的側(cè)翼序列在長竹蟶、大竹蟶及小刀蟶中具有較高的保守性。

一般用雜合度、有效等位基因數(shù)及多態(tài)信息含量來衡量遺傳標(biāo)記的多態(tài)性高低和其應(yīng)用價值。據(jù)Botsein等(1980)提出的量度基因座位變異程度高低的多態(tài)信息含量標(biāo)準(zhǔn): 當(dāng)PIC<0.25時, 此位點表現(xiàn)為低度多態(tài)性; 當(dāng)0.250.5, 則表現(xiàn)為高度多態(tài)性。本研究結(jié)果顯示: 在長竹蟶中, 有4個高度多態(tài)位點(PIC>0.5);在大竹蟶中, 有3個高度多態(tài)位點(PIC>0.5); 在小刀蟶中, 有4個高度多態(tài)位點(PIC>0.5), 這些位點均可直接用作長竹蟶、大竹蟶及小刀蟶的遺傳多樣性分析。

3.3 縊蟶微衛(wèi)星標(biāo)記在近緣種中擴增狀況差異

微衛(wèi)星核心單元重復(fù)次數(shù)的差異及其側(cè)翼序列的突變(DNA片段插入或缺失)均可導(dǎo)致物種間等位基因長度分布范圍的差異, 這種差異可用于鑒定物種特別是近緣種(Chistiakovet al, 2006)。林能鋒等(2008)用大黃魚(Pseudosciaena crocea)微衛(wèi)星標(biāo)記對石首魚科進(jìn)行通用性分析中發(fā)現(xiàn): 黃魚亞科(Pseudosciaeninae)、叫姑魚亞科(Johniinae)及牙亞科(Otolithinae)中的近緣種在一些微衛(wèi)星位點上的等位基因長度分布范圍存在很大差異。本研究也發(fā)現(xiàn)長竹蟶、大竹蟶及小刀蟶在一些微衛(wèi)星位點上的等位基因長度分布范圍存在差異。例如, 微衛(wèi)星位點SC2-8、SC3-7在縊蟶中等位基因片段大小范圍分別為300—348bp、176—212bp, 但SC2-8在長竹蟶中為188—214bp, SC3-7在大竹蟶中為250—256bp。

另外, 等位基因數(shù)目的不同也可作為鑒定近緣種的一個指標(biāo)(Turneret al, 2004)。McQuown等(2000)將108對鏟鱘(Scaphirhynchus platorynchusRafinesque)引物在高首鱘(Acipenser transmontanus)、湖鱘(Acipenser fulvescens)及中吻鱘(Green sturgeon)中擴增, 表現(xiàn)為多態(tài)的引物分別占9.2%、22.2%和11%。本次實驗中也發(fā)現(xiàn)縊蟶中擴增效果好且等位基因較多的微衛(wèi)星引物, 在長竹蟶、大竹蟶及小刀蟶中等位基因數(shù)較少或者表現(xiàn)為單態(tài), 如位點SC4-4在縊蟶中屬于高度多態(tài)位點(PIC=0.7601), 而在長竹蟶、大竹蟶及小刀蟶中均屬單態(tài)。

微衛(wèi)星標(biāo)記在近緣種間的通用性可降低其開發(fā)成本, 提高利用率, 也有利于促進(jìn)遺傳研究較為薄弱物種的分子遺傳學(xué)研究。本文將開發(fā)出的微衛(wèi)星標(biāo)記在其近緣種中進(jìn)行通用性分析, 這些通用引物將為長竹蟶、大竹蟶及小刀蟶遺傳多樣性評價、連鎖圖譜的構(gòu)建等方面的研究提供幫助, 對尚未見微衛(wèi)星引物開發(fā)報道的長竹蟶及小刀蟶意義尤為重大。

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