林玨龍，劉 柳，沈志忠，陳春桂，金玲爽，吳淑獻(xiàn)，樸仲賢，方澤曼

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院 a．中心實(shí)驗(yàn)室;b．第一附屬醫(yī)院，廣東 汕頭515041)

食管鱗狀細(xì)胞癌是一種最常見的且預(yù)后不良的消化道惡性腫瘤。研究顯示多數(shù)人類腫瘤中，腫瘤的預(yù)后與肥大細(xì)胞的密度相關(guān)，并大量的研究已在探討這個(gè)問題。在脊椎動(dòng)物免疫細(xì)胞演變過程中，肥大細(xì)胞(mast cell，MC)是初期的免疫細(xì)胞并能演變成多功能細(xì)胞［1］。MC是IgE依賴過敏疾病的引發(fā)者，在先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)、感染及炎癥性自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要的作用［2-4］。MC不僅在過敏反應(yīng)和自身免疫中被廣泛地研究，且越來越被認(rèn)為是人類惡性腫瘤中腫瘤基質(zhì)微環(huán)境的關(guān)鍵組件［5-8］。研究表明:MC參與初期的腫瘤的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)或延緩腫瘤生長(zhǎng)取決于癌癥的類型［9-11］。MC在組織定位、應(yīng)答與其分化成不同的表型一樣，通常取決于最終到達(dá)組織所在地的化學(xué)環(huán)境［12，13］。MC表型的“異質(zhì)性”或“可塑性”由其受體和顆粒成分的差異表達(dá)體現(xiàn)出來。在嚙齒動(dòng)物，大致分為連接組織類型(也稱漿膜)和粘膜類型MC，其特異的組織化學(xué)染色差異主要表現(xiàn)為MC顆粒中蛋白聚糖核心的粘多糖成分［14］。人類MC是根據(jù)其特征酶:類胰蛋白酶和類糜蛋白酶顆粒的表達(dá)差異分型。一種類型為MCT型，只包含類胰蛋白酶，是呼吸道和腸道粘膜的主要亞型。MCTC型同時(shí)包含類胰蛋白酶和類糜蛋白酶，主要在皮膚、滑膜、結(jié)膜、淋巴結(jié)、心肌以及胃和小腸黏膜下層分布。第三個(gè)類型是表達(dá)類糜蛋白酶的MCC型，在胃粘膜組織，小腸和結(jié)腸發(fā)現(xiàn)［15，16］?；贛C的特征酶在進(jìn)化中的保守特性，哺乳動(dòng)物中MC的類胰蛋白酶和類糜蛋白酶具有一定的同源性［17，18］。小鼠的MC蛋白酶(mouse mast cell protease，mMCP)分為:肥大細(xì)胞類胰蛋白酶(mMCP-6)和類糜蛋白酶(mMCP-4)［19］。此外，因生物體內(nèi)MC的遷移或分布于不同的組織的過程十分復(fù)雜，腫瘤細(xì)胞在培養(yǎng)液環(huán)境或免疫缺陷的動(dòng)物體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)不能完全復(fù)制生物體內(nèi)環(huán)境，因此，我們利用食管癌細(xì)胞株EC109植入小鼠腹腔后，用鼠抗人類胰蛋白酶和類糜蛋白酶抗體(因MC特征酶的同源性)，檢測(cè)鼠肥大細(xì)胞在腹腔募集及其形成的腫瘤細(xì)胞周邊的微環(huán)境，了解不同MC亞型的變化對(duì)食管癌細(xì)胞周邊的微環(huán)境的影響。

1 材料

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明(KM)小鼠，雌雄不限，體重18～22 g，來源于汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SCXK(粵)2007-0017］，實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施內(nèi)進(jìn)行［SYXK(粵)2007-0097］，動(dòng)物飼養(yǎng)管理嚴(yán)格按照中華人民共和國(guó)科技部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)范。

1．2 主要試劑

小鼠抗人肥大細(xì)胞的類胰蛋白酶的單克隆抗體(IgG1)和類糜蛋白酶的單克隆抗體(IgM)由原汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院變態(tài)反應(yīng)學(xué)和炎癥學(xué)研究所提供。抗IgM抗體-PE標(biāo)記［大鼠抗小鼠IgG1-PE(藻紅素，phycoerythrin，PE，美國(guó)SBA公司)］，類胰蛋白酶抗體直接熒光PE Cy5標(biāo)記(由晶美公司技術(shù)部標(biāo)記)。同型對(duì)照:小鼠IgG1同型物PE Cy5(晶美公司)，大鼠IgG1同型物PE(美國(guó)SBA公司)。磷酸緩沖液(phosphate buffer salt，PBS，0．1 mol/mL，pH 7．2～7．4，美國(guó)Invitrogen公司)，0．2%Triton X-100，胰酶(trypsin，華美公司)。人食管癌EC109細(xì)胞株(由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)研究室惠贈(zèng))。

2 方法

2．1 動(dòng)物模型

KM小鼠進(jìn)入SPF環(huán)境飼養(yǎng)一周后，對(duì)小鼠進(jìn)行注射誘導(dǎo)。將小鼠分成5組，每組3只小鼠，分別向其中4組小鼠腹腔注射:食管癌細(xì)胞(106/mL，0．4 mL);食 管 癌 細(xì) 胞(106/mL，0．4 mL)和 胰 酶(0．005 mg/只);食管癌細(xì)胞(106/mL，0．4 mL)和As2O3(0．00594 mg/只);食 管 癌 細(xì) 胞(106/mL，0．4 mL)、As2O3(0．00594 mg/只)和胰 酶(0．005 mg/只)。第5組不作處理，作為對(duì)照。

2．2 腹腔液的細(xì)胞提取

對(duì)小鼠進(jìn)行注射誘導(dǎo)24 h后，提取小鼠的腹腔液。先將小鼠頸椎脫臼處死，向腹腔內(nèi)注射1～2 mL的生理鹽水，打開腹腔，吸取腹腔液于離心管中，生理鹽水洗滌2次，細(xì)胞以70%的乙醇固定，制成細(xì)胞懸液。

2．3 腸組織切片的制備及染色

取小鼠腸組織，經(jīng)石蠟包埋、切片、脫蠟，用甲苯胺藍(lán)染色法對(duì)組織中的肥大細(xì)胞進(jìn)行染色，95%乙醇鏡下分色，光鏡下觀察小鼠腸組織MC經(jīng)不同刺激物的作用后在腸壁移動(dòng)的狀況。

2．4 細(xì)胞的熒光標(biāo)記

MC特征性蛋白酶免疫熒光的標(biāo)記:分別取已固定的細(xì)胞懸液(鼠腹腔液的細(xì)胞，106/mL)各0．2 mL，置于不同的離心管中，0．1 moL/L PBS洗滌1-2次，0．2%Triton X-100處理10 min，PBS洗滌1-2次。類糜蛋白酶抗體(IgM，0．2μg/μL，1∶100稀釋)標(biāo)記，置于4℃冰箱中過夜。PBS洗滌1次，分別加入抗IgM抗體-PE及抗類胰蛋白酶抗體PE-Cy5(IgG，0．33μg/μL，1∶100稀釋)，室溫暗置2 h或4℃過夜，制成0．5 mL細(xì)胞懸液。流式測(cè)試的對(duì)照組:取細(xì)胞懸液0．2 mL，PBS洗滌1次。0．2%Triton X-100處理10 min，PBS洗滌1次。分別加入以上兩種抗體對(duì)應(yīng)熒光的同型物。

2．5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD．Co．USA)檢測(cè)鼠腹腔細(xì)胞的細(xì)胞懸液樣品。以亞離子激光488 nm激發(fā)，當(dāng)懸浮細(xì)胞逐個(gè)地通過檢測(cè)區(qū)時(shí)光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)熒光信號(hào)，以MC抗體對(duì)應(yīng)的同型物為對(duì)照組，根據(jù)MC特征性蛋白酶免疫熒光標(biāo)記對(duì)細(xì)胞內(nèi)類胰蛋白酶-PE Cy5及類糜蛋白酶-PE進(jìn)行雙參數(shù)分析。每組樣品進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，每次獲10 000個(gè)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2．6 統(tǒng)計(jì)分析

以SSPS 13．0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行T檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3．1 組織化學(xué)觀察MC在腸壁中的遷移

以堿性染料甲苯胺藍(lán)染色，肥大細(xì)胞內(nèi)的顆粒被染成紫紅色。光鏡下MC主要存在于小腸黏膜、黏膜下層、肌層和漿膜，在小腸絨毛上皮細(xì)胞間可見較多的MC存在［20］。本研究觀察各實(shí)驗(yàn)組，①在未受到誘導(dǎo)時(shí)，MC主要分布于小腸絨毛上皮細(xì)胞間(圖1a，箭頭所示)，平滑肌層與粘膜下層較薄，MC分布較少。②食管癌EC109細(xì)胞株及其一系列誘導(dǎo)試劑植入小鼠腹腔后，通過腸組織切片觀察在小鼠腸壁面向腹腔的平滑肌層與粘膜下層有大量MC的分布(圖1b至e，箭頭所示)。從各圖比較可見:將胰酶和/或As2O3植入腹腔均能刺激鼠腸壁的平滑肌層與粘膜下層增厚，組織細(xì)胞間隙的增大可能有利于MC在此遷移及遷入腹腔。因此，食管癌EC109細(xì)胞株及其一系列誘導(dǎo)植入后，小鼠腹腔環(huán)境的改變影響到MC遷入腹腔。

圖1 a:無癌細(xì)胞或誘導(dǎo)劑處理;b:食管癌細(xì)胞;c:食管癌細(xì)胞和胰酶;d:食管癌細(xì)胞和As2O3;e:食管癌細(xì)胞、As2 O3和胰酶。肥大細(xì)胞如箭頭所示(TB X 400)Fig．1 a:No cancer cell or inducers inducing;b:Esophageal carcinoma cells;c:Esophageal carcinoma cells and Tyrisin;d:Esophageal carcinoma cells and As2 O3;e:Esophageal carcinoma cells，As2 O3 and Tyrisin．Arrow shows the mast cell(TB X 400)

3．2 流式細(xì)胞儀對(duì)小鼠腹腔液的MC亞型確定

以激光波長(zhǎng)488 nm激發(fā)，對(duì)熒光標(biāo)記的MC特征蛋白酶抗體的細(xì)胞樣品進(jìn)行鑒定，經(jīng)類胰蛋白酶-PE Cy5及類糜蛋白酶-PE雙參數(shù)分析。在雙通道檢測(cè)點(diǎn)圖中，X軸顯示類糜蛋白酶PE-Cy5(發(fā)射熒光波長(zhǎng)667 nm)陽性;Y軸標(biāo)為類胰蛋白酶PE(發(fā)射波長(zhǎng)578 nm)陽性。見圖2，R1區(qū)域的細(xì)胞群:為類胰蛋白酶陽性的MCT型肥大細(xì)胞群;R2區(qū)域的細(xì)胞群:是類胰蛋白酶和類糜蛋白酶陽性的MCTC型肥大細(xì)胞群;R3區(qū)域的細(xì)胞群:為類糜蛋白酶陽性的MCC型肥大細(xì)胞群。因此，可將小鼠腹腔液中MC分型確定為類似人類的T型，TC型及C型三個(gè)亞型。

圖2 R1區(qū)域:類胰蛋白酶陽性的MCT型;R2區(qū)域:類胰蛋白酶和類糜蛋白酶陽性的MCTC型;R3區(qū)域:類糜蛋白酶陽性的MCC型Fig．2 R1 region:MCT subtype of tryptase positive;R2 region:MCTC subtype of tryptase and chymase positive;R3 region:MCC subtype of chymase positive

圖3 * MCT型，組3與組2，4和5比較，#P＜0．05。* MCTC型，組3與組2，4比較，#P＜0．05。＊＊MCC型，組3或5與組2，4比較，#P＜0．01。＊＊總MC，組3與組2，4，5比較，#P＜0．01;*組5與組2，4，3比較，#P＜0．05Fig．3 * MCT subtype，Group 3 compared with group 2，4 and 5，#P＜0．05．* MCTC subtype，Group 3 compared with group 2 and 4，#P＜0．05．＊＊MCC subtype，Group 3 or 5 compared with group 2 and 4，#P＜0．01．＊＊Total MC，Group 3 compared with group 2，4 and 5，#P＜0．01，* Group 5 compared with group 2，4 and 3，#P＜0．05

3．3 不同的誘導(dǎo)對(duì)肥大細(xì)胞募集的影響

不同的誘導(dǎo)影響肥大細(xì)胞三種亞型在鼠腹腔細(xì)胞中的比率，見圖3。組1腹腔未植入癌細(xì)胞，腹腔液中為鼠的腹腔細(xì)胞;組2至5植入癌細(xì)胞和/或誘導(dǎo)試劑，腹腔液主要含有鼠腹腔細(xì)胞和癌細(xì)胞。組2至5的細(xì)胞成分較一致，可進(jìn)行組間鼠腹腔微環(huán)境MC亞型變化的比較:①組3，胰酶可誘導(dǎo)MC在鼠腹腔細(xì)胞中的百分率增加;②組2與組4比較，As2O3無明顯誘導(dǎo)MC遷入腹腔;③組3與 組5，胰酶誘導(dǎo)MCC型遷入腹腔的百分率增加。不同的誘導(dǎo)促使鼠腹腔細(xì)胞中肥大細(xì)胞三種亞型占總MC的百分率變化，見圖4。①組1，在小鼠未受到誘導(dǎo)時(shí)，主要是MCT型遷入鼠腹腔;②組3和 組5，胰酶誘導(dǎo)MCC型遷入鼠腹腔比率增加，MCT型遷入比率減弱;③組2和 組4，植入EC109細(xì)胞后，MCT型遷入比率增加;④As2O3對(duì)各亞型的遷入影響不明顯。因此，小鼠腹腔植入癌細(xì)胞和/或誘導(dǎo)試劑處理后，鼠腹腔液的微環(huán)境發(fā)生變化。食管癌EC109細(xì)胞可誘導(dǎo)MCT型遷入鼠腹腔比率增加(圖4，組2和4);胰酶誘導(dǎo)腹腔中三種MC亞型遷入比率增加(圖3，組3)。

4 討論

肥大細(xì)胞在1878年由Ehrlich等第一次描述，像所有造血系細(xì)胞一樣來源于骨髓造血干細(xì)胞。其前體通過血循環(huán)到達(dá)目標(biāo)組織而分化［21，22］，成熟的肥大細(xì)胞分布于多種組織，以皮膚，呼吸道和消化道較多［23］。過去的一個(gè)多世紀(jì)，對(duì)MC功能的研究不僅確定了其在過敏和炎癥反應(yīng)中組織重塑、傷口愈合、關(guān)節(jié)炎、過敏和哮喘［24-26］方面的貢獻(xiàn)，而且證實(shí)它參與了腫瘤生長(zhǎng)的進(jìn)程。許多實(shí)體腫瘤的研究發(fā)現(xiàn):MC滲透到腫瘤和健康組織之間，在腫瘤的生長(zhǎng)中，MC對(duì)血管生成、組織重構(gòu)和免疫調(diào)制等起關(guān)鍵的角色。雖然MC和腫瘤進(jìn)展之間的相互關(guān)系及作用機(jī)制尚不清楚，但對(duì)腫瘤相關(guān)MC的研究表明這些細(xì)胞參與腫瘤進(jìn)展，通過中介產(chǎn)物促進(jìn)局部的血管生成［27-29］。近年的研究表明，MC可能作為一種癌癥治療中新的治療目標(biāo)，抑制MC的功能可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤回歸［30，31］。生物體為應(yīng)對(duì)機(jī)體內(nèi)或外的一系列刺激，體內(nèi)MC可大量地招募到不同的組織。在這些誘導(dǎo)研究中，來源于腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的鼠模型的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示了生物體內(nèi)腫瘤進(jìn)程中MC的功能，補(bǔ)充了人類患者的相關(guān)研究。本研究實(shí)驗(yàn)中，利用食管癌EC109細(xì)胞和/或誘導(dǎo)試劑植入小鼠腹腔，觀測(cè)鼠腸組織形態(tài)及腹腔液中MC的變化。從組織化學(xué)圖像觀察:食管癌EC109細(xì)胞植入鼠腹腔對(duì)腸組織形態(tài)無明顯的影響;胰酶的植入可誘導(dǎo)腸組織的平滑肌層及粘膜下層增厚及MC增多;As2O3誘導(dǎo)腸組織的平滑肌層及粘膜下層增厚。由此可能影響MC的遷移，改變小鼠腹腔內(nèi)的微環(huán)境。

Fig．4 MCC subtype，Group 3 compared with group 2 and 4，#P＜0．01;with group 1 and 5，#P＜0．05;Group 5 compared with group 1，2 and 4，#P＜0．01．MCT subtype，Group 1 compared with group 3 and 5，#P＜0．01;with group 2 and 4，#P＜0．05;Group 3 compared with group1，2，4 and 5，#P＜0．01;Group 5 compared with group1，2，3 and 4，#P＜0．01圖4 * MCC型，3組與2，4組比較，#P＜0．01，與1，5組比較，#P＜0．05;5組與1，2，4組比較，#P＜0．01。＊＊MCT型，1組與3，5組比較，#P＜0．01，與2，4組比較，#P＜0．05;3組與1，2，4，5組比較，#P＜0．01;5組與1，2，3，4組比較，#P＜0．01

因肥大細(xì)胞的特征酶在進(jìn)化中的保守特性，哺乳動(dòng)物MC的類胰蛋白酶和類糜蛋白酶具有同源性［17，18］。研究發(fā)現(xiàn)在某些方面，人MCTC對(duì)應(yīng)嚙齒動(dòng)物的漿膜肥大細(xì)胞，而MCT近似粘膜肥大細(xì)胞［14］。小鼠肥大細(xì)胞的蛋白酶mMCP-6和7(又稱類胰蛋白酶)和mMCP-4和5(即類糜蛋白酶)［19］，在腫瘤進(jìn)展中，mMCP的表達(dá)不斷發(fā)生改變［32］。由此，本研究為探討鼠腹腔植入食管癌EC109細(xì)胞和/或誘導(dǎo)試劑，癌細(xì)胞遷入后腹腔微環(huán)境的變化。使用熒光標(biāo)記的類胰蛋白酶和類糜蛋白酶抗體對(duì)鼠腹腔內(nèi)環(huán)境的MC亞型進(jìn)行鑒別，確認(rèn)了鼠腹腔內(nèi)環(huán)境應(yīng)對(duì)癌細(xì)胞和/或誘導(dǎo)發(fā)生了改變:①未誘導(dǎo)組鼠腹腔MC以T型遷入為主，與人MCT型為腸道粘膜的主要遷移亞型相似［14］;②食管癌EC109細(xì)胞誘導(dǎo)MCT型遷入鼠腹腔比率增加;③胰酶誘導(dǎo)MCC遷入鼠腹腔比率增加，MCT遷入比率減弱;④As2O3對(duì)MC各亞型遷入腹腔的影響不明顯。因此，可以通過類胰蛋白酶和類糜蛋白酶亞型的差異表達(dá)，確定不同誘導(dǎo)物對(duì)腹腔微環(huán)境變化的影響。從以往大量的研究證明了MC亞型的組織適應(yīng)性［33，34］，在實(shí)體腫瘤中MC滲透腫瘤和健康組織之間，MC的數(shù)量在惡性腫瘤顯著增加［35］;對(duì)腫瘤微環(huán)境內(nèi)的MC亞型的鑒定可用于描述炎性細(xì)胞的滲透，并在腫瘤的發(fā)展中不斷地改變［30］。由此，我們可以確認(rèn):在未受胰酶的刺激下，食管癌EC109細(xì)胞可誘導(dǎo)MCT型遷入鼠腹腔，改變癌細(xì)胞周邊的微環(huán)境。

肥大細(xì)胞對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響可以分為直接作用于腫瘤細(xì)胞，如MC介導(dǎo)細(xì)胞毒性;或間接影響，如MC調(diào)控血管生成、組織周邊環(huán)境的改造和免疫細(xì)胞的募集［29，36］。有研究顯示鼠MC類胰蛋白酶mMCP-6和7可引起中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞侵入炎癥部位［37］，嗜酸性粒細(xì)胞能啟動(dòng)毒殺腫瘤細(xì)胞［38］。這些類胰蛋白酶也可能參與細(xì)胞外基質(zhì)成分的降解，對(duì)新血管形成和腫瘤進(jìn)展至關(guān)重要［39，40］。因此，類胰蛋白酶變化可能會(huì)影響到腫瘤進(jìn)展過程。本研究結(jié)果顯示:食管癌EC109細(xì)胞誘導(dǎo)MCT(含類胰蛋白酶)型向鼠腹腔遷移的比率增加，與胰酶誘導(dǎo)MCC型向鼠腹腔遷移不同，呈現(xiàn)出肥大細(xì)胞表型在不同組織及不同誘導(dǎo)的“異質(zhì)性”，改變了癌細(xì)胞周邊的微環(huán)境，有可能誘導(dǎo)其它炎性細(xì)胞向鼠腹腔遷移--介導(dǎo)細(xì)胞毒殺作用(有待進(jìn)一步研究)，進(jìn)而影響食管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

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