史雪萍 畢慧娟 周 茜 劉 斌 王述柏

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 山東 青島 266109）

近年來(lái)我國(guó)大豆進(jìn)口總量迅速增長(zhǎng)，進(jìn)口品種主要為轉(zhuǎn)基因大豆。雖然我國(guó)還沒(méi)有批準(zhǔn)任何轉(zhuǎn)基因大豆品系進(jìn)行商業(yè)化種植，但我國(guó)已經(jīng)成為轉(zhuǎn)基因大豆的使用與消費(fèi)大國(guó)[1]。飼料安全是動(dòng)物源性食品安全的重要影響因素，隨著轉(zhuǎn)基因飼料的廣泛應(yīng)用，轉(zhuǎn)基因飼料安全成為飼料質(zhì)量安全的重要組成部分[2]。轉(zhuǎn)基因飼料外源基因在動(dòng)物體內(nèi)如何代謝是很多學(xué)者關(guān)注的問(wèn)題，對(duì)飼用轉(zhuǎn)基因飼料畜禽的產(chǎn)品質(zhì)量及外源基因轉(zhuǎn)移檢測(cè)是評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因飼料飼用安全性的檢測(cè)指標(biāo)之一。本試驗(yàn)隨機(jī)選擇7個(gè)奶牛場(chǎng)，檢測(cè)精料外源基因種類(lèi)并分析其營(yíng)養(yǎng)成分，同時(shí)檢測(cè)了牛奶中的主要營(yíng)養(yǎng)成分，旨在為轉(zhuǎn)基因飼料安全性評(píng)價(jià)體系的建立提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料 隨機(jī)選擇青島周邊7個(gè)奶牛場(chǎng)，每個(gè)牛場(chǎng)采集奶牛精料4份，牛奶樣品5份(取自5頭牛)，牛場(chǎng)分別編號(hào)為1、2、3、4、5、6、7。

1.2 主要儀器設(shè)備 臺(tái)式離心機(jī)(Eppendorf 5810R, Germany)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(master cycle realplex4, Eppendorf, 德國(guó))、微量移液器(Eppendorf Research，Eppendorf, 德國(guó))、分光光度計(jì)(BioPhotometer plus, Eppendorf, 德國(guó))、KDN-120C凱氏定氮儀(上海纖檢儀器有限公司)等。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 奶牛精料和牛奶營(yíng)養(yǎng)成分含量測(cè)定 主要檢測(cè)奶牛精料中的水分、粗蛋白、粗纖維、粗灰分、鈣和總磷含量，水分的測(cè)定參照GB6435-86，粗蛋白質(zhì)的測(cè)定參照GB6432-1994，粗脂肪的測(cè)定參照GB6433-2006，粗纖維的測(cè)定參照GB/T6434-2006，粗灰分的測(cè)定參照GB/ T6438-2007。牛奶中干物質(zhì)、粗蛋白和鈣含量，參見(jiàn)飼料分析文獻(xiàn)方法。

1.3.2 奶牛精料和牛奶中外源基因檢測(cè) 奶牛精料DNA提取方法：采用GenoDNA Plant mini Kit-Genomic DNA Isolation kit試劑盒(Ambiogen安比奧生物科技有限公司，中國(guó))提取精料DNA，采取熒光定量PCR法檢測(cè)牛奶和牛精料中外源基因。核酸質(zhì)量檢測(cè)：分別取40μl DNA溶解液，用TE緩沖液稀釋25倍后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)其在A260，A280nm波長(zhǎng)處的光吸收值。精料DNA和牛奶DNA純度以O(shè)D260/280表示，A260/A280值分別為1.92和1.80，均大于1.70(比值在1.7～2.0之間較好)，符合PCR檢測(cè)要求。外源基因檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)熒光PCR儀檢測(cè)提取核酸的外源基因。反應(yīng)條件：在96孔 PCR反應(yīng)板的反應(yīng)孔中，依次加入2.5ul 10×PCR緩沖液，2.0ul 4×dNTP (2.5 mmol/L)，0.5ul 20pmol/ul引物F，0.5ul 20pmol/ul引物R，0.2ul TaqDNA聚合酶(5U/ul)，2.0ul mgCl2(25mmol/ L)，0.5～2.0ul(10～50ng)DNA模板，0.5ul 20pmol/ul探針，加入去離子水使反應(yīng)體積達(dá)到25ul。PCR反應(yīng)的設(shè)置為95℃，10min；95℃，5s；60℃，60s進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果及分析

2.1 奶牛精料中營(yíng)養(yǎng)成分含量

7個(gè)牛場(chǎng)奶牛精料的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量見(jiàn)表1。

表1 奶牛精料的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量 (%)

由表1可知，各奶牛場(chǎng)精料的營(yíng)養(yǎng)成分含量有不同程度差異，粗蛋白質(zhì)、粗纖維含量各場(chǎng)差異不顯著(P>0.05)；水分含量范圍為7.37%～10.21%、粗灰分含量在7.28%～9.15%范圍內(nèi)、鈣含量在7.28%～9.15%范圍內(nèi)、總磷含量在0.41%～ 0.73%范圍內(nèi)，上述指標(biāo)不同牛場(chǎng)間差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。

2.2 牛奶營(yíng)養(yǎng)成分含量測(cè)定

7個(gè)牛場(chǎng)牛奶營(yíng)養(yǎng)成分含量見(jiàn)圖1。7個(gè)牛場(chǎng)牛奶中營(yíng)養(yǎng)成分含量差異不顯著(P>0.05)。

圖1 7個(gè)牛場(chǎng)牛奶營(yíng)養(yǎng)成分含量

2.3 牛精料和牛奶外源基因檢測(cè)結(jié)果

牛精料和牛奶中外源基因檢測(cè)結(jié)果顯示，1、2、3、7號(hào)牛場(chǎng)精料中含轉(zhuǎn)基因豆粕GTS40-3-2和2704品系外源基因，4、5、6號(hào)含轉(zhuǎn)基因豆粕GTS40-3-2品系外源基因。牛奶中均未檢測(cè)到相應(yīng)外源基因。

3 討論

馬永喜等研究表明，肉雞飼喂轉(zhuǎn)基因豆粕日糧，其胸肌和腿肌中檢測(cè)不到豆粕外源基因。王長(zhǎng)康等報(bào)道，飼喂轉(zhuǎn)基因豆粕日糧的蛋雞和番鴨的血液、肌肉和內(nèi)臟器官、蛋、糞便中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因成分。朱元招等研究表明，生長(zhǎng)豬飼喂轉(zhuǎn)基因豆粕日糧，其肌肉、肝臟、脾臟和胸腺中未發(fā)現(xiàn)外源基因。趙志輝 等用轉(zhuǎn)基因水稻飼喂大鼠也得出了類(lèi)似結(jié)論。Phipps等對(duì)飼喂青貯Bt玉米的牛奶進(jìn)行了檢測(cè)，所檢測(cè)奶樣中不存在轉(zhuǎn)基因DNA片段。Jennings等研究表明，飼喂轉(zhuǎn)基因豆粕豬肌肉中未發(fā)現(xiàn)外源基因存在。一般情況下從食糜中釋放出的裸露DNA在消化道內(nèi)能夠迅速降解，但有報(bào)道認(rèn)為動(dòng)物飼料中的某些DNA可以逃逸動(dòng)物體內(nèi)核酸酶的作用而發(fā)生轉(zhuǎn)移，懷孕母鼠可把外源DNA通過(guò)胎盤(pán)轉(zhuǎn)移到胎兒的體細(xì)胞中并可整合到染色體組內(nèi)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，所調(diào)查7個(gè)牛場(chǎng)精料中均含有轉(zhuǎn)基因豆粕外源基因，牛奶中均未檢測(cè)到相應(yīng)外源基因，且牛奶主要營(yíng)養(yǎng)成分沒(méi)有顯著差異。

4 小結(jié)

本試驗(yàn)研究表明，7個(gè)牛場(chǎng)精料常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分有不同程度差異，粗蛋白質(zhì)、粗纖維含量各場(chǎng)差異不顯著(P> 0.05)；水分、粗灰分、鈣、總磷含量不同牛場(chǎng)間差異顯著(P<0.05)。牛奶中的干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和鈣含量7個(gè)牛場(chǎng)之間差異不顯著(P>0.05)。4個(gè)牛場(chǎng)精料中含轉(zhuǎn)基因豆粕GTS40-3-2和2704品系外源基因，3個(gè)牛場(chǎng)精料中含轉(zhuǎn)基因豆粕GTS40-3-2品系外源基因。牛奶中均未檢測(cè)到相應(yīng)外源基因。

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