薛墨庸 程合剛 （山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 山東 泰安 271018）

馬立克病(marek′s disease，mD)是由皰疹病毒科、細(xì)胞結(jié)合性馬立克病病毒(marek′sdisease virus，mDV)引起的一種高度接觸傳染性、淋巴組織增生性腫瘤疾病。該病是第一個(gè)能用疫苗預(yù)防的腫瘤性疾病，因此受到了醫(yī)學(xué)界、獸醫(yī)學(xué)界、病毒學(xué)界的廣泛關(guān)注。目前，還沒有有效的方法來治療mD患雞，仍通過疫苗預(yù)防控制該病的發(fā)生。mD疫苗CVI988/Rispens株仍然是控制mD感染的主要疫苗之一，可有效控制預(yù)防超強(qiáng)毒力mDV(vvmDV)和超超強(qiáng)毒力mDV(vv+mDV)[1]。該疫苗對(duì)生產(chǎn)、運(yùn)輸和貯存的要求條件較高，任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題對(duì)疫苗的質(zhì)量都會(huì)造成一定的影響。其中疫苗毒力的大小和有無外源病毒的污染是衡量疫苗質(zhì)量的兩個(gè)重要指標(biāo)，疫苗毒力過有可能對(duì)雞群形成有效保護(hù)力不夠，有外源病毒如禽白血病病毒(ALV)的污染則會(huì)引入場(chǎng)外病毒，任何一個(gè)方面的不達(dá)標(biāo)則極易造成不同程度的經(jīng)濟(jì)損失。本研究檢測(cè)的外源病毒之一的ALV，屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科、а反轉(zhuǎn)錄病毒屬，引起禽類造血組織中某些細(xì)胞成分過度增生的腫瘤性疾病。ALV的感染還可引起雞群的免疫抑制和生產(chǎn)力的嚴(yán)重下降[2,3]。根據(jù)致病性和感染宿主的不同，ALV被劃分為A-J 10個(gè)亞群，外源性病毒J亞型ALV(ALV-J)是目前我國地方品種雞群中主要的流行亞型，A、B亞型也很常見。內(nèi)源性E亞群(ALV-E)為整合在雞染色體中一種前病毒DNA，在雞群中普遍存在，致瘤性很低，不能產(chǎn)生感染性病毒粒子[4]，但內(nèi)外源性ALV的重組將導(dǎo)致高致病性毒株的產(chǎn)生[5]。

食品安全是指對(duì)食品按其預(yù)期用途進(jìn)行制作、食用時(shí)不會(huì)使消費(fèi)者健康受到損害的一種保證。食品安全可追溯到食品加工業(yè)的上游，可謂抓安全性必然從源頭抓起，源頭有很多種，其中畜牧養(yǎng)殖業(yè)就是食品源頭的重要一環(huán)，例如加強(qiáng)動(dòng)物疫病的防疫，杜絕有害的飼料添加劑等，由此疫苗行業(yè)也值得更多的關(guān)注。

本研究對(duì)山東某種雞場(chǎng)送檢的某國外疫苗公司生產(chǎn)的CVI988/Rispens株mD疫苗進(jìn)行毒力測(cè)定和ALV是否污染的檢測(cè)，通過評(píng)估該類疫苗的質(zhì)量水平，探究該種雞場(chǎng)發(fā)生疑似mD的可能因素，以此為例探討了mD疫苗質(zhì)量對(duì)雞群及至對(duì)雞源食品安全生產(chǎn)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 山東某種雞場(chǎng)送檢的不同時(shí)間生產(chǎn)的兩個(gè)批次的CVI988/Rispens株mD疫苗編號(hào)為F11、F21、F22，批號(hào)依次為C006311、C006111、C006311，規(guī)格均為2000羽，運(yùn)輸過程中保存于液氮。

1.2 主要儀器和試劑 蛋白酶K購自華美生物工程公司；PCR Kit、DNA marker DL2000、rTaqE(5U/μl)、dNTPs、pmD18-T均購自TaKaRa公司；感受態(tài)細(xì)胞Trans-T1購自北京全式金公司；膠回收試劑盒購自美國OmEGA公司；DmEm培養(yǎng)基和新生牛血清購自GIBCO公司；胰酶購自德國mERCK公；SPF雞胚來自濟(jì)南賽斯家禽科技有限公司；ELISA檢測(cè)ALV p27抗原試劑盒來自IDEXX，編號(hào)為09254-AJ944(抗原)。其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 mD疫苗的毒力測(cè)定 所有疫苗融化后取100ul疫苗液，按照有限稀釋法進(jìn)行測(cè)定。每天觀察并記錄蝕斑的數(shù)量，直到蝕斑數(shù)量穩(wěn)定不變，共觀察7d。用Reedmuench方法計(jì)算疫苗的毒力。

1.4 mD疫苗中ALV p27抗原的ELISA檢測(cè) 將剩余疫苗置于-80℃冰箱和室溫反復(fù)凍融3次，以裂解mDV。從裂解后的mD疫苗原液中取150ul，2000rpm，2min離心后取上清用ELISA試劑盒檢測(cè)上清中的p27抗原，所有樣品各設(shè)3個(gè)重復(fù)(大于S/P臨界值0.2的樣品為陽性)。

1.5 mD疫苗細(xì)胞培養(yǎng)后ALV p27抗原的ELISA檢測(cè) 將處理的疫苗上清接種CEF，2h后，將細(xì)胞生長(zhǎng)液換為細(xì)胞生長(zhǎng)維持液，培養(yǎng)9d后檢測(cè)細(xì)胞上清中的ALV p27抗原。同時(shí)設(shè)置未接種樣品的CEF為對(duì)照。所有樣品各設(shè)三個(gè)重復(fù)。

1.6 mD疫苗細(xì)胞培養(yǎng)后ALV的PCR檢測(cè) 將接毒培養(yǎng)9d后的CEF收集到1.5ml的離心管中，2000rpm，2min離心，棄上清，沉淀用組織抽提液重懸，加入10ul蛋白酶K，55℃消化8h，用苯酚氯仿法提取細(xì)胞DNA,用針對(duì)ALV-J的gp85基因(924 bp)[6]引物(簡(jiǎn)寫為ALV-J-gp85)和針對(duì)A-J囊膜蛋白基因(env)(2400bp，含LTR序列)引物(簡(jiǎn)寫為ALV-ALL)做PCR檢測(cè)(見表1)。反應(yīng)體系為25ul。ALV-Jgp85反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性8min，94℃變性45sec、60℃退火45sec、72℃延伸1min(30個(gè)循環(huán))，72℃總延伸10 min，4℃保存。env基因反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min、95℃變性1min、57℃退火1min、72℃延伸2min30sec(30個(gè)循環(huán))，72℃總延伸10min，4℃保存。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，將陽性產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化的克隆產(chǎn)物驗(yàn)證成功后送上海鉑尚生物工程公司測(cè)序。用DNAstar軟件對(duì)基因進(jìn)行分析。

表1 ALV鑒別診斷引物

2 結(jié)果

2.1 mD疫苗的毒力測(cè)定結(jié)果 疫苗F11、F21、F22的毒力分別為800PFU/羽份、1300 PFU/羽份、1480PFU/羽份，均低于國家獸醫(yī)藥典規(guī)定的2000PFU/羽份，F(xiàn)11低于OIE規(guī)定的不低于1000 PFU/羽份的要求。

2.2 mD疫苗原液ALV p27抗原檢測(cè)結(jié)果 mD疫苗F11、F21、F22凍融后上清中p27抗原均為陽性，S/P值分別為0.417、0.43、0.256。

2.3 mD疫苗細(xì)胞培養(yǎng)上清中ALV p27抗原的ELISA檢測(cè)結(jié)果 F11、F21、F22細(xì)胞上清ALV p27抗原均為陽性，S/P值分別為0.657、0.733、0.774。未接種樣品的對(duì)照用CEF檢測(cè)結(jié)果為陰性。

2.4 mD疫苗細(xì)胞培養(yǎng)后ALV的PCR擴(kuò)增與測(cè)序結(jié)果 將得到的F11、F21、F22囊膜蛋白(env)基因序列(PCR方法擴(kuò)增2400bp片段，包括LTR序列)與參考株mAV-1(A)、RAV-1(A)、RSV-SchmidtRuppin(B)、RSVPr-C(C)、D10652R SV-D(D)、RAV-0(E)、SD0501(E)、HPRS-103(J)、ADOL-7501(J)序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示，3瓶疫苗中擴(kuò)增的ALV序列與參考毒株SD0501(E)、E-strain-1同源性均為98%以上(表2)，遺傳進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，疫苗中污染的ALV與ALV-E參考株SD0501的親緣關(guān)系最接近，說明分離到的毒株屬于ALV-E(附圖)。J亞型檢測(cè)結(jié)果為陰性。

表2 mD疫苗中污染的ALV株與國內(nèi)外參考株的核苷酸序列同源性比較(%)

附圖 mD疫苗樣品中污染的ALV株與不同參考株的遺傳進(jìn)化樹關(guān)系

3 討論

（1）養(yǎng)殖生產(chǎn)中經(jīng)常發(fā)生一些不明原因的免疫失敗現(xiàn)象，給企業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。除了免疫程序、母源抗體干擾、病毒持續(xù)感染等因素外，疫苗質(zhì)量下降、活疫苗遭受外源病毒污染的現(xiàn)象也屢見不鮮。由各種原因?qū)е碌膍D疫苗保護(hù)效力不足，會(huì)導(dǎo)致雞群免疫失敗，不能控制和防止雞群中mD的出現(xiàn)。Silva等利用PCR方法對(duì)商品mD疫苗進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)了ALV的污染[7]。受污染疫苗的使用會(huì)加重該疫病的傳播，放大并嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。種雞場(chǎng)出現(xiàn)mD的雞只不一定是疫苗質(zhì)量的問題，與疫苗本身的免疫保護(hù)指數(shù)，注射部位，免疫程序等有一定關(guān)系。（2）本研究結(jié)果顯示，送檢的3瓶mD疫苗的免疫劑量均低于國家獸醫(yī)藥典規(guī)定的2000PFU/羽份，但有2個(gè)批次(F21，F(xiàn)22)滿足OIE規(guī)定的不少于1000PFU/羽份的要求，疫苗質(zhì)量和生產(chǎn)狀況等還需進(jìn)一步的提高。檢疫部門也應(yīng)加大ALV的檢測(cè)力度，提高檢出率，確保在生產(chǎn)疫苗過程的細(xì)胞培養(yǎng)等階段無ALV的感染，在生產(chǎn)中完成有無ALV污染的檢測(cè)。送檢疫苗的種雞場(chǎng)發(fā)生mD，無論何種原因所致，但顯然，不合格mD疫苗的應(yīng)用是雞群發(fā)生mD腫瘤病的原因之一。而發(fā)生腫瘤的雞群往往存在抗生素藥量超標(biāo)及濫用問題，影響禽蛋肉等雞源食品質(zhì)量，危害人民群眾的生活健康。（3）近年來食品安全事件頻發(fā)，如2012發(fā)生的過量藥物喂養(yǎng)的抗生素雞，以及一直不斷發(fā)生的、禽流感和豬藍(lán)耳病等，動(dòng)物疫病一直在威脅著食品安全。隨著人民生活水平的提高，對(duì)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量要求更高，不僅要吃好，而且要吃出健康。食品安全的問題一直是國家和公民所關(guān)注的頭等大事。隨著強(qiáng)制免疫品種的擴(kuò)大，規(guī)?；B(yǎng)殖程度的提高，疫苗市場(chǎng)的規(guī)模還有很大的提升空間；隨著民眾對(duì)食品安全事件的關(guān)注度提高，國家將繼續(xù)加大對(duì)全國制售假獸藥、違法添加違禁藥物的力度。而這些都 與生產(chǎn)源頭的雞苗質(zhì)量與疫苗質(zhì)量密切相關(guān)。

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