韓太武 楊 超 趙春光 （新疆石河子市獸醫(yī)衛(wèi)生檢疫所 832000）

豬多殺性巴氏桿菌是豬呼吸道綜合征的重要原發(fā)感染菌[1]，有兩種常見(jiàn)的豬傳染病是由多殺性巴氏桿菌引起的，即豬傳染性胸膜肺炎和豬肺疫[2]。其可導(dǎo)致大批豬迅速死亡，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了非常大的經(jīng)濟(jì)損失，根據(jù)菌株間抗原成分的差異，多殺性巴氏桿菌可分為多個(gè)血清型。用被動(dòng)血凝試驗(yàn)對(duì)莢膜抗原分類，該菌可分為A、B、C、D、E、F共5個(gè)血清型;用凝集反應(yīng)對(duì)菌體抗原分類可分為12個(gè)血清型；用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)對(duì)熱浸出菌體抗原分類，本菌可分為16個(gè)血清型[3]。

該病一年四季均可發(fā)生，多在春夏呈爆發(fā)[1]。多呈散發(fā)性，但有時(shí)豬可呈地方流行性，最急性型，全身黏膜、漿膜和皮下組織有出血點(diǎn)，全身淋巴結(jié)輕度腫脹、出血、切面深紅[4]；心外膜和心包膜有出血點(diǎn)；肺急性水腫，呈紅白相間的大理石樣花紋；脾有出血，但無(wú)腫大；皮膚有紅斑。急性型，特征性的病理變化為纖維素性肺炎，肺有不同程度的肝變區(qū)，周圍常伴有水腫和氣腫，病程長(zhǎng)的肝變區(qū)內(nèi)有壞死灶，肺小葉間漿液浸潤(rùn)，切面呈大理石樣紋理；胸膜常有纖維素性附著物，嚴(yán)重的胸膜與病肺粘連；胸腔及心包積液。胸腔淋巴結(jié)腫脹，面發(fā)紅，多汁；支氣管、氣管內(nèi)含有多量泡沫狀黏液，黏膜發(fā)炎。慢性型，以慢性肺炎變化為主。肺肝變區(qū)擴(kuò)大并有黃色或灰色壞死灶，外面有結(jié)締組織包裹，內(nèi)含干酪樣物質(zhì)，有的形成空洞并與支氣管相同；心包與胸腔積液，胸腔有纖維素性沉著，肋膜肥厚，常與病肺粘連。

多殺性巴氏桿菌是規(guī)?；i場(chǎng)的一類重要病菌，嚴(yán)重影響豬群健康[5]，在防制方面，首先應(yīng)注意飼養(yǎng)管理，消除可能降低抵抗力的應(yīng)激因素，其次應(yīng)盡可能避免病原侵入，并對(duì)圈舍、飼槽、飲水器具定期進(jìn)行消毒，豬舍內(nèi)外用2%燒堿徹底消毒[6]。同時(shí)定期進(jìn)行預(yù)防接種，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)本病的特異性免疫力。發(fā)生本病時(shí)，應(yīng)將患病動(dòng)物隔離，及早確診，及時(shí)治療。

目前常用的疫苗是以滅火苗和弱毒苗為主，豬肺疫的預(yù)防可用豬肺疫口服弱毒苗，豬肺疫氫氧化鋁滅火苗、豬瘟-豬丹毒-豬肺疫三聯(lián)活疫苗，豬丹毒-豬肺疫氫氧化鋁二聯(lián)滅活苗這四種疫苗免疫期均在半年以上。多殺性巴氏桿菌分布廣泛、血清型較多，不同地區(qū)的菌種差異明顯，導(dǎo)致免疫效果不理想[3]。因而研究的疫苗還不能對(duì)多種血清型的菌株引起的疾病都起預(yù)防作用，研發(fā)針對(duì)多種血清型的疫苗是今后研究的方向[7]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 病料采自新疆石河子地區(qū)部分規(guī)?；i場(chǎng)送檢的因呼吸道引起死亡的豬或?yàn)l死豬，無(wú)菌采集其肺臟，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基和菌株 普通瓊脂培養(yǎng)基、5%兔鮮血培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、LB肉湯、生化鑒定培養(yǎng)基(均石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供)。

1.1.3 菌株及血液 兔血采自新疆石河子大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院。

1.1.4 主要儀器 CX21FS1生物顯微鏡、ZHWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器、HDX-9162mBE電熱恒溫培養(yǎng)箱、單人雙面超凈工作臺(tái)、高速冷凍離心機(jī)、隔水式恒溫培養(yǎng)箱、立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋等。

1.1.5 試驗(yàn)動(dòng)物 25日齡左右的小白鼠8只(均購(gòu)于新疆石河子動(dòng)物養(yǎng)殖中心)。

1.1.6 藥敏紙片 購(gòu)于北京華美生物技術(shù)有限公司。

1.1.7 主要培養(yǎng)基的配制 TSA和TSB培養(yǎng)基按照相應(yīng)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配制，121℃高壓滅菌20min后，室溫保存?zhèn)溆?。培養(yǎng)豬多殺性巴氏桿菌用的TSA在傾注平板前加入5%～10%犢牛血清，TSB待冷卻后加入5%～10%犢牛血清。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 豬多殺性巴氏桿菌的分離鑒定 （1）Pm的分離培養(yǎng)：將無(wú)菌采集的疑似豬多殺性巴氏桿菌感染的病變的肺臟，分別無(wú)菌接種到TSB(含5%犢牛血清)培養(yǎng)基上，置37℃增菌培養(yǎng)24h后，接種于腦心浸液鮮血瓊脂平板和麥康凱平板，37℃培養(yǎng)24h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況、菌落形態(tài)以及是否溶血，挑選單個(gè)菌落無(wú)菌接種到TSA(含5%犢牛血清)培養(yǎng)基上進(jìn)一步鑒定。（2）細(xì)菌培養(yǎng)：將純化好的細(xì)菌劃線接種TSA平板，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板，然后分別轉(zhuǎn)接葡萄糖、果糖、甘露醇、麥芽糖、乳糖、鼠李糖等碳源生化鑒定管以及吲哚VP、mR硝酸鹽還原生化鑒定管進(jìn)行生化反應(yīng)。

1.2.2 藥物敏感試驗(yàn) 將已經(jīng)純化好的Pm，挑取單個(gè)菌落接種到腦心浸液培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)37℃培養(yǎng)14h后，采用比濁管進(jìn)行比濁計(jì)數(shù)，后將已經(jīng)鑒定好的Pm菌株用滅菌的棉拭子均勻涂到到TSA(含5%血清)平板上，然后做藥敏試驗(yàn)，貼上標(biāo)準(zhǔn)藥敏試紙，經(jīng)過(guò)37℃培養(yǎng)18h后，通過(guò)測(cè)量藥物紙片在平板中產(chǎn)生的抑菌圈直徑大小來(lái)的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判斷菌株對(duì)藥物的敏感程度，每個(gè)藥敏紙片做3個(gè)，結(jié)果取其算術(shù)平均值。

1.2.3 動(dòng)物致病試驗(yàn) 將以上分離的所有細(xì)菌挑選4菌株接種到TSA（含5%血清)培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)18～24h后，將試驗(yàn)的所有公鼠均勻分為5組，每組選擇4個(gè)精神狀況相似的、個(gè)體大小相近的小鼠作為感染實(shí)驗(yàn)對(duì)象，每株注射4只，最后一組為對(duì)照組，試驗(yàn)組每只小鼠腹腔注射菌液0.3ml，對(duì)照組腹腔注射相同體積的LB肉湯，隔離例養(yǎng)并觀察小鼠的征狀，對(duì)發(fā)病或死亡的小鼠進(jìn)行剖解，采取病變部位進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定及部分生物學(xué)特性

2.1.1 細(xì)菌的培養(yǎng)特性及形態(tài) 病料接入TSA(含5%犢牛血清)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)14h后，有藍(lán)色熒光，菌落潤(rùn)滑，似水珠狀的菌株，分離菌在普通瓊脂上生長(zhǎng)緩慢，24h后才出現(xiàn)零星的菌株，在麥康凱瓊脂上不生長(zhǎng)。在腦心浸液鮮血瓊脂平板上培養(yǎng)24h后，出現(xiàn)灰白色、光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊的水滴樣小菌落，無(wú)溶血現(xiàn)象，同時(shí)挑取單個(gè)的菌落進(jìn)行涂片鏡檢，從顯微鏡可以看出兩級(jí)著色的桿菌，初步診斷多Pm菌。

2.1.2 細(xì)菌的生化特性 多殺性巴氏桿菌的判定標(biāo)準(zhǔn)為：麥康凱培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，分離菌株能發(fā)酵葡萄糖、果糖、甘露醇產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不發(fā)酵麥芽糖、乳糖、鼠李糖，吲哚、硝酸鹽還原試驗(yàn)陽(yáng)性，mR、VP試驗(yàn)陰性，本次生化結(jié)果共分離出Pm菌共12株，主要從病豬的肺臟上分離出。

表1 生化試驗(yàn)結(jié)果

2.2 細(xì)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

從藥敏結(jié)果可以看出：從新疆石河子地區(qū)部分規(guī)模化豬場(chǎng)豬豬多殺性巴氏桿菌對(duì)先鋒VI、氯霉素、環(huán)丙沙星敏感性較強(qiáng)，其耐藥率分別為83.3%、75%、75%，而該菌對(duì)其他幾種抗生素耐藥率較強(qiáng)，該菌對(duì)四環(huán)素的耐藥率為66.7%。

表2 12種抗生素對(duì)12株豬多殺性巴氏桿菌抑制作用

圖 12種抗生素對(duì)12株傳染性胸膜肺炎放線桿菌抑制作用

2.3 動(dòng)物接種試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)過(guò)對(duì)其中4株P(guān)m菌的致病力進(jìn)行動(dòng)物接種試驗(yàn)可知小鼠的死亡情況見(jiàn)表3，XNC01、XNC02、XNC03、XNC04四株菌的致死率分別為25%、100%、100%、75%，同時(shí)將死亡的小鼠肺組織接種到TSA(含5%血清)培養(yǎng)基平板上可見(jiàn)有藍(lán)色熒光，菌落潤(rùn)滑，似水珠狀的菌株，經(jīng)過(guò)涂片鏡檢可以看出兩極著色的球桿菌。

表3 Pm菌致病力試驗(yàn)

3 討論

3.1 Pm生物學(xué)特性

根據(jù)發(fā)病豬群的流行病學(xué)特征、臨床征狀、實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果，綜合鑒定此分離菌為豬多殺性巴氏桿菌。同時(shí)可以得知，該菌對(duì)人工培養(yǎng)基具有選擇性，分離菌在普通瓊脂上生長(zhǎng)緩慢，24h后才出現(xiàn)零星的菌株，在麥康凱瓊脂上不生長(zhǎng)，但是在TSA(含5%犢牛血清)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)旺盛，動(dòng)物試驗(yàn)表明，此分離菌對(duì)小白鼠有很強(qiáng)的致病性各菌株直接有差異，而且差異顯著，表明不同的菌株致病力不同，主要跟豬多殺性巴氏桿菌的血清型有很 大的關(guān)系。

3.2 Pm耐藥性分析

分離到的豬多殺性巴氏桿菌對(duì)先鋒Ⅵ，環(huán)丙沙星，氯霉素敏感性較強(qiáng)，其耐藥率分別為83.3%、75%、75%，而該菌對(duì)其他的抗生素耐藥性較強(qiáng)，其中四環(huán)素對(duì)該細(xì)菌的耐藥率達(dá)到了66.7%。由于氯霉素目前為國(guó)家禁用的藥物，所以建議臨床上選擇其他兩種藥物，對(duì)其他紅霉素等9種藥物不敏感。由此可以證明豬多殺性巴氏桿菌極易產(chǎn)生耐藥而且以多重耐藥為主，這可能與不科學(xué)的藥物使用有很大的關(guān)系，同時(shí)現(xiàn)在抗生素品種不斷更新，使分離的菌株耐藥性不斷上升，因此，對(duì)動(dòng)物的治療應(yīng)根據(jù)致病菌株的特性，藥敏試驗(yàn)，科學(xué)合理的使用抗生素。

3.3 Pm致病力分析

從病豬分離出其中4株豬多殺性巴氏桿菌XNC01、XNC02、XNC03、XNC04四株菌的致死率分別為25%、100%、100%、75%，從結(jié)果可以看出4株之間差異明顯，表明各個(gè)豬場(chǎng)豬多殺性巴氏桿菌的血清型有一定的差異，也可能與小鼠體質(zhì)有關(guān)，所以對(duì)該病的防治應(yīng)從跟治療，找到導(dǎo)致本病發(fā)生的直接根源，加強(qiáng)環(huán)境的消毒，提高豬群的抵抗力，控制好豬瘟、口蹄疫、豬繁殖與呼吸綜合征、圓環(huán)等病毒性疾病防止本病的繼發(fā)感染。

[1]魏世安.豬多殺性巴氏桿菌的診斷技術(shù)[J].獸醫(yī)導(dǎo)刊, 2011(51).

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