陳雅琳，劉李娜，唐 瑛，孫 歡，周 茜

肝癌是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，因其起病隱匿、發(fā)展迅速、易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、生存期短以及預(yù)后極差等特征，居全球癌癥發(fā)生率的第5位，死亡率的第3位［1］。目前中醫(yī)藥在防治肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、延長(zhǎng)患者生存期、提高生存質(zhì)量等方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，成為原發(fā)性肝癌綜合治療不可缺少的手段之一。半夏總生物堿(total alkaloids fromPinellia ternate，TATP)是從傳統(tǒng)中藥半夏塊莖中提取的總生物堿，是半夏的主要活性成分之一，含有L-麻黃堿、膽堿、鳥(niǎo)苷、胸苷、次黃嘌呤核苷等［2］，具有抗炎、止嘔、鎮(zhèn)咳、祛痰、降壓、降脂及提高記憶等作用，近年來(lái)報(bào)道發(fā)現(xiàn)TATP還具有抗腫瘤作用，如白血病、肝癌、乳腺癌、肺癌等［3-6］。本研究以肝癌QJY-7703細(xì)胞株作為離體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，旨在探?TATP對(duì)人肝癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品 TATP購(gòu)自武漢銀河化工有限公司，純度87%，批號(hào):20110321。用重蒸水配制儲(chǔ)備液10 mg/ml，4℃保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時(shí)，用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

1.1.2 細(xì)胞株 TATP組為QJY-7703人肝癌細(xì)胞株(6例)，本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期培養(yǎng)。對(duì)照組為正常人肝細(xì)胞株(6例)。

1.1.3 試劑與儀器 DMEM 培養(yǎng)基(高糖)、胎牛血清、青鏈霉素均購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司;胰蛋白酶購(gòu)自上海實(shí)生細(xì)胞生物技術(shù)有限公司;四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolil tetracolium，MTT)購(gòu)自Amresco公司;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;染料碘化丙啶(propidium iodide，PI)購(gòu)自Sigma公司;Gimesa染料，Sigma分裝。酶標(biāo)儀(Thermo Scientific Multiskan MK3，芬蘭)，熒光顯微鏡(Olympus BX-51，日本)，倒置顯微鏡(Olympus CKX41SF，日本)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) QJY-7703肝癌細(xì)胞株用含100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、含 10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)試驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，首先用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，再用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，每孔100 μl，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱24 h后，除對(duì)照組只加培養(yǎng)基外，其余各給藥組按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度更換含藥培養(yǎng)基，TATP的終濃度分別為 0、2.5、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 g/L。每個(gè)濃度組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h 后，每孔加入 5 g/L MTT 溶液 10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，棄孔內(nèi)上清液，每孔加入DMSO 150 μl，震蕩 10 min，使結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)吸光值(A)，按下式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率和藥物半數(shù)抑制濃度(IC50)。抑制率(%)=(1－實(shí)驗(yàn)組吸光值/對(duì)照組吸光值)×100%;IC50=lg－1［Xm －i(∑P －0.5)］，其中 Xm 為設(shè)計(jì)的最大濃度的對(duì)數(shù)值;i為各濃度倍比的對(duì)數(shù)值;∑P為各組生長(zhǎng)抑制率之和;0.5為經(jīng)驗(yàn)常數(shù)。

1.2.3 TATP影響QJY-7703細(xì)胞形態(tài)實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/ml接種于6孔板，每孔1 ml，在37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后，更換含藥培養(yǎng)基，TATP的終濃度分別為 0、10.0、20.0、40.0 mg/L，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.4 集落形成率實(shí)驗(yàn) 以每孔5×102個(gè)細(xì)胞接種于24孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后更換含藥培養(yǎng)基，TATP 的終濃度為 0、10.0、20.0、40.0 mg/L，對(duì)照組只加培養(yǎng)基，每組重復(fù)6孔，再培養(yǎng)24 h，然后將培養(yǎng)液換成含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 d后用PBS洗滌細(xì)胞，甲醇固定，Giemsa染液染色，在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)各孔集落數(shù)(只計(jì)算50個(gè)細(xì)胞以上者)，按下式計(jì)算集落形成率和相對(duì)增殖存活率:集落形成率(%)=(集落形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%;相對(duì)增殖存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組的集落形成數(shù)/陰性對(duì)照組的集落形成數(shù))×100%。

1.2.5 單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)(single cell gel electrophoresis，SCGE)檢測(cè)試驗(yàn) 采用 Singh［7］報(bào)道的方法并略加改進(jìn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以1×109/L細(xì)胞濃度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，更換含藥培養(yǎng)基，TATP 的終濃度為 10.0、20.0、40.0 mg/L，對(duì)照組只加培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h后立即收集細(xì)胞，于4℃保存。取55℃、1%正常熔點(diǎn)瓊脂糖100 μl滴于潔凈的磨砂載玻片上，立即蓋上蓋玻片，4℃冷卻10 min，取下蓋玻片，取30 μl 109/L細(xì)胞 DMEM 懸浮液與140 μl LMP瓊脂糖迅速混勻，取70 μl滴在第一層瓊脂糖上，蓋上蓋玻片放入4℃冷卻12 min，每個(gè)樣本平行制樣2個(gè)。除去蓋玻片，立即浸入預(yù)冷至4℃的裂解液中，4℃下裂解1 h;然后用冷卻至4℃的PBS洗2次，每次5 min。將載玻片置于預(yù)冷至4℃的堿性電泳液，4℃下解旋40 min。放置于水平電泳槽中，加入預(yù)冷至4℃的堿性電泳液，25 V，300 mA，室溫電泳20 min。電泳結(jié)束后，載玻片置4℃預(yù)冷的PBS中洗滌2次，每次5 min。再將玻片放入中和液中，4℃中和15 min，取出，讓溶液滴干后4℃保存過(guò)夜。每塊膠上加50 μl碘化丙啶(5 mg/L)，蓋上蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察、拍照(激發(fā)波長(zhǎng)530 nm)。隨機(jī)選擇100個(gè)細(xì)胞，用CASP彗星分析軟件逐個(gè)分析，統(tǒng)計(jì)各組細(xì)胞彗尾DNA含量、尾長(zhǎng)和尾動(dòng)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 TATP對(duì)細(xì)胞增殖作用的影響

由表1可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，各種處理濃度和處理時(shí)間均使QJY-7703細(xì)胞增殖下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。不同濃度的TATP均能有效的抑制QJY-7703細(xì)胞的增殖，并隨著TATP濃度的增加和藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用亦明顯增強(qiáng)，且在一定的濃度與時(shí)間范圍內(nèi)表現(xiàn)出時(shí)效與量效關(guān)系。經(jīng)計(jì)算TATP作用于人肝癌細(xì)胞 24、48、72 h 的 IC50分別為 49.99、19.87、8.76 mg/L。

2.2 TATP對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

在可見(jiàn)光顯微鏡下觀察，各劑量組與對(duì)照組之間的細(xì)胞形態(tài)有明顯差別。對(duì)照組細(xì)胞鋪展貼壁生長(zhǎng)，胞體飽滿，細(xì)胞間排列緊密，輪廓清晰、折射率強(qiáng)，呈不規(guī)則多邊形，增殖旺盛;經(jīng)TATP處理后細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞胞體皺縮變形，觸角伸長(zhǎng)，折射率變?nèi)?，?xì)胞表面有多個(gè)小泡突起，貼壁能力減弱，且隨著TATP濃度的增加，上述現(xiàn)象越發(fā)明顯，且有細(xì)胞脫落漂浮于培養(yǎng)基的現(xiàn)象。

2.3 TATP對(duì)細(xì)胞集落形成的影響

由表2可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，各劑量組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。不同濃度的 TATP對(duì)QJY-7703細(xì)胞集落的形成均有抑制作用，且隨著藥物濃度的增加，集落形成率和相對(duì)增殖存活率明顯下降。

表2 不同濃度TATP對(duì)QJY-7703細(xì)胞集落形成的影響(每組n=6)

2.4 TATP對(duì)細(xì)胞DNA的損傷作用

由圖 1 可見(jiàn)，10.0、20.0、40.0 mg/L TATP 對(duì)QJY-7703細(xì)胞DNA均有不同程度的損傷，且隨著加藥濃度的增加，細(xì)胞拖尾越來(lái)越嚴(yán)重。用CASP彗星分析軟件進(jìn)行分析，結(jié)果列于表3。與對(duì)照組比較，各劑量組的尾DNA含量、尾長(zhǎng)及尾動(dòng)量均有極顯著性差異(P＜0.01)，且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。

表1 不同濃度TATP對(duì)QJY-7703細(xì)胞增殖的影響(每組n=6)

注:A:對(duì)照組;B:10.0 mg/L;C:20.0 mg/L;D:40.0 mg/L

表3 不同濃度TATP作用24 h QJY-7703細(xì)胞拖尾變化(每組n=6，±s)

表3 不同濃度TATP作用24 h QJY-7703細(xì)胞拖尾變化(每組n=6，±s)

注:與對(duì)照組比較aP＜0.01;TATP:半夏生物堿

組別 濃度(mg/L)尾DNA含量(mg/L)尾長(zhǎng)(μm)尾動(dòng)量(μm)0 6.92 ± 4.85 16.06 ±9.17 0.97 ± 0.34 TATP 組 10.0 17.30 ± 5.39a29.29 ±13.09a7.87 ± 4.04a 20.0 27.68 ± 7.21a53.38 ±13.71a12.51 ± 6.55a 40.0 36.52 ± 8.67a65.33 ±17.06a21.43 ± 7.67對(duì)照組a

3 討論

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類健康，化學(xué)防癌或藥物治療在防治惡性腫瘤中占有重要地位，目前從天然植物中尋找有效活性成分以及細(xì)胞周期調(diào)控劑是研究抗腫瘤藥物的發(fā)展方向和戰(zhàn)略目標(biāo)［8-10］。近年來(lái)有關(guān)天然藥物活性成分抗腫瘤的研究與臨床應(yīng)用非?；钴S，有純提化合物、也有粗提物，如生物堿類、醌類、黃酮類、萜和揮發(fā)油類、大環(huán)類酯類、多糖類、茶多酚類及類胡蘿卜素類等，其中生物堿類化合物被認(rèn)為是主要的抗癌活性物質(zhì)。TATP是傳統(tǒng)中藥半夏的主要活性成分之一，近年來(lái)有不少關(guān)于其抗腫瘤的研究報(bào)道，如研究表明TATP對(duì)人乳腺癌、肺癌、白血病、肝癌細(xì)胞株均有抑制作用［3-6］。本研究結(jié)果表明TATP能抑制人肝癌細(xì)胞QJY-7703的增殖，降低其集落形成率，且具有損傷肝癌細(xì)胞DNA作用。

MTT比色法是指MTT在線粒體內(nèi)琥珀酸脫氫酶的作用下進(jìn)行還原反應(yīng)，其形成的藍(lán)紫色沉淀物甲瓚的量，與活細(xì)胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶的活性以及活細(xì)胞的數(shù)量成正相關(guān)，故被廣泛用來(lái)反映細(xì)胞代謝和增殖活性情況。腫瘤細(xì)胞集落形成能力是腫瘤重要的惡性特征之一，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移侵襲等能力密切相關(guān)，是體外篩選抗腫瘤藥物的重要方法。本實(shí)驗(yàn)中以不同濃度的 TATP(2.5～50.0 mg/L)處理QJY-7703細(xì)胞，MTT結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，TATP對(duì)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯抑制作用，且隨著TATP濃度的增加、加藥時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑制作用增強(qiáng)。其中TATP處理24、48、72 h后的IC50值分別為:49.99、19.87、8.76 mg/L，提示較低濃度的TATP也能達(dá)到較好的癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。集落形成率實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TATP對(duì)肝癌QJY-7703細(xì)胞集落的形成亦有明顯抑制作用，且隨著TATP劑量的增加，集落形成率和相對(duì)增殖存活率明顯下降，進(jìn)一步驗(yàn)證了TATP對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖具有抑制作用。

單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)又稱彗星試驗(yàn)，是一種高敏感度的有核細(xì)胞DNA損傷的檢測(cè)方法，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞DNA損傷與修復(fù)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、遺傳毒理、氧化應(yīng)激以及細(xì)胞凋亡等研究中［11-12］。其原理是在堿性電泳液的作用下，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解旋，如DNA未損傷，電泳時(shí)因其相對(duì)分子質(zhì)量大而繼續(xù)保留在核基質(zhì)中，熒光染色后呈圓形熒光團(tuán)無(wú)拖尾現(xiàn)象;反之，細(xì)胞DNA損傷斷片電泳時(shí)則因其相對(duì)分子質(zhì)量小而能進(jìn)入凝膠，向陽(yáng)極伸展，熒光染色后呈一個(gè)亮的頭部和尾部，即彗星影像。細(xì)胞DNA損傷越嚴(yán)重，解旋產(chǎn)生的斷片就越多越小，電泳時(shí)發(fā)生遷移的DNA量就越多，遷移距離越長(zhǎng)，故單個(gè)細(xì)胞的DNA損傷程度與細(xì)胞尾DNA含量及尾長(zhǎng)成正相關(guān)［13］。本研究結(jié)果表明，10.0、20.0、40.0 mg/L 的 TATP 處理24 h 后，細(xì)胞尾DNA含量、尾長(zhǎng)及尾動(dòng)量均有極顯著增加，并隨著TATP濃度的增加，細(xì)胞DNA損傷亦嚴(yán)重。

綜上所述，TATP對(duì)人肝癌細(xì)胞QJY-7703具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，且具有一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。其生長(zhǎng)抑制作用可能通過(guò)損傷肝癌細(xì)胞的DNA來(lái)達(dá)到阻止細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的目的，但具體分子機(jī)制及體內(nèi)作用情況尚待進(jìn)一步的研究。本研究結(jié)果有力地證明了TATP是半夏抗腫瘤作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，為深度開(kāi)發(fā)利用半夏資源奠定了重要基礎(chǔ)。

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