王建玲 陳志鑫 劉逸寒 路福平

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457）

產(chǎn)耐酸性α-淀粉酶菌株的分離、鑒定、酶學(xué)特性研究及發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

王建玲 陳志鑫 劉逸寒 路福平

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457）

從富含淀粉的土壤中篩選獲得多株產(chǎn)耐酸性α-淀粉酶的菌株，將酶活最高的一株經(jīng)16S rDNA鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），命名為Bacillus subtilis A-7，其所產(chǎn)的耐酸性α-淀粉酶最適溫度和pH分別為60℃和4.5。通過單因素篩選及正交試驗優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，得到最佳配方為可溶性淀粉 2%，蛋白胨 2%，CaCl20.07%，Na2HPO40.8%，在此條件下耐酸性α-淀粉酶活力達到221 U/mL，是未優(yōu)化條件下的2.3倍。

耐酸性α-淀粉酶 16S rDNA鑒定 枯草芽孢桿菌 最適溫度 最適pH 正交試驗

α-淀粉酶可從淀粉分子內(nèi)部切開α-1，4糖苷鍵，生成糊精、低聚糖和單糖，廣泛用于糧食加工、釀造、紡織品工業(yè)、制藥、紡織及石油開采等行業(yè)［1］，在工業(yè)生產(chǎn)中占有極其重要的地位，是目前用途較廣泛的一種酶制劑［2-4］。目前，國內(nèi)市場中常用的中溫和高溫α-淀粉酶的適用pH范圍一般為6.0-8.0，在酸性條件下其酶活性明顯降低，已不能滿足一些酸性條件下淀粉原料的深加工工藝的要求，因此，酸性α-淀粉酶的開發(fā)與生產(chǎn)勢在必行。

耐酸性α-淀粉酶是一類可以在較低pH值條件下水解淀粉的酶類，最適pH一般為4.0-5.5［5，6］。憑借其良好的耐酸性，酸性α-淀粉酶被廣泛應(yīng)用于制糖、釀造和藥物生產(chǎn)等領(lǐng)域，并能有效減少加工工藝過程中化學(xué)試劑的消耗［7］，降低副產(chǎn)物的形成，減少環(huán)境污染，具有重要的經(jīng)濟和社會效益。國外對耐酸性的α-淀粉酶的研究較早，日本學(xué)者Minoda等［8］在1963年發(fā)現(xiàn)黑曲霉可以產(chǎn)酸性α-淀粉酶以來，歐洲、美國、韓國等國家都開始對耐酸性α-淀粉酶進行了研究，其中得到的產(chǎn)耐酸性α-淀粉酶的微生物大多為芽孢桿菌和曲霉［9］。我國開展相關(guān)研究起

步較晚，劉雅琴等［10］在篩選獲得的耐酸性α-淀粉酶產(chǎn)生菌基礎(chǔ)上，對其進行發(fā)酵培養(yǎng)基與發(fā)酵條件的優(yōu)化，最終α-淀粉酶活力比初始時提高了0.65倍，達到31.4 U/mL。張麗靖等［11］篩選獲得了一株枯草芽孢桿菌B. subtulisB6，其所產(chǎn)耐酸性α-淀粉酶最適pH為5.0，最適溫度為55℃，活力達到33.4 U/mL，且該酶對Ca2+沒有依賴性，F(xiàn)e2+和Mg2+抑制作用不明顯?？梢钥闯鐾ㄟ^篩選得到耐酸性α-淀粉酶酶活均不高，在具有一定耐酸能力的情況下其酶活力還遠未達到實際生產(chǎn)的需要，需要進一步篩選產(chǎn)酶能力強的菌株并優(yōu)化其產(chǎn)酶條件。

本研究在篩選獲得耐酸性α-淀粉酶菌株的基礎(chǔ)上，利用單因素及正交法對其培養(yǎng)基組成進行優(yōu)化，旨在實現(xiàn)該菌株耐酸性α-淀粉酶的高水平生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣來源 面粉廠、酒糟、食品廠和康師傅工廠附近水樣和土樣15余份。

1.1.2 培養(yǎng)基 雙層篩選培養(yǎng)基（鑒別菌株是否產(chǎn)生耐酸性α-淀粉酶）：底層培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母浸出粉0.5%，NaCl 1%，瓊脂粉1.5%，pH自然；上層為淀粉半固體培養(yǎng)基：可溶性淀粉1%，錐蟲藍0.05%，瓊脂粉1%，pH4.5-5.0。種子培養(yǎng)基：蛋白胨1%、酵母粉0.5%、NaCl 1%，pH4.5-5.0。初始發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨1%、酵母粉0.5%、NaCl 1%，pH4.5-5.0。

1.2 方法

1.2.1 土樣采集 分別從面粉廠、酒糟、食品廠、康師傅工廠附近采集土樣和水樣，4℃下保藏備用。1.2.2 菌種初篩 分別稱取不同土樣或水樣1 g/1 mL，放入裝有50 mL無菌水的三角瓶中。取上清液1 mL于裝有9 mL無菌水的試管內(nèi)，振蕩搖晃，勻液取1 mL放入另一裝有9 mL無菌水的試管內(nèi)，重復(fù)上述步驟制成不同濃度梯度的稀釋液。取適當(dāng)稀釋度（10-4、10-6、10-7、10-8）的樣品200 μL涂布于篩選培養(yǎng)基，30℃倒置培養(yǎng)24 h，在此基礎(chǔ)上倒入雙層篩選培養(yǎng)基的上層培養(yǎng)基，30℃倒置培養(yǎng)24 h，由于錐蟲藍和淀粉膠聯(lián)可形成藍色復(fù)合物，在淀粉被淀粉酶水解后，藍色褪去，在平板上直觀地觀察到透明水解圈。挑選透明圈直徑（H）與菌落直徑（C）之比較大者，即為初篩菌株。

1.2.3 菌種復(fù)篩 將初篩菌種接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、200 r/min搖床發(fā)酵2 d，取上清測酶活，酶活最大菌株即為篩選獲得的耐酸性α-淀粉酶生產(chǎn)菌。

1.2.4 酶活測定 由于篩選得到的菌株所產(chǎn)的α-淀粉酶為耐酸性α-淀粉酶，故對國標GB/T 24401—2009的測量過程稍作修改。參照GB/T 24401—2009，酶活力單位定義：1 g固體酶粉（或1 mL液體酶）在60℃、pH4.5 條件下，1 h 液化1 mg 可溶性淀粉成為糊精所需要的酶量，即為1個酶活力單位，以U/mL（或U/g）表示。

X＝c×n

式中，X：樣品的酶活力（U/mL，或U/g）；c：測試酶樣的濃度（U/mL，或U/g）；n：樣品的稀釋倍數(shù)。所得結(jié)果表示至整數(shù)。

1.2.5 菌種鑒定 常規(guī)鑒定參照文獻［12］中的方法進行?；蚪MDNA的提取參照文獻［13］所述的方法進行，采用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTAG-3'）和1541R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACT-3'）進行16S rDNA的擴增。擴增體系（50 μL）：ddH2O 37 μL，10×buffer 5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L each）5 μL，上、下游引物（20 μmol/L）各0.75 μL，DNA模板1 μL，TaqDNA 聚合酶0.5 μL；PCR反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 90 s，25個循環(huán)；72℃ 10 min。

1.2.6 酶學(xué)性質(zhì)初步研究 配置不同pH（3.0-7.0）檸檬酸-磷酸緩沖液，測定酶的最適反應(yīng)pH；并在最適pH下測定不同溫度（30-70℃）對酶活的影響，確定酶的最適溫度。

1.2.7 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 通過單因素試驗分別考察氮源、碳源、金屬離子對菌體產(chǎn)酶的影響，在此基礎(chǔ)上對碳源、氮源、CaCl2和NaH2PO44因素作3水平的正交試驗，得到最優(yōu)培養(yǎng)基的配比。

2 結(jié)果

2.1 菌株的篩選

從土樣和水樣中篩選得到130株產(chǎn)淀粉酶菌株，其中12株酶活較高（圖1，表1），菌株A-7酶活最

高，達95 U/mL，將該菌株作為下一步試驗菌株。BLASTH比對，得知該菌株與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的16S rDNA 的序列同源性最高，達到99%以上，因此將該菌株歸屬為枯草芽孢桿菌，命名為Bacillus subtilisA-7。

圖1 產(chǎn)淀粉酶菌株的水解透明圈

表1 初篩菌株酶活比較

2.2 菌種鑒定

篩選出來的A-7菌株培養(yǎng)后觀察菌落形態(tài)，發(fā)現(xiàn)菌落較大較圓，菌落邊緣不規(guī)則，菌落表面較粗糙，不透明，菌落顏色為黃褐色。菌種經(jīng)革蘭氏染色呈紫色，為陽性，菌體呈桿狀（圖2）。

圖2 菌種革蘭氏染色結(jié)果

2.3 16S rDNA鑒定

16S rDNA 序列是細菌鑒定的重要指標，通過PCR擴增該菌株的16S rDNA 序列，大小約為1 500 bp（圖3），將該片段的測序結(jié)果在NCBI上進行

圖3 PCR結(jié)果

2.4 酶學(xué)性質(zhì)的初步研究

2.4.1 最適pH 在不同pH值條件下，60℃測定A-7的活力，將酶活最高者定為100%，結(jié)果（圖4）顯示，菌株A-7所產(chǎn)的淀粉酶的活力受酸堿度影響較大，在偏酸的條件下酶活力較高。其最適pH為4.5，在pH4-6之間，相對酶活在60%以上。

圖4 pH對α-淀粉酶活性的影響

2.4.2 最適溫度 在不同溫度條件下，pH4.5測定α-淀粉酶的活力。結(jié)果（圖5）顯示，A-7反應(yīng)的最適溫度均為60℃，在40-80℃之間相對酶活均較高，40-60℃范圍內(nèi)酶活力隨溫度上升而升高，60℃時酶活力達到最高，隨后酶活力隨溫度上升而下降。

2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.5.1 碳源對產(chǎn)酶的影響 考慮到發(fā)酵成本問題，本實驗室選用了幾種常見碳源進行優(yōu)化，氮源為1%蛋白胨，由表2可知，可溶性淀粉是產(chǎn)酶的最佳碳源，淀粉酶的酶活達到142 U/mL，可溶性淀粉的最佳濃

度試驗表明，隨著可溶性淀粉濃度的增加，酶活不斷提高，當(dāng)濃度達到2%時，酶活最高，達到161 U/mL，當(dāng)繼續(xù)增大可溶性淀粉濃度時，淀粉酶活力反而隨之下降，所以選取2%可溶性淀粉為最佳碳源。

圖5 溫度對α-淀粉酶活性的影響

表2 碳源對酶活的影響

2.5.2 氮源對產(chǎn)酶的影響 為考察有機氮源和無機氮源對菌株產(chǎn)酶的影響，分別選取蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、玉米漿、尿素、NH4Cl 作為氮源，碳源為2%的可溶性淀粉，其他條件相同，結(jié)果（表3）顯示，有機氮源比無機氮源更有利于菌株產(chǎn)酶，其中蛋白胨為最優(yōu)氮源，淀粉酶的酶活可達161 U/mL，蛋白胨的最佳濃度試驗表明，當(dāng)濃度為2%時，酶活最高，可達177 U/mL，蛋白胨濃度降低或升高，均抑制菌株的產(chǎn)酶。因此選取2%蛋白胨為最佳氮源。

表3 氮源對酶活的影響

2.5.3 金屬Ca2+離子濃度對產(chǎn)酶的影響 據(jù)Machius等［14］的研究可知，添加Ca2+離子可促進芽孢桿菌產(chǎn)α-淀粉酶，其原因為芽孢桿菌所產(chǎn)的α-淀粉酶一般是一種金屬酶，Ca2+離子可保持α-淀粉酶空間結(jié)構(gòu)和活力的穩(wěn)定性，故選用不同濃度的Ca2+離子進行發(fā)酵，試驗結(jié)果（表4）顯示，當(dāng)Ca2+濃度達到0.06%時，淀粉酶的酶活最高，達到190 U/mL。

表4 Ca2+含量對酶活的影響

2.5.4 磷酸鹽對產(chǎn)酶的影響 磷酸鹽可維持發(fā)酵培養(yǎng)基pH的穩(wěn)定，并且磷元素是細胞合成核酸的一種必須元素，可促進細胞的生長。結(jié)果（表5）顯示，當(dāng)磷酸鹽達到0.8%時，酶活最高，達到225 U/mL，降低或升高磷酸鹽濃度，酶活均受到抑制。

表5 Na2HPO4含量對酶活的影響

2.5.5 正交試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，對可溶性淀粉、蛋白胨、CaCl2和Na2HPO44因素作3水平正交試驗，結(jié)果如表6所示。方差分析表明，可溶性淀粉濃度對菌株產(chǎn)酶的影響較顯著。結(jié)合極差分析結(jié)果，4個因素的影響程度依次為：可溶性淀粉＞蛋白胨＞磷酸鹽＞CaCl2，由正交分析可得出培養(yǎng)基配方最優(yōu)水平組合為：可溶性淀粉 2%，蛋白胨2%，CaCl20.07%，Na2HPO40.8%。從理論上優(yōu)化得到的培養(yǎng)基是否是最佳產(chǎn)酶條件，還需要進一步通過搖瓶發(fā)酵試驗進行驗證。驗證結(jié)果表明，重組酶活力達到221 U/mL，此活力大于正交試驗中出現(xiàn)的所有結(jié)果，驗證了選取該結(jié)果的正確性。因此，確定最適發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：可溶性淀粉 2%，蛋白胨2%，CaCl20.07%，Na2HPO40.8%。

3 討論

世界工業(yè)酶市場市值約為3億美元，其中α-淀粉酶是一種重要的酶制劑，占據(jù)酶制劑市場的25%左右［15］。在淀粉深加工產(chǎn)業(yè)中，酸性α-淀粉酶的需求量越來越大［16］?，F(xiàn)階段所篩選得到產(chǎn)耐酸性α-淀粉酶的菌株主要為芽孢桿菌和曲霉，最適pH4.5-5.5之間，最適溫度在30-60℃之間［17］，但初始酶活力均不高，無法滿足實際生產(chǎn)的需要。所以仍需在自然界中進一步篩選可耐酸、具有一定耐熱能力和高

活力的α-淀粉酶生產(chǎn)菌株。近幾年，盡管我國酶制劑工業(yè)得到了長足的發(fā)展，但與國際先進水平仍存在不小的差距，其中最主要的差距就是我國α-淀粉酶的品種和生產(chǎn)菌株比較單一，為了縮小這種差距，利用基因工程手段改造菌株或篩選菌株的方法來擴充α-淀粉酶的品種和生產(chǎn)菌株就顯得尤為重要。

表6 培養(yǎng)基配方正交試驗結(jié)果及其極差分析

4 結(jié)論

從采集到的土樣中篩選出一株產(chǎn)耐酸性α-淀粉酶的菌株，經(jīng)過16S rDNA鑒定為枯草芽孢桿菌。對該菌株所產(chǎn)的α-淀粉酶耐酸性的研究表明，該酶在pH4.5、中等溫度下能表現(xiàn)出比較高的酶活，并在此基礎(chǔ)上，分別對碳源、氮源、金屬離子以及磷酸鹽對菌株產(chǎn)耐酸性α-淀粉酶的影響，通過正交試驗進一步分析確定了最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基為可溶性淀粉2%，蛋白胨 2%，CaCl20.07%，Na2HPO40.8%。最高酶活達到221 U/mL，是初始酶活的2.3倍。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Screening，Identification and Characterization of an Acid α-amylase Producing Strain and Optimization of Its Fermentable Condition

Wang Jianling Chen Zhixin Liu Yihan Lu Fuping
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science& Technology，Tianjin 300457）

Multiple new acid α-amylase producing strains were isolated from soil which is rich in starch. A strain which has the highest enzyme activity was identified as Bacillus subtilis A-7 through analysis of 16S rDNA gene. The optimum temperature and pH was 60℃ and 4.5. The single factor experiments and orthogonal experiments were adopted to optimize the liquid fermentation medium. The composition of the best medium was 2% soluble starch, 2% peptone, 0.07% CaCl2, 0.8% Na2HPO4. Under this optimal condition, the activity of acid α-amylase was 221 U/mL and 2.3-fold more than that of no optimization.

Acid α-amylase 16S rDNA Bacillus subtilis Optimum temperature Optimum pH Orthogonal experiment

2013-10-23

天津科技大學(xué)實驗室開放基金項目（1204A211），國家自然科學(xué)基金資助項目（31101219），國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（“863”計劃）項目（2013AA102106-07）

王建玲，女，研究員，研究方向：酶與應(yīng)用微生物；E-mail：wjl01@tust.edu.cn

路福平，男，教授，研究方向：酶與應(yīng)用微生物；E-mail：lfp@tust.edu.cn