蘇二正吳向萍高蓓魏東芝

（1. 南京林業(yè)大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院 酶與發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室，南京 210037；2. 華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室魯華生物技術(shù)研究所，上海 200237）

短小芽孢桿菌脂肪酶基因的克隆、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究

蘇二正1吳向萍2高蓓2魏東芝2

（1. 南京林業(yè)大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院 酶與發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室，南京 210037；2. 華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室魯華生物技術(shù)研究所，上海 200237）

從土壤樣品中通過篩菌過程獲得一株產(chǎn)脂肪酶的菌株，經(jīng)16S rRNA 鑒定屬于短小芽孢桿菌，根據(jù)已報(bào)道的來源于芽孢桿菌的脂肪酶基因設(shè)計(jì)引物，克隆獲得其全長基因，命名為lipS6，大小為648 bp，編碼215個(gè)氨基酸，經(jīng)比對(duì)其與已報(bào)道的脂肪酶基因B26 有96%的同源性。構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-lipS6，在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了可溶表達(dá)，酶活達(dá)到2 000 U/mL。重組脂肪酶LipS6的最適溫度為30℃，最適pH為9，低濃度的Ca2+與Mn2+對(duì)其有很明顯的激活作用，疏水性有機(jī)溶劑對(duì)其毒害作用小，在正己烷體系中可以催化酯化反應(yīng)，最適酯化底物酸為十四酸，底物醇為正丁醇。

脂肪酶 短小芽孢桿菌 基因克隆 重組表達(dá) 性質(zhì)

脂肪酶（EC 3.1.1.3，Lipase），全稱為三?；视王ニ饷福╰riacylglycerol acylhydrolase），是指能夠分解或者合成甘油三酸酯酯鍵的酶［1］。脂肪酶是科學(xué)研究中被關(guān)注的最早的酶類之一，已經(jīng)有100多年的研究歷史［2］。脂肪酶廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物中，在動(dòng)物體中脂肪酶控制著消化、吸收及脂肪重建等過程，在植物體中脂肪酶存在于能量儲(chǔ)藏組織中，而微生物如細(xì)菌、酵母、霉菌、放線菌等則可產(chǎn)生大量的不同性能的脂肪酶。

微生物脂肪酶具有耐有機(jī)溶劑、異構(gòu)體選擇性、底物專一性、高度位置選擇性和高催化活性的特點(diǎn)［3］，可用于催化酯化、酯交換、醇解、胺解、酰

化等反應(yīng)。因此，對(duì)微生物來源脂肪酶的研究得到了各國科研人員的廣泛關(guān)注，極大地帶動(dòng)了脂肪酶在諸多工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用。

近年來，微生物脂肪酶的分子生物學(xué)研究進(jìn)展非常迅速，由NCBI 檢索結(jié)果知，自1985年Gotz等［4］報(bào)道的來源于Staphylococcus的脂肪酶基因至今，已有20 000多條脂肪酶基因被克隆并提交GenBank等公共數(shù)據(jù)庫。來源不同的脂肪酶基因大小不同，同源程度不同，性質(zhì)相差很大。芽孢桿菌來源的脂肪酶目前已有很多被克隆［5-7］，通過分析芽孢桿菌屬脂肪酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，其氨基酸序列中存在“Ala-X1-Ser-X2-Gly”保守五肽，而其它屬脂肪酶含有的是“Gly-X1-Ser-X2-Gly”的保守五肽，第一個(gè)Gly被突變?yōu)锳la后，酶的活性并沒有被改變，這一現(xiàn)象說明第一個(gè)氨基酸起到增加保守五肽的柔韌性以及減少其空間位阻的作用，以便于底物與酶的催化中心之間能夠更好地結(jié)合而進(jìn)行催化作用［8］。此外這類脂肪酶活性中心沒有“l(fā)id”覆蓋，底物可以很容易地進(jìn)出活性中心，因而酶的催化活性較高。

本研究從土壤樣品中篩選獲得一株產(chǎn)脂肪酶的短小芽孢桿菌菌株，并對(duì)其脂肪酶基因進(jìn)行克隆，在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)重組表達(dá)，研究其基本酶學(xué)性質(zhì)和催化性能，旨在為其進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 取自上海奉賢農(nóng)村菜地、生活用水廢水溝，上海徐匯飯店廢水、垃圾桶和火鍋店，云南昆明高新區(qū)食品廠、飲料廠，內(nèi)蒙古烏蘭察布大草原蒙古包生活廢渣、煤堆、馬糞堆。

1.1.2 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基（W/W，%）：酪蛋白胨0.6，大豆蛋白胨0.2，NaCl 0.2，pH自然。

平板篩選培養(yǎng)基（W/W，%）：胰蛋白胨1.0，酵母提取物0.5，NaCl 1.0，瓊脂1.2，橄欖油乳化液1.0，0.01 g/mL的羅丹明B 0.1。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基（W/W，%）：胰蛋白胨1.0，酵母提取物0.5，NaCl 1.0，橄欖油乳化液1.0。LB培養(yǎng)基（W/W，%）：胰蛋白胨1.0，酵母提取物0.5，NaCl 1.0，pH7.0。

1.1.3 菌株、質(zhì)粒、酶及其它試劑藥品E. coliDH5α感受態(tài)菌株、E. coliBL21（DE3）感受態(tài)菌株購于天根生物有限公司。pMD19-T載體購于TaKaRa公司，pET32a質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。Premix Taq DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶購自Fermentas 公司。蛋白胨、酵母提取物購自O(shè)xoid 公司。其它試劑藥品均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選 稱取各土壤樣品1.0 g加入含30 mL富集培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中于37℃、180 r/min，振蕩培養(yǎng)1 d，將培養(yǎng)物搖勻，取1.0 mL轉(zhuǎn)接到新的含有30 mL富集培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，同樣條件富集3次。吸取0.1 mL富集后的培養(yǎng)液稀釋后涂布于平板篩選培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)1-2 d后挑取有較大紅色水解圈的菌落劃線接種于平板篩選培養(yǎng)基上，初步篩選獲得產(chǎn)脂肪酶的單菌落。

將獲得的單菌落接種于搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d，吸取發(fā)酵液1.0 mL，點(diǎn)入打孔的含羅丹明B的平板篩選培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)，觀察孔周圍的顏色變化，取變色圈較大的對(duì)應(yīng)菌株作菌種鑒定。

1.2.2 菌種鑒定 取2.0 mL過夜培養(yǎng)的菌液，4℃離心收集菌體，按文獻(xiàn)［9］方法提取菌種基因組DNA作為模板，按照文獻(xiàn)［10］進(jìn)行16S rDNA 序列PCR擴(kuò)增，上游引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGG-3'；下游引物：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；于72℃延伸8 min，將產(chǎn)物放置4℃保存。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳驗(yàn)證，并將含有目的片段的樣品送生工測序，將測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對(duì)。

1.2.3 脂肪酶酶活測定 以乳化橄欖油作為底物采用堿滴定法測定脂肪酶酶活［11］。0.5 mL待測酶液加入2.0 mL 100 mmol/L pH7.0的磷酸鈉緩沖液中，于水浴搖床上37℃保溫5 min，加入于37℃預(yù)保溫的乳化橄欖油底物2.5 mL于180 r/min下反應(yīng)10 min，用10 mL無水乙醇終止反應(yīng)。對(duì)照中先加10 mL無水乙醇滅活再加底物。在上述條件下，每分鐘水解橄欖油產(chǎn)生1.0 μmol 游離脂肪酸所需的脂肪酶量定義為一個(gè)脂肪酶活力單位（U）。

1.2.4 短小芽孢桿菌脂肪酶基因的克隆 根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的來源于芽孢桿菌屬的脂肪酶基因的保守序列

設(shè)計(jì)引物：正向引物S6-F1 5'-AATCCGGTTTGTGATGGTCCA-3'和反向引物S6-R1 5'-GTTGACGACGATGAGATCCGCT-3'，以短小芽孢桿菌菌株S6的基因組DNA作模板，PCR擴(kuò)增保守序列片段，具體過程：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min，于4℃下保存。將PCR產(chǎn)物電泳驗(yàn)證并割膠回收，將回收的片段與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化入E. coliDH5α的感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆進(jìn)行測序。將測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，設(shè)計(jì)全長基因序列引物：正向引物S6-F2 5'-CGGGATCCATGAAAGTGATTCGATTTA-3'（下劃線為BamH I酶切位點(diǎn)），反向引物S6-R2 5'-CCGGAAGCTTAATTCGTATTCTGTCC-3'（下劃線為Hind III酶切位點(diǎn)），PCR擴(kuò)增出lipS6全長基因序列，條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，61℃退火45 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min，于4℃下保存。將PCR產(chǎn)物電泳驗(yàn)證并割膠回收，獲得的DNA片段與pMD19-T載體連接，將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E. coliDH5α的感受態(tài)細(xì)胞中，PCR驗(yàn)證后挑取陽性克隆菌試管培養(yǎng)，將培養(yǎng)的菌液送至華大基因測序，提取陽性克隆菌液質(zhì)粒，命名為T-S6。

1.2.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá) 用BamH I和Hind III對(duì)T-S6和pET32a進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段和空載體雙酶切后的片段，將回收的目的片段和載體片段用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化入E. coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性菌落提取質(zhì)粒，將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為pET32a-lipS6。

將重組質(zhì)粒pET32a-lipS6轉(zhuǎn)化E. coliBL21中，挑取單菌落接種于含有100 mg/L Ampicilin的50 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD≈0.8，加入IPTG至終濃度0.5 mmol/L，20℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)10 h。低溫離心收集菌體，將菌體重新懸浮在含15 mL預(yù)冷的20 mmol/L pH8.0的磷酸鹽緩沖液中，超聲破碎，工作條件為功率200 W，工作4 s，間歇5 s，超聲破碎20 min，將破碎完的菌體裂解液在4℃下10 000 r/min離心10 min，沉淀用相同體積的緩沖液溶解，取全菌體、上清、沉淀進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。

1.2.6 短小芽孢桿菌脂肪酶基本酶學(xué)性質(zhì)研究 最適溫度測定：按照1.2.3方法，分別于20、25、30、 35、40和50℃下測定脂肪酶的活力。

熱穩(wěn)定性測定：將脂肪酶液分別放置在30、40、50、60℃的水浴中保溫，分別在15、30、45及60 min時(shí)取樣測定酶活。

最適pH測定：配制pH為6.0、7.0、8.0的磷酸鹽緩沖液，pH為8.0、9.0、10.0、11.0的硼砂緩沖液，然后按1.2.3方法在不同pH測定脂肪酶活力。

pH穩(wěn)定性測定：將脂肪酶液分別加入不同pH值的緩沖液中在4℃中放置3 h，然后將酶液的pH調(diào)回到測酶活pH測定酶活。

金屬離子、表面活性劑及抑制劑的影響：向測酶活體系中添加各種金屬離子使其終濃度分別為1和8 mmol/L，添加各種表面活性劑使其終濃度為1 mmol/L，添加EDTA使其終濃度為5 mmol/L，再按照1.2.3的方法測定酶活。

有機(jī)溶劑的影響：將75 μL酶液與25 μL有機(jī)溶劑混合，用封口膜密封，在30℃搖床中放置3 h后測定殘余酶活。所用有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、苯、DMSO、正己烷及氯仿。

1.2.7 短小芽孢桿菌脂肪酶酯化性質(zhì)研究 酯化反應(yīng)最適脂肪酸的測定：用脂肪酶凍干粉催化丁酸、己酸、辛酸、癸酸、十二酸、十四酸、十六酸與正己醇反應(yīng)，反應(yīng)體系為：1 mmol酸+1 mmol正己醇+5 mL正己烷+酶的凍干粉，在30℃搖床中150 r/min下反應(yīng)8 h，取1 mL反應(yīng)液8 000 r/min離心1 min，取上清進(jìn)行氣相檢測。

酯化反應(yīng)最適底物醇的測定：將丁醇、己醇、辛醇、癸醇、十二醇與十四酸反應(yīng)，反應(yīng)體系為：1 mmol醇+1 mmol十四酸+5 mL正己烷+酶的凍干粉，在30℃搖床中150 r/min反應(yīng)8 h，取1 mL反應(yīng)液8 000 r/min離心1 min，取上清進(jìn)行氣相檢測。

氣相條件：HP-5毛細(xì)管柱（30.0 m×320 μm× 0.25 μm），氣化室溫度 260℃，檢測室溫度280℃，柱溫120℃保持1 min，然后以10℃/min升到280℃，最后再保持2 min，載氣為氮?dú)?，流速?.2 mL/min，進(jìn)樣量為1 μL。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選和菌種鑒定

經(jīng)過開始的富集培養(yǎng)，平板的初篩以及復(fù)篩，

最后搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶驗(yàn)證等過程，最終從內(nèi)蒙古烏蘭察布大草原蒙古包生活廢渣中篩選獲得一株產(chǎn)較高脂肪酶活性的菌株，命名為S6。對(duì)S6菌株進(jìn)行16S rDNA 鑒定，所得16S rDNA基因序列長度大約為1 500 bp，將此序列在GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果與短小芽孢桿菌的同源性為99%，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖1所示。

圖1 S6菌16S rDNA克隆文庫細(xì)菌進(jìn)化樹

2.2 脂肪酶基因的克隆與序列分析

根據(jù)保守序列引物進(jìn)行PCR，獲得一段保守序列，測序比對(duì)發(fā)現(xiàn)，獲得的基因片段與已報(bào)道的也是來源于短小芽孢桿菌的脂肪酶基因lipB26有98%的同源性。根據(jù)lipB26基因序列設(shè)計(jì)全長基因引物lipS6-F2和lipS6-R2，梯度PCR后，將得到的基因片段連入T載體進(jìn)行測序。由測序結(jié)果可知，所得到的基因大小為648 bp，編碼215個(gè)氨基酸，在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，獲得的基因序列與已報(bào)道的lipB26的全長基因有96%的同源性，23個(gè)堿基不同，氨基酸序列有3個(gè)不同，在第30個(gè)左右由Ile→Met，Ala→Lys，Glu→Ala。將此脂肪酶基因命名為lipS6，提交GenBank，序列號(hào)為JN594059。

2.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白表達(dá)

將構(gòu)建成功的重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-lipS6轉(zhuǎn)入E. coliBL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳分析結(jié)果（圖2）顯示，在35 kD左右有一個(gè)明顯的條帶，由于pET32a質(zhì)粒帶有Trx-tag融合標(biāo)簽，所以目的蛋白比實(shí)際要大。pET32a-lipS6在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)（圖2，Lane 2）。收集菌體超聲破碎，離心取上清進(jìn)行酶活測定，活力達(dá)到2 000 U/mL。

圖2 重組質(zhì)粒pET32a-lipS6在大腸桿菌中的表達(dá)

2.4 脂肪酶LipS6的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 最適溫度和熱穩(wěn)定性 圖3-A顯示，脂肪酶LipS6的最適溫度為30℃，酶活以最適溫度為中心，呈上升或下降趨勢，在20℃時(shí)有70%以上的相對(duì)酶活，在60℃時(shí)有60%左右的相對(duì)酶活。熱穩(wěn)定性測定表明該脂肪酶穩(wěn)定性較差，60℃處理1 h后，殘余酶活小于5%，該酶在30℃的穩(wěn)定性較好（圖3-B）。

2.4.2 最適pH和pH穩(wěn)定性 圖4-A顯示，脂肪酶LipS6的最適pH為9，為一堿性脂肪酶，在pH8-10之間均具有較高的相對(duì)酶活，pH為6或11時(shí)，酶活急劇下降。pH穩(wěn)定性試驗(yàn)表明該酶的pH穩(wěn)定性范圍較寬，在pH7-11的緩沖液中存放3 h殘余酶活仍保持80%以上，說明耐堿性能優(yōu)越（圖4-B）。

2.4.3 金屬離子、表面活性等的影響 不同化學(xué)試劑對(duì)脂肪酶LipS6酶活的影響見表1。低濃度（1 mmol/L）的Ca2+與Mn2+對(duì)脂肪酶LipS6有很明顯的激活作用，酶活提高1.5倍左右。高濃度（8 mmol/L）Mn2對(duì)LipS6有輕微的抑制作用。Fe2+、Ag+、Cu2+及Mg2+對(duì)LipS6有較明顯的抑制作用。SDS、Tween80及Triton X-100三種表面活性劑對(duì)LipS6也有較明顯的抑制作用。EDTA對(duì)LipS6有輕微的抑制作用。

2.4.4 有機(jī)溶劑的影響 表2顯示，有機(jī)溶劑的影響隨著其極性的變化而變化。高極性的有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、乙腈、丙酮等對(duì)LipS6的毒害作用大，殘余酶活低。疏水性有機(jī)溶劑如正己烷對(duì)LipS6的酶活幾乎沒有影響。中等極性的有機(jī)溶劑如氯仿、苯的影響介于高極性有機(jī)溶劑與疏水有機(jī)溶劑之間。DMSO作為一個(gè)高極性的有機(jī)溶劑其對(duì)LipS6的毒害作用并不像丙酮、乙腈那樣明顯。

2.5 非水相中脂肪酶LipS6催化酯化反應(yīng)特性

由于脂肪酶LipS6在正己烷溶劑中的穩(wěn)定性很高，因此進(jìn)一步考察了LipS6在正己烷中催化合

成反應(yīng)的能力和特性。結(jié)果（圖5）顯示，脂肪酶LipS6催化酯化反應(yīng)的最適底物脂肪酸為十四酸，從正丁酸到十四酸隨著脂肪酸碳鏈增長，脂肪酸的酯化轉(zhuǎn)化率增加，從十四酸到十八酸隨著脂肪酸碳鏈的增長，脂肪酸的酯化轉(zhuǎn)化率下降（圖5-A）。脂肪酶LipS6催化酯化反應(yīng)對(duì)短鏈脂肪醇轉(zhuǎn)化率高，隨著碳鏈的增長，酯化轉(zhuǎn)化率下降（圖5-B）。

圖 3 溫度對(duì)脂肪酶LipS6活力的影響最適溫度（A）及熱穩(wěn)定性（B）

圖4 pH對(duì)脂肪酶LipS6活力的影響最適pH（A）及pH穩(wěn)定性（B）

3 討論

脂肪酶生物催化的優(yōu)點(diǎn)有很多，能夠在常溫常壓的條件下進(jìn)行反應(yīng)因而所需的條件比較溫和，催化的效率高、特異性強(qiáng)并且不易產(chǎn)生副產(chǎn)物，用化學(xué)催化方法易產(chǎn)生有害物質(zhì)的缺點(diǎn)能夠避免，此外，反應(yīng)不需要輔酶，反應(yīng)體系簡單，便于產(chǎn)物的提取以及精制，可以提高產(chǎn)品的質(zhì)量，使脂肪酶在工業(yè)上的應(yīng)用越來越廣泛［12］。

芽孢桿菌脂肪酶屬于subfamillyI.4，該類脂

肪酶與subfamillyI.5或其它亞族脂肪酶的同源性很低（＜15%），具有分子量小、堿性偏好性、催化功能多等特點(diǎn)。目前為止，研究較多的芽孢桿菌脂肪酶主要來源于Bacillus subtilis、Bacillus stearothermophilus、Bacillus thermocatenulatus、Bacillus thermoleovorans［13］。國內(nèi)外對(duì)短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）脂肪酶的研究報(bào)道較少。國外Kim等［13］最早于2002年篩選獲得了一株短小芽孢桿菌B26，該菌產(chǎn)Ca2+不依賴脂肪酶。國內(nèi)黃瑛等［14］最早于2008年對(duì)短小芽孢桿菌脂肪酶進(jìn)行了克隆和易錯(cuò)PCR改造。2009年以來，Kumar等［15］、Ismael等［16］、Zhang等［17］、張搏等［18］及李俊峰等［19］進(jìn)行了產(chǎn)脂肪酶短小芽孢桿菌菌株的篩選、原始菌株發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化、克隆表達(dá)及部分酶學(xué)性質(zhì)的研究，使短小芽孢桿菌脂肪酶日益受到關(guān)注。由前人的研究結(jié)果來看，同樣來源于短小芽孢桿菌的脂肪酶的分子性質(zhì)、酶學(xué)性質(zhì)也存在著差異。因此，本研究同樣進(jìn)行了產(chǎn)酶菌株的篩選、克隆表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究，進(jìn)一步豐富短小芽孢桿菌源脂肪酶的種類，奠定其應(yīng)用基礎(chǔ)。

表1 不同的化學(xué)試劑對(duì)脂肪酶活力的影響

表2 有機(jī)溶劑對(duì)脂肪酶活力的影響

圖5 脂肪酶LipS6在正己烷中催化酯化反應(yīng)的底物特異性最適酸（A）及最適醇（B）

本研究從環(huán)境樣本中篩選獲得一株產(chǎn)脂肪酶短小芽孢桿菌S6，通過芽孢桿菌脂肪酶保守序列設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增獲得S6菌脂肪酶的保守序列片段，進(jìn)一步根據(jù)B26菌脂肪酶序列設(shè)計(jì)引物PCR獲得S6菌脂肪酶全長序列，基因大小為648 bp，編碼215個(gè)氨基酸，該脂肪酶基因與Zhang等［17］報(bào)道的短小芽孢桿菌B106脂肪酶基因大小一致，基因序列同源性為88%，氨基酸序列同源性為95%，比張搏等［18］報(bào)道的同樣來源于短小芽孢桿菌HZbp脂肪酶基因大。由于短小芽孢桿菌脂肪酶分子量小，在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)易形成包涵體，為了減少包涵體量，提高可溶性表達(dá)，本研究選用質(zhì)粒pET32a進(jìn)行異源表達(dá)，該質(zhì)粒具有Trx融合蛋白，能夠幫助表達(dá)蛋白形成正確的二硫鍵，可增加蛋白的溶解性及活性。S6菌脂肪酶表達(dá)后上清中有明顯的條帶，可溶表達(dá)量達(dá)到50%，酶活達(dá)到2 000 U/mL，通過表達(dá)條件的優(yōu)化可以進(jìn)一步提高重組菌培養(yǎng)的細(xì)胞密度和可溶表達(dá)量，這一部分工作將另文發(fā)表。

脂肪酶LipS6為典型的堿性脂肪酶，其最適pH為9，比B106、B26脂肪酶的最適pH（8.0、8.5）高［13，17］，與H2菌脂肪酶最適pH一樣［19］，其在pH7-11范圍內(nèi)穩(wěn)定性好，穩(wěn)定pH范圍寬。由于制漿造紙、皮革、紡織業(yè)的工藝特點(diǎn)，需要使用堿性脂肪酶來改善傳統(tǒng)工藝，LipS6的堿性最適條件及優(yōu)越的堿性耐受性，顯示出其在這些領(lǐng)域的應(yīng)用前景。前人對(duì)于短小芽孢桿菌脂肪酶的性質(zhì)研究都沒有涉及其在非水相中催化合成反應(yīng)的能力，本研究發(fā)現(xiàn)脂肪酶LipS6在非水相生物催化常用有機(jī)溶劑正己

烷中穩(wěn)定性高，因此考察了其在正己烷中催化酯化的能力，發(fā)現(xiàn)其可以高效地催化脂肪酸與脂肪醇的酯化反應(yīng)，這個(gè)性能的揭示預(yù)示著LipS6也可以應(yīng)用于催化制備生物柴油。DMSO是非水相生物催化中常用的助溶劑，LipS6在25%的DMSO中仍能保持較高的酶活，這個(gè)性能將有助于開發(fā)LipS6在非水相中催化那些難溶底物的生物轉(zhuǎn)化。

4 結(jié)論

篩選獲得一株產(chǎn)脂肪酶的短小芽孢桿菌S6，通過PCR擴(kuò)增獲得其全長基因大小為648 bp，利用pET32a質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)了其在大腸桿菌中的可溶表達(dá)，通過Ni-NTA親和純化后純酶的最適溫度為30℃，最適pH為9，耐堿性能優(yōu)越，低濃度Ca2+、Mn2+對(duì)其有激活作用，在正己烷中穩(wěn)定性高，于非水相體系中可以催化酯化反應(yīng)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Gene Cloning，Expression and Characterization of the Lipase from Bacillus pumilus S6

Su Erzheng1Wu Xiangping2Gao Bei2Wei Dongzhi2
（1. Enzyme & Fermentation Technology Laboratory，College of Light Industry Science and Engineering，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037；2. State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，New World Institute of Biotechnology，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237）

A lipase-producing strain was screened from the soil samples. It was identified as Bacillus pumilus by the 16S rRNA method. According to the reported lipase genes from Bacillus, the primers were derived and the full-length gene was cloned, named “l(fā)ipS6”, which had the size of 648 bp, encoding 215 amino acids. “l(fā)ipS6” held 96% homology with the reported lipase gene B26. Recombinant plasmid pET32alipS6 was construced and expressed in E. coli. “l(fā)ipS6”could be expressed in soluble form, and the lipase activity reached 2 000 U/L. The optimum temperature of recombinant lipase LipS6 was 30℃, and the optimum pH was 9. Low concentrations of Ca2+and Mn2+could activate the activity of lipase LipS6. The harmful effect of hydrophobic organic solvent on the lipase LipS6 was little. LipS6 could catalyze the esterification reaction in the n-hexane system, with the myristic acid and n-butanol as the optimum substrates. These properties show that LipS6 can be used in the fields of pulp and paper, leather, textiles and bioenergy.

Lipase Bacillus pumilus Gene cloning Recombinant expression Characterization

2013-12-23

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（“863”計(jì)劃）（2012AA020403），國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31201296/C200101），生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題，南京林業(yè)大學(xué)引進(jìn)高層次人才科研基金項(xiàng)目，江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目

蘇二正，男，博士，副教授，研究方向：分子酶學(xué)與生物催化；E-mail：ezhsu@njfu.edu.cn

蘇二正；魏東芝，男，博士，教授，研究方向：微生物工程、生物催化工程；E-mail：dzhwei@ecust.edu.cn