羅璇許麗媛王永澤趙錦芳趙筱王金華

（1. 華中農(nóng)業(yè)大學楚天學院 食品與生物科技學院，武漢 430205；2. 湖北工業(yè)大學發(fā) 酵工程教育部重點實驗室 工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430068）

乳酸片球菌L-乳酸脫氫酶基因的克隆及在重組大腸桿菌JH12中的過量表達

羅璇1許麗媛2王永澤2趙錦芳2趙筱2王金華2

（1. 華中農(nóng)業(yè)大學楚天學院 食品與生物科技學院，武漢 430205；2. 湖北工業(yè)大學發(fā) 酵工程教育部重點實驗室 工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430068）

以工程菌Escherichia coli SZ85基因組為模板，克隆得到乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）的L-乳酸脫氫酶基因（ldhL），連接到pUcm-T載體后，雙酶切然后將其連接到表達載體pET-28a上，重組質(zhì)粒經(jīng)篩選后轉(zhuǎn)入染色體上含有l(wèi)dhL基因（來源P. acidilactici）的工程菌Escherichia coli JH12。 P. acidilactici 的ldhL基因過量表達體系E. coli JH12（pET-28a-ldhL）能利用濃度7%的木糖為碳源進行厭氧發(fā)酵，過量表達ldhL使L-乳酸產(chǎn)量提高了10 g/L，達64.86 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率高達96%。

重組大腸桿菌 過量表達 L-乳酸

作為三大重要的有機酸之一，乳酸廣泛應用于食品，醫(yī)藥，環(huán)保和農(nóng)業(yè)等諸多領域［1，2］。隨著環(huán)保意識的增強，乳酸更多的用于生產(chǎn)生物可降解的聚合材料聚乳酸（PLA）。聚乳酸不但可以加工成塑料，減弱對石化資源的依賴性，還可以制作多種醫(yī)用材料，具有生物可吸收性，發(fā)展前景良好的特點［3］。2010年“乳酸生產(chǎn)菌種分子改造與高效發(fā)酵技術”再次被列入“十二五”重大攻關項目［4］，預計2016年聚乳酸市場價值將達38.31億美元。目前我國L-乳酸工業(yè)生產(chǎn)中的菌株在產(chǎn)量和質(zhì)量方面都遠落后于國外，高純度的L-乳酸主要依靠進口。因此提高我國乳酸工業(yè)中菌株生產(chǎn)L-乳酸的發(fā)酵濃度，發(fā)酵純度，底物轉(zhuǎn)化率以及擴大生產(chǎn)強度具有重大意義。

目前L-乳酸的菌株生產(chǎn)主要集中于乳酸菌（Lactobacillus manihotivora-ns）［5］、腸球菌（Rhizopus

oryzae）［6］、稻根霉菌（Enterococcus casseliflivus）［7］和重組大腸桿菌（E. coli）［4，8-11］。其中大腸桿菌由于遺傳背景清楚、便于操作調(diào)控、營養(yǎng)要求簡單以及生長迅速，理論轉(zhuǎn)化率高等特點，近年來被廣泛開發(fā)研究以獲得優(yōu)秀L-乳酸的生產(chǎn)菌株。野生大腸桿菌不具備L-乳酸的生長能力，只具有D-乳酸脫氫酶基因（ldhA），在無氧條件下能利用碳源生產(chǎn)D-乳酸。為了使大腸桿菌獲得高純度L-乳酸的生產(chǎn)能力，研究者將大腸桿菌中l(wèi)dhA基因失活后，再引入外源L-乳酸脫氫酶基因（ldhL），在大腸桿菌體內(nèi)獲得表達［3，12，13］。本研究中選用的外源L-乳酸脫氫酶基因——乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici） 的L-乳酸脫氫酶（L-lactate dehydrogenase，LLDH）基因，不僅具有和L-乳酸高產(chǎn)菌株Lactobacillus plantarum的L-乳酸脫氫酶基因呈現(xiàn)出極大的核酸序列相似性，且和大腸桿菌具有同樣的植物性啟動子序列，利于基因的表達。此外，Pediococcus acidilactici的L-乳酸脫氫酶是非別構(gòu)酶，減少了果糖1-6二磷酸（FBP）對大腸桿菌產(chǎn)乳酸的影響，利于泛克隆到大腸桿菌用于L-乳酸的生產(chǎn)［14］。本研究以Escherichia coliSZ85［3］基因組DNA為模板，PCR克隆得到L-乳酸脫氫酶（L-lactate dehydrogenase，LLDH）基因，并將其連接到表達質(zhì)粒pET-28a中，獲得重組質(zhì)粒pET-28a-ldhL，將pET-28a-ldhL轉(zhuǎn)化到利用木糖生產(chǎn)L-乳酸菌株JH12［15，16］中實現(xiàn)ldhL的表達。進一步用7 L的發(fā)酵罐初步檢測L-乳酸脫氫酶在E.coliJH12中過量表達對L-乳酸產(chǎn)量的影響，旨在為高效利用木糖JH12的工業(yè)化應用的改造提供理論依據(jù)和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 L-乳酸脫氫酶（ldhL）來源菌株E.coliSZ85，Escherichia coliTG1為實驗室保存；E. coliJH12為本實驗室構(gòu)建及保存，質(zhì)粒pET-28a（含有卡那霉素抗性基因）由實驗室保藏，pMD-18T載體購于寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 LB液體培養(yǎng)基（蛋白胨10g/L 、酵母粉5 g/L 、氯化鈉5 g/L）；LB固體培養(yǎng)基在LB液體培養(yǎng)基中加20 g/L的瓊脂；培養(yǎng)E.coliTG1的培養(yǎng)基中加20 g/L的葡萄糖作為碳源；培養(yǎng)JH12的LB培養(yǎng)基中加20 g/L木糖作為碳源。培養(yǎng)條件：37℃，150 r/min。

1.1.3 酶和化學試劑BamH I、XhoI內(nèi)切酶試劑，pMD-18-T載體、T4 DNA Ligase購于寶生物工程（大連）有限公司；DNA marker、 PCRMM購于Fermentas公司，TBE緩沖液購于上海雙螺旋生物科技有限公司；基因組提取試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購于TIAN GEN BIOTECH公司；CaCl2·2H20濃度為1 mmol/L；EB工作濃度為0.5 mg/L；氨芐青霉素、卡那霉素在培養(yǎng)基中的工作濃度都為50mg/L。

1.2 方法

1.2.1ldhL的擴增 將重組大腸桿菌SZ85基因組利用基因組提取試劑盒提取后，以乳酸片球菌L-乳酸脫氫酶基因（ldhL）序列兩端設計引物，ldhL基因的擴增引物如下：ldhL基因上游引物：5'-GCGGATCCATGTCTAATATTCAAAATCA -3'，ldhL基因下游引物：5'-CGCTCGAGTTATTTGTCTTGTTTTTCAG-3'，帶有下劃線的堿基分別為BamHⅠ和XhoⅠ 酶切位點。以提取的基因組為模板，對乳酸脫氫酶進行擴增：95℃預變性3 min；94℃ 30 s，45℃ 30 s，72℃ 3 min 30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測。

將回收的PCR產(chǎn)物亞克隆到pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TG1中，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，將得到的轉(zhuǎn)化子進行質(zhì)粒抽提，通過酶切和PCR驗證。

1.2.2 重組質(zhì)粒pET-28a-ldhL的構(gòu)建及鑒定 將連接有l(wèi)dhL基因載體pMD18-T用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后，回收ldhL（～1 kb）基因的片段，再將此片段連接到經(jīng)同樣酶酶切的pET-28a上，得到乳酸脫氫酶表達載體pET-28a-ldhL。以CaCl2法將pET-28a-ldhL轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JH12中，所得轉(zhuǎn)化子經(jīng)卡那霉素抗性篩選后，抽提陽性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，酶切驗證目的基因是否已導入重組質(zhì)粒pET-ldhL中。1.2.3ldhL基因在重組大腸桿菌中的誘導表達 取陽性轉(zhuǎn)化子，并以轉(zhuǎn)入pET-28a的JH12為對照，接種于5 mL含卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，以1%的接種量接種于新鮮的培養(yǎng)基中，

培養(yǎng)到OD600為0.4-0.6后加入1 mmol/L IPTG，30℃誘導8 h。取1 mL菌液處理后進行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.4 7 L發(fā)酵罐發(fā)酵檢測L-乳酸濃度 從平板上分離出成功表達的重組大腸桿菌JH12（pET-ldhL）單菌落，以重組大腸桿菌JH12為對照。接入LB培養(yǎng)基（含有100 μg/mL卡那霉素）重組大腸桿菌JH12（pET-ldhL）中，200 r/min，37℃條件下?lián)u瓶培養(yǎng)。當種子菌體濃度（OD600）達到1.0-1.5左右，以5%的接種量接于裝有4 L LB培養(yǎng)基的7 L發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐條件：初始糖含量7%，轉(zhuǎn)速200 r/min，37℃，以6 mol/L KOH作為中和劑，采用流加方式控制pH穩(wěn)定在7左右。定時取樣，檢測OD600值、木糖濃度、L-乳酸產(chǎn)量及其他雜酸濃度。

1.2.5 發(fā)酵產(chǎn)物分析 OD值采用紫外分光光度計測量，波長選定600 nm；所取發(fā)酵液樣品在10 000 r/min條件下離心10 min，去除細胞殘留，收集上清液用于測定殘?zhí)羌捌渌x產(chǎn)物的含量。殘?zhí)呛亢陀袡C酸檢測采用高效液相色譜法（HPLC）檢測。檢測條件：Agilent 1200 series 反相高效液相色譜儀，色譜柱為Bio-Rad HPX 87H；流動相：4 mmol/L H2SO4（pH2.5）；流速：0.5 mL/min；進樣量：10 μL；示差檢測器檢測；柱溫：35℃［17］。乳酸的光學純度檢測條件為Agilent 1200 series 反相高效液相色譜儀，手性柱為EC 250/4 NUCLEOSIL Chiral-1，紫外檢測器，波長250 nm；柱溫 35℃，流動相為0.2 mmol/L CuSO4，流速為0.5 mL/ min［18］。

2 結(jié)果

2.1ldhL基因的擴增

以大腸桿菌SZ85基因組DNA為模板，擴增P. acidilactici的乳酸脫氫酶（ldhL）基因。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1，擴增片段大小與預期大小相符。

將PCR產(chǎn)物純化后與pMD-18T簡易載體連接，經(jīng)抗性平板篩選、雙酶切、PCR擴增及序列分析鑒定重組質(zhì)粒，提取質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后，回收ldhL片段。

2.2 pET-28a-ldhL重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將pET-28a的BamH I、XhoI雙酶切體系酶切，與回收的ldhL片段在T4連接酶催化下連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-ldhL，提取的質(zhì)粒經(jīng)BamH I、XhoI雙酶切、電泳驗證，結(jié)果見圖2，表明已成功構(gòu)建重組質(zhì)粒，命名為pET-ldhL。

圖1 ldhL基因PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖譜

圖2 重組質(zhì)粒PET-ldhL 酶切驗證電泳分析

2.3 SDS-PAGE分析

將含有重組質(zhì)粒的E.coliJH12在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當菌體進入對數(shù)生長期時加入IPTG誘導，收集菌體處理后進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖3所示，表明重組菌株JH12與對照菌株相比，有明顯的特征蛋白帶出現(xiàn)，分子量大小約為39 kD，除去融合表達前端的整合標簽，與文獻報道［9］的分子量一致，表明外源的ldhL在重組大腸桿菌中得到有效的表達。

2.4 7 L發(fā)酵罐發(fā)酵試驗

為了初步了解重組菌株E. coliJH12（pET-ldhL）相對于出發(fā)菌株在發(fā)酵罐中產(chǎn)L-乳酸的水平，采用帶有pH自動調(diào)節(jié)器的7 L發(fā)酵罐為反應器進行厭氧發(fā)酵培養(yǎng)。采用LB液體培養(yǎng)基，裝液量為4 L，初始糖濃度為7%，控制發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速為200 r/min，溫度為37℃，發(fā)酵過程中用6 mol/L KOH作為中和劑。

圖 3 重組質(zhì)粒pET-ldhL表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

由圖4-A可以看出，重組菌株E. coliJH12（pET-ldhL）和出發(fā)菌株E. coliJH12都在36 h達到生物量的最大值，重組菌株E. coliJH12（pET-ldhL）的生長比出發(fā)菌株E. coliJH12在前24 h相對較快，在之后的12 hE. coliJH12（pET-ldhL）生長緩慢，到36 h菌體總量小于出菌株。

由圖4-B可以看出，兩株菌在整個發(fā)酵過程中呈現(xiàn)出相同的產(chǎn)酸趨勢，在24-30 h 之間乳酸生成速率最大，約在84 h乳酸生成速率趨于平穩(wěn)，此時乳酸積累量達到最大。重組菌株E. coliJH12（pET-ldhL）產(chǎn)酸能力相對于出發(fā)菌株E. coliJH12略有增強，經(jīng)96 h發(fā)酵，E. coliJH12（pET-ldhL）最終乳酸的積累量為64.86 g/L，相對于E. coliJH12（55.09 g/L）增長了約10 g/L。

在整個產(chǎn)酸過程中，乳酸生成的最大速率相差不大，都在30 h左右乳酸生成速率最大，約為1.60 g/（L·h）；到96 h發(fā)酵結(jié)束，E. coliJH12（pET-ldhL）木糖的殘余量為4.81 g/L，明顯低于對照菌株13.73 g/L，兩株菌的糖酸轉(zhuǎn)化率都在96%左右。整個產(chǎn)酸過程中，兩菌株木糖的最大消耗率約為1.0 g/（L·h）。菌株E. coliJH12（pET-ldhL）保持了E. coliJH12 雜酸少的優(yōu)點，整個過程中，乙酸產(chǎn)量始終保持在1 g/L以下。

2.5 L-乳酸的光學純度

取發(fā)酵培養(yǎng)得到的菌液經(jīng)過過濾處理后，在高效液相色譜上利用手心柱分離，在液相圖譜上只有L-乳酸的峰出現(xiàn)。而在L-乳酸標準品中添加0.5%的D-乳酸標準品，可以觀察到D-乳酸的峰。結(jié)果表明菌液中的L-乳酸純度高于99.5%。

圖4 70 g/L木糖發(fā)酵結(jié)果

3 討論

國內(nèi)外關于利用代謝工程的方法生產(chǎn)L-乳酸報道并不少見。1999年Chang等［18］將干酪乳桿菌L. casei的ldhL基因轉(zhuǎn)入磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶（pta）和D-乳酸脫氫酶（ldhA）雙缺失大腸桿菌中，獲得的菌株RR1經(jīng)過兩階段發(fā)酵得到45 g/L L-乳酸；2001年Dien［12］將Streptococcus bovis的ldhL引入大腸桿菌中，在10%的木糖發(fā)酵中得到63 g/ L 的L-乳酸；為了提高乳酸脫氫酶的活力進而提高乳酸的產(chǎn)量，2010年Mulok等［11］將Enterococcus facelisKK1的ldhL基因轉(zhuǎn)入自身染色體被插入P. acidilactici的ldhL基因的E.coliSZ85（△focA-pfLB、△frdBC、△adhE、△ackA、△ldhA∷ldhL）中，實現(xiàn)L-乳酸脫氫酶的過量表達，最終在1 g果糖中實現(xiàn)0.62 g/L 的乳酸生產(chǎn)。研究都能從一定層面上反映了在大腸桿菌中引入L-乳酸脫氫酶的可能性，并能得到較高濃度的L-乳酸，同時國內(nèi)的相關技術也可以實現(xiàn)L-乳酸脫氫

酶在大腸桿菌中表達。L-乳酸脫氫酶的過量表達促使菌株在代謝過程中的碳源流入生成乳酸的途徑，從而使糖酵解過程中的流入三羧酸循環(huán)的碳源減少，最終導致細胞生物量的減少［19］。2011年袁劍等［4］將干酪乳桿菌 G-02（Lactobacillus caseiG-02）ldhL基因的轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）中實現(xiàn)L-乳酸脫氫酶的表達，并對L-乳酸脫氫酶的活性進行了研究。2008年，楊登峰等［10］將鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）的ldhL基因轉(zhuǎn)入ldhA和pflB雙缺失的大腸桿菌FMJ144，發(fā)酵得到3.5 g/L L-乳酸；于振海等［20］于2010年將丙酮丁醇梭菌ldhL基因轉(zhuǎn)入到大腸桿菌FMJ144中，發(fā)酵得到2.4 g/L L-乳酸。和國外相比，同內(nèi)的乳酸積累量都處于較低水平，出發(fā)菌株高純度生產(chǎn)乳酸不夠成熟，雜質(zhì)多不易分離。

研究以實驗室自主構(gòu)建的工程菌JH12為出發(fā)菌株，該菌株通過Red重組系統(tǒng)敲除了乳酸生產(chǎn)的競爭性途徑中的5個基因（ΔfrdBC，ΔldhA，ΔackA，ΔfocA-pfLB，ΔadhE）并通過染色體插入法插入了P. acidilactici的ldhL基因，利用木糖高效率生產(chǎn)L-乳酸，發(fā)酵液中L-乳酸的含量占有機酸的總量的95%以上，為了進一步提高L-乳酸的產(chǎn)量，試圖通過過量表達催化丙酮酸生成L-乳酸的關鍵酶基因——L-乳酸脫氫酶基因來實現(xiàn)。

4 結(jié)論

研究以E.coliSZ85基因組為模板克隆乳酸片球菌的L-乳酸脫氫酶基因，通過一系列純化過程后與表達載體pET-28a連接，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28aldhL；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到工程菌E.coliJH12中，實現(xiàn)P. acidilactici的L-乳酸脫氫酶基因的過量表達。在7%木糖濃度的7 L發(fā)酵罐中厭氧發(fā)酵培養(yǎng)比較過量表達前后乳酸積累量，結(jié)果表明過量表達P. acidilactici的L-乳酸脫氫酶菌株相對于出發(fā)菌株L-乳酸產(chǎn)量有明顯提高。

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（責任編輯 李楠）

Cloning L-lactate Dehydrogenase Gene from Pediococcus acidilactici and Overexpression of It in Recombination Strain E.coli JH12

Luo Xuan1Xu Liyuan2Wang Yongze2Zhao Jinfang2Zhao xiao2Wang Jinhua2
（1. College of Food Science and Biotechnology，Huazhong Agricultural University Chutian College，Wuhan 430205；2. Key Laboratory of Fermentation Engineering（Ministry of Education），Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation，College of Bioengineering，Hubei University of Ttechnology，Wuhan 430068）

Gene ldhL encoding L-lactate dehydrogenase was amplified by PCR technique using genome DNA of Escherichia coli SZ85 as temple. The PCR product was cloned into pUcm-T vector and double digested with restriction endonucleases, and then the DNA fragment of ldhL was inserted into pET-28a（+）. The recombinants expression plasmid pET-ldhL was transformed into high purity L-lactate production of E. coli. JH12, which inserted ldhL of P. acidilactici into chromosome. The overexpression system of ldhL of Pediococcus acidilactici gene E. coli JH12（pET-28a-ldhL）could product L-lactic acid using 7% xylose. Overexpression of ldhL led to L-lactic acid yield of 64.86 g/L, which is 10 g/L higher than control without Overexpression of ldhL. Meanwhile, high sugar-acid ratio of 96% was achieved by overexpression of ldhL.

Recombination E.coli Overexpression L-lactic acid

2013-11-12

國家自然科學基金項目（31070094），湖北省教育廳科研項目（Q20121405），湖北省科技廳科研項目（2011CDA008，2011CDB076）

羅璇，女，講師，研究方向：發(fā)酵工程與生物技術；E-mail：luoxuan20051982@126.com

王金華，男，教授，研究方向：發(fā)酵工程；E-mail：wangjinhua@mail.hbut.edu.cn