張國(guó)華馬小軍，2呂偉麗

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730037；2. 甘肅省草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070）

合作豬SLA-DQA基因外顯子2多態(tài)性分析

張國(guó)華1馬小軍1，2呂偉麗1

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730037；2. 甘肅省草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070）

旨在研究合作豬DQA基因外顯子2多態(tài)性，確定其等位基因數(shù)、核苷酸多態(tài)位點(diǎn)、氨基酸多態(tài)位點(diǎn)及各個(gè)等位基因之間的遺傳關(guān)系，分析其進(jìn)化意義。選用PCR-SSCP對(duì)439只合作豬SLA-DQA基因外顯子2的多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)；測(cè)序群體內(nèi)因變異而產(chǎn)生的各等位基因序列，并分析序列數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，在合作豬SLA-DQA外顯子2中發(fā)現(xiàn)了7個(gè)新等位基因，共18個(gè)核苷酸多態(tài)位點(diǎn)，10個(gè)氨基酸多態(tài)位點(diǎn)。合作豬SLA-DQA外顯子2具有較豐富的多態(tài)性，群體內(nèi)可能蘊(yùn)藏著更加豐富的遺傳資源；合作豬SLA-DQA外顯子2基因最初可能由一個(gè)等位基因突變分化成一大類基因；合作豬SLA-DQA外顯子2序列與各個(gè)豬種的SLA-DQA外顯子2序列具有較高的同源性，預(yù)示著這些豬種的SLA-DQA外顯子2基因最早可能來(lái)源于其分歧之前的共同祖先原始序列；新發(fā)現(xiàn)的7個(gè)SLA-DQA外顯子2等位基因，可能由遺傳關(guān)系較近的兩個(gè)等位基因突變產(chǎn)生。

合作豬 SLA-DQA外顯子2 多態(tài)性 PCR-SSCP

主要組織相容性復(fù)合體（Major histocompatibility complex，MHC）是緊密連鎖、高度多態(tài)的基因位點(diǎn)所組成的染色體上的一個(gè)遺傳區(qū)域，其表達(dá)產(chǎn)物分布于各種細(xì)胞表面，稱為MHC分子［1，2］。這種遺傳變異改變了肽的編碼蛋白結(jié)合位點(diǎn)，使它們能夠結(jié)合多種外來(lái)多肽［3］。有研究表明，MHC在機(jī)體的免疫應(yīng)答調(diào)控與免疫識(shí)別過程中有重要作用。MHC作為疾病抗性和易感性基因，其組成、結(jié)構(gòu)和疾病之間的關(guān)系成為抗病育種研究的一個(gè)重要部分［4，5］。豬的MHC稱為豬白細(xì)胞抗原（SLA），位于豬的7號(hào)染色體上［6］，SLA的多態(tài)性主要集中在基因編碼區(qū)的外顯子2，具有高度的多態(tài)性和連鎖不平衡，也與豬的抗病力有密切的關(guān)系。豬SLA-DQA基因位于豬SLA-classⅡ區(qū)的DQ亞區(qū)［10］，合作豬DQA基

因外顯子2的遺傳多態(tài)性檢測(cè)與分析，可為進(jìn)一步研究該高原豬種MHC的抗病性，高原適應(yīng)性，抗逆性奠定理論基礎(chǔ)，為更好地利用中國(guó)優(yōu)良的遺傳資源，進(jìn)行豬抗病、抗逆性的育種研究提供有價(jià)值的免疫遺傳學(xué)基礎(chǔ)資料。近年來(lái)，有關(guān)豬MHC-DQA基因的研究報(bào)道有所增加，發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性可以增加仔豬斷奶前后的重量和體質(zhì)［7］；談?dòng)浪傻龋?］對(duì)NIH小型豬及五指山豬的cDNA序列分析表明，SLADQA基因多態(tài)性主要集中在外顯子2；彭永波等［9］研究發(fā)現(xiàn)，具有不同SLA-DQA基因型的豬對(duì)疾病的抵抗能力存在著差異，且與生長(zhǎng)、胴體品質(zhì)及肉質(zhì)等性狀有關(guān)。高度表達(dá)的SLA-DQA外顯子2是SLA中功能最重要的區(qū)域，其多態(tài)性豐富［1，10］，但是這些研究并未涉及中國(guó)合作豬（亦名蕨麻豬或山豬），它是甘肅省甘南藏族自治州特有的地方小型豬種。該品種生長(zhǎng)在海拔3 000 m、氣溫最低-28.5℃的高寒潮濕半農(nóng)半牧區(qū)。具有放牧性能強(qiáng)、抗逆性好，不懼暴曬和風(fēng)雪、體型小、生長(zhǎng)較慢、繁殖力低等特點(diǎn)。有關(guān)中國(guó)合作豬SLA-DQA外顯子2基因的研究，國(guó)內(nèi)外還沒有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究旨在確定合作豬SLA-DQA外顯子2基因的等位基因和多態(tài)位點(diǎn)，分析各個(gè)等位基因之間的遺傳關(guān)系和進(jìn)化意義，為豬的抗病、抗逆性雜交育種研究奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究在甘南州合作市屠宰場(chǎng)采集合作豬血液樣品192份和耳組織樣品91份，在夏河屠宰場(chǎng)采集合作豬血液樣品156份，用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用常規(guī)的酚/氯仿提取法，從血樣中提取DNA并溶解于TE緩沖液，在1%瓊脂糖凝膠，200 V電泳檢測(cè)后，放于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增 采用primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)GenBank發(fā)表的蘇太豬SLA-DQA基因核苷酸全序列（AY303988）設(shè)計(jì)第2外顯子的核苷酸序列引物（上游引物：5'-TCCCTTTGTTGTCACCT-3'，下游引物5'-GCCTGATGTGAACGGGTA-3'），擴(kuò)增目的片段約為341 bp，引物由大連寶生物有限公司合成。

PCR擴(kuò)增采用20 μL的體系，各成分用量：上下游引物各0.4 μL，模板DNA 0.8 μL，滅菌ddH2O26.4 μL，DNA-TAQ預(yù)混酶12 μL。

PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 1 min；變性95℃45 s，退火49℃ 30 s，延伸72℃ 54 s，35個(gè)循環(huán)；最后延伸72℃ 10 min。4℃保存，PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的SSCP檢測(cè) 取2.5 μL PCR產(chǎn)物，7.5 μL變性劑（98%去離子甲酰胺、0.03%二甲苯青、0.025%溴酚藍(lán)、0.5 mol/L混合而成），經(jīng)105℃變性5 min，然后放置于冰上10 min，在12%非變性聚丙烯酰胺凝膠（Acr∶Bis=37.5∶1），4℃、240 V，電泳24 h，結(jié)束后銀染法顯色。

1.2.4 SLA-DQA外顯子2測(cè)序 SSCP分析之后，選取不同基因型個(gè)體PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 用DNAMAN進(jìn)行核苷酸變異位點(diǎn)、氨基酸變異位點(diǎn)的分析，系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建；Megalign對(duì)所測(cè)的合作豬SLA-DQA外顯子2序列進(jìn)行同源序列比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增

對(duì)采集的合作豬樣DQA基因第2外顯子進(jìn)行擴(kuò)增，得到341 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的條帶清晰且無(wú)雜物（圖1），可以進(jìn)行下一步的SSCP分析。

圖1 DQA基因第2外顯子擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2 PCR-SSCP檢測(cè)結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SSCP分析，所檢測(cè)的439只合作豬中共發(fā)現(xiàn)7個(gè)等位基因，分別指定為SLA-

DQA*A、*B、*C、*D、*E、*F、*G。各等位基因的電泳帶從2-6條不等，結(jié)果如圖2所示。

圖2 DQA 基因第2外顯子SSCP電泳圖譜

2.3 SLA-QDA基因外顯子2多態(tài)位點(diǎn)、等位基因頻率與氨基酸差異分析

通過PCR產(chǎn)物測(cè)序，共有7個(gè)DQA基因第2外顯子單倍型序列被確定（圖3）。對(duì)7個(gè)DQA基因第2外顯子341 bp單倍型序列進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)18個(gè)變異位點(diǎn)（圖3），占分析位點(diǎn)的5.28%。其中轉(zhuǎn)換位點(diǎn)15個(gè)，占變異位點(diǎn)的83.33%，包括G/A的轉(zhuǎn)換4個(gè)，T/C轉(zhuǎn)換8個(gè)，A/C轉(zhuǎn)換2個(gè)，G/T轉(zhuǎn)換1個(gè)。顛換位點(diǎn)3個(gè)，占變異位點(diǎn)16.67%。用SLA-DQA基因第2外顯子和部分內(nèi)含子共341 bp序列推導(dǎo)出的氨基酸序列（圖4），共有10個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生了突變，其中單一氨基酸突變位點(diǎn)9個(gè)。A、F、G等位基因在133 bp處C/T和241 bp處的T/C突變，C等位基因在202 bp處的A/G突變，B、D等位基因220 bp處的C/T突變，E等位基因118 bp處的C/T突變并沒有引起氨基酸的變異。

對(duì)測(cè)序獲得的7個(gè)SLA-DQA基因第2外顯子的等位基因頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（表1）發(fā)現(xiàn)，B等位基因的頻率最高；其次是A等位基因，分別為42.14%和19.14%，為SLA-DQA基因的優(yōu)勢(shì)等位基因。

2.4 SLA-DQA基因第2外顯子序列系統(tǒng)發(fā)育分析

為了分析合作豬SLA-DQA基因第2外顯子的等位基因與其他相應(yīng)的等位基因間的遺傳關(guān)系，利用DNAMAN軟件對(duì)SLA-DQA基因第2外顯子的序列進(jìn)行NJ樹的構(gòu)建（圖5）。所用序列包括本研究獲得的7個(gè)單倍型序列，基因庫(kù)下載AY285931（尤卡坦豬），AY303988（蘇太豬），AY906855（辛克萊豬），DQ159886（長(zhǎng)白豬），DQ159887（大白豬），DQ159892（桐城豬），EU432058（梅山豬），EU477534（五指山豬），F(xiàn)J905827（甘肅豬）。圖5顯示，豬SLA-DQA第2外顯子在各個(gè)品種之間的同源性很高，遺傳關(guān)系很近。在新發(fā)現(xiàn)的等位基因中，B、D的遺傳關(guān)系最近，可能是由同一個(gè)等位基因突變而產(chǎn)生的。

3 討論

3.1 合作豬SLA-DQA第2外顯子基因多態(tài)性

圖3 SLA-DQA 基因第2外顯子等位基因核苷酸序列比對(duì)結(jié)果

合作豬是中國(guó)古老的豬品種，分布在海拔3 000

m的甘肅省甘南州等地，由于地理等原因，與群體外的基因交流十分有限。在物種進(jìn)化上，幾乎所有的脊椎動(dòng)物的MHC的高度多態(tài)性是廣泛存在的，并在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中被保留下來(lái)；MHC的多態(tài)性對(duì)物種的生存和繁殖都是有利的，一般認(rèn)為MHC復(fù)合體的每一座位基因上均存在眾多的復(fù)等位基因，而且這些等位基因均為共顯性［11］。選擇是MHC多態(tài)性保持的基本方法［12］，有超顯性選擇、基因頻率的選擇、會(huì)聚化與平穩(wěn)選擇、多樣性選擇及雜化交配，這些選擇的本質(zhì)全是自然選擇的作用。在沒有考慮選擇的情況下，一般認(rèn)為MHC的多態(tài)性是由于長(zhǎng)期進(jìn)化過程中等位基因的積累、融合與擴(kuò)增而形成的［13］。劉云芳等［14］認(rèn)為MHC基因的高度多態(tài)性是由MHCⅡ類抗原在免疫系統(tǒng)中的重要功能所決定的，其功能是參加抗原遞呈和免疫調(diào)控，這是機(jī)體體液免疫的主要調(diào)控因素，進(jìn)而決定了機(jī)體適應(yīng)外界環(huán)境的能力。由于各機(jī)體所處的環(huán)境（地理環(huán)境和氣候環(huán)境）有很大的區(qū)別，所以為了適應(yīng)所處的環(huán)境，其免疫系統(tǒng)具有豐富的多態(tài)，因此編碼MHC抗原最主要功能的區(qū)域也應(yīng)該表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性。本研究在合作豬SLA-DQA基因第2外顯子中發(fā)現(xiàn)新等位基因7個(gè)，之間存在大量的多態(tài)位點(diǎn)，占分析位點(diǎn)的5.28%，說(shuō)明該基因是多堿基突變，具有高度的多態(tài)性。這與合作豬（與平原豬種和國(guó)外品種所處的地理環(huán)境和氣候條件存在較大差異）生活在高原這種比較惡劣的環(huán)境下所形成的適應(yīng)性強(qiáng)，抗逆性好，生長(zhǎng)緩慢等特點(diǎn)相一致。合作豬新等位基因的出現(xiàn)，可能與國(guó)內(nèi)平原豬種和國(guó)外豬種所處地理環(huán)境和氣候環(huán)境的惡劣程度不同有一定的關(guān)系。

圖4 SLA-DQA 基因第2外顯子等位基因氨基酸序列對(duì)比結(jié)果

表1 合作豬SLA-DQA基因第2外顯子各等位基因頻率

圖5 SLA-DQA基因第2外顯子核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

動(dòng)物MHC與疾病的易感性和抗性有關(guān)系［15］。SLA-DQA基因的多態(tài)性和遺傳性是為了保護(hù)機(jī)體組織對(duì)疾病的感染［11］。免疫學(xué)研究揭示，采用免疫遺傳標(biāo)記開展選種工作，可以提高畜禽的抗病力［16，17］。在哺乳動(dòng)物的抗病育種中，MHC基因是已經(jīng)被多項(xiàng)研究證實(shí)的一組重要的候選基因［4，18，19］，合作豬抗病性強(qiáng)，抗逆性好，其在這方面的基因優(yōu)勢(shì)可以用于豬的抗病分子育種實(shí)踐之中。通過合作豬SLADQA基因外顯子2 PCR-SSCP分析，新發(fā)現(xiàn)的7個(gè)等位基因，表明在合作豬群體之中蘊(yùn)藏著豐富的遺傳多態(tài)性，是寶貴的遺傳資源。

3.2 SLA-DQA基因外顯子2系統(tǒng)發(fā)育

合作豬SLA-DQA基因外顯子2序列系統(tǒng)發(fā)育分

析表明，合作豬SLA-DQA基因外顯子2遺傳關(guān)系較近，很可能是由同一個(gè)基因突變分化而來(lái)。系統(tǒng)發(fā)育也表明合作豬SLA-DQA基因外顯子2和國(guó)內(nèi)平原豬種和國(guó)外品種的SLA-DQA基因外顯子2有著較高的同源性。表明合作豬和其他豬種的SLA-DQA基因外顯子2最早可能來(lái)自于它們分歧之前的共同祖先序列。機(jī)體對(duì)所處的地理環(huán)境和氣候環(huán)境的適應(yīng)可能會(huì)提供選擇壓力來(lái)維持MHC特殊的序列［20］，各豬種之間具有比較相似的SLA-DQA基因外顯子2基因序列，而之間的差異很可能就是因?yàn)楦髯运幁h(huán)境的差異而造成的。7個(gè)新等位基因可能由遺傳關(guān)系較近的兩個(gè)等位基因突變產(chǎn)生。

4 結(jié)論

研究獲得了7個(gè)合作豬SLA-DQA基因外顯子2等位基因，說(shuō)明合作豬SLA-DQA基因外顯子2具有較為豐富的多態(tài)性。合作豬SLA-DQA基因外顯子2最初由同一個(gè)等位基因突變分化而來(lái)。合作豬和其他豬種的SLA-DQA基因外顯子2具有較高的同源性，預(yù)示著它們的SLA-DQA基因外顯子2最早可能來(lái)源于分歧之前的共同祖先的原始序列；SLA-DQA基因外顯子2隨地理環(huán)境和氣候環(huán)境的改變而出現(xiàn)差異。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Analyzing Polymorphism of SLA-DQA Gene Exon 2 in the Hezuopig

Zhang Guohua1Ma Xiaojun1，2Lü Weili1
（1. College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730037；2. Gansu Key Laboratory of Herbivorpous Animal Biotechnology，Lanzhou 730070）

The polymorphism, allele number, nucleotide polymorphism sites, amino acid polymorphism sites, the genetic relationship and evolutionary significance of the alleles of the SLA-DQA gene exon 2 in Hezuo pigs were studied. Variation of SLA-DQA gene in the 439 Hezuopigwas investigated by amplification of exon 2 using PCR, followed by single-strand conformational polymorphism（SSCP）, DNA sequencing and sequence data analysis. Result showed that seven alleles were found in the SLA-DQA geneexon 2. Eighteen nucleotide polymorphism sites and ten amino acid polymorphism sites were identified in seven SLA-DQA gene exon 2 haplotypes. The study indicated that a high level of sequence polymorphism existed in SLA-DQA gene exon 2 of Hezuo pigs, and the population might have more genetic resources. SLA-DQA gene exon 2 in Hezuo pigs might be differentiated into two major categories alleles from one mutant alleles at first. SLA-DQA gene exon 2 in Hezuo pigs and other pig had high homology, which indicated that SLA-DQA gene exon 2 in pig might come from primordial sequences that were present in a common ancestor and persisted in the pig populations since their divergence. Seven new alleles that had near genetic relationship, may came from the two near allele by mutation.

Hezuopig SLA-DQA gene exon 2 Polymorphism PCR-SSCP

2013-10-30

甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（096RJZA005）

張國(guó)華，男，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物免疫與抗病；E-mail：664802394@qq.com

馬小軍，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：動(dòng)物免疫與抗??；E-mail：maxj712@163.com