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        香蕉MaBTB基因的表達(dá)分析及亞細(xì)胞定位

        2014-03-17 06:55:47柴文龍金志強(qiáng)賈彩紅劉菊華苗紅霞張建斌徐碧玉
        生物技術(shù)通報(bào) 2014年4期
        關(guān)鍵詞:乙烯香蕉結(jié)構(gòu)域

        柴文龍金志強(qiáng)賈彩紅劉菊華苗紅霞張建斌徐碧玉

        (1.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院,???570228;2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,???71101;3.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院??趯?shí)驗(yàn)站 海南省香蕉遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,???570102)

        香蕉MaBTB基因的表達(dá)分析及亞細(xì)胞定位

        柴文龍1金志強(qiáng)3賈彩紅2劉菊華2苗紅霞2張建斌2徐碧玉2

        (1.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院,???570228;2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海口571101;3.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海口實(shí)驗(yàn)站 海南省香蕉遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,???570102)

        利用熒光定量PCR分析在不同處理下的香蕉采后果實(shí)中MaBTB基因的表達(dá),在正常成熟的果實(shí)中,MaBTB基因的表達(dá)與乙烯的釋放量呈正相關(guān);相反,在1-MCP處理的香蕉果實(shí)中,該基因的表達(dá)相對(duì)變化不明顯;用乙烯處理的香蕉果實(shí),其表達(dá)量在第3天達(dá)到高峰,比正常成熟的早11 d。這些結(jié)果表明MaBTB基因在香蕉采后果實(shí)中是受乙烯誘導(dǎo)表達(dá)的。最后,亞細(xì)胞定位分析表明MaBTB基因定位在細(xì)胞核上。

        香蕉 MaBTB基因 表達(dá)分析 亞細(xì)胞定位

        BTB/POZ(BR-C,ttk and bab or pox virus and zinc finger)家族蛋白是類Kuppel鋅指蛋白家族中的一種,廣泛地存在于從酵母到人類的各個(gè)物種中。它的發(fā)現(xiàn)要追溯到1994年,因最早在果蠅broadcomplex、tralntrack、bric-a-brac三個(gè)蛋白中發(fā)現(xiàn)而得名[1-3]。BTB蛋白并不是一類傳統(tǒng)意義上的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,而是一種既有轉(zhuǎn)錄激活作用又有轉(zhuǎn)錄抑制作用的蛋白[4-7]。它的主要特征是在N端含有BTB結(jié)構(gòu)域,絕大多數(shù)含有該結(jié)構(gòu)域的蛋白通常包括其他的結(jié)構(gòu)域,如鋅指結(jié)構(gòu)域(Zinc finger domain),b-ZIP結(jié)構(gòu)域(Basic region-leucine zipper domain),MATH結(jié)構(gòu)域和錨蛋白重復(fù)(Ankyrin repeats)[8]。這些結(jié)構(gòu)域通過協(xié)同作用行使轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞骨架組織和染色質(zhì)的改變等生物學(xué)功能。植物中目前發(fā)現(xiàn)的含該結(jié)構(gòu)域的已知功能蛋白較少,但多具重要生物學(xué)功能。如擬南芥中的BPM蛋白參與調(diào)控脂肪酸代謝[9],擬南芥中NPR1是植物抗性激素水楊酸的受體[10],玉米中的MAB1調(diào)控紡錘體的長(zhǎng)度和胞核特

        性[11],擬南芥中MATH-BTB參與調(diào)控ABA信號(hào)[12],擬南芥中的LRB1和LRB2編碼的BTB1和BTB2蛋白對(duì)其光形態(tài)發(fā)生有強(qiáng)烈的影響[13]等。

        香蕉是一種典型的躍變型果實(shí),廣泛地分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)。香蕉果實(shí)的乙烯釋放模式與其他躍變型果實(shí)不同,它在呼吸躍變前有一個(gè)突然上升和下降峰值。因此,香蕉中的乙烯釋放機(jī)制與其他躍變型果實(shí)的乙烯釋放機(jī)制不同[14]。為了研究香蕉果實(shí)成熟分子機(jī)制,我們利用抑制差減文庫分離克隆了采后成熟前差異表達(dá)基因[15],獲得一個(gè)與香蕉果實(shí)成熟相關(guān)的BTB基因的cDNA片段。為了研究該基因是否與香蕉果實(shí)成熟和乙烯生物合成相關(guān),克隆該基因的全長(zhǎng),利用熒光定量PCR分析該基因在乙烯生物合成不同時(shí)期的表達(dá)情況。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        香蕉(Musa acuminataL. AAA group cv.Brazilian)果實(shí)(開花后100-120 d)從中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所澄邁香蕉種植園獲得。選取成熟度一致的香蕉果實(shí)分為3組進(jìn)行以下處理。正常成熟處理,將香蕉置于溫度25℃,相對(duì)濕度85%的三洋培養(yǎng)箱(SANYO MRL-350)中;外源乙烯處理,將香蕉果實(shí)放入密閉的保鮮盒中,并注射入100 μL /L的乙烯[14],25℃放置18 h后開蓋,然后再將處理好的香蕉置于溫度25℃,相對(duì)濕度85%的三洋培養(yǎng)箱(SANYO MRL-350)中成熟;1-MCP處理:香蕉果實(shí)放入密封的保鮮盒中按1 μL /L的量秤取1-MCP粉末加水,25℃放置18 h后開蓋,然后再將處理好的香蕉置于溫度25℃,相對(duì)濕度85%的三洋培養(yǎng)箱(SANYO MRL-350)中成熟。處理的香蕉果實(shí)取樣用液氮速凍,于-75℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2 方法

        1.2.1 乙烯釋放量的測(cè)定 果實(shí)乙烯釋放速率測(cè)定的方法如下:將3個(gè)果指放入體積為0.5 L的密封罐中,封罐3 h。用1 mL注射器抽出氣體,用日本島津GC2010型氣相色譜儀測(cè)定果實(shí)乙烯釋放速率,每個(gè)樣品測(cè)定3次。氣相色譜的工作條件為:火焰離子化檢測(cè)器(FID),載體為60-80目AI2O2,柱溫90℃,進(jìn)樣氣溫度100℃,載氣為N2,流速為25 mL/min[16]。測(cè)定完成后,量取果實(shí)的體積和質(zhì)量,計(jì)算香蕉果實(shí)單位體積質(zhì)量下的乙烯的釋放速率。

        1.2.2 RNA的提取和cDNA的合成 香蕉果實(shí)的總RNA提取采用改良的CTAB法[17],第一鏈cDNA合成根據(jù)SMARTTMPCR cDNA試劑盒說明書進(jìn)行。

        1.2.3 熒光定量PCR分析MaBTB基因的表達(dá) 分別提取不同處理的香蕉果實(shí)總RNA。自然成熟:發(fā)育不同階段的果實(shí)分別采取同一植株雌花花序的第1輪、第4輪和第8輪子房(ov1、ov4和ov8)、采后0、2、6、10、12、14和16 d的果實(shí);乙烯處理:0、1、2、3、4、5、6和7 d的果實(shí);1-MCP處理:0、2、6、10、12、14和16 d的果實(shí)。利用SMART PCR cDNA試劑盒將200 ng的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后,用于熒光定量PCR的模板。

        利用熒光定量PCR對(duì)MaBTB基因在香蕉不同處理下的表達(dá)進(jìn)行分析。反應(yīng)體系為:12.5 μL的2ⅹ SYBR Green PCR Master Mix,0.5 μL的 ROX,100 μg的反轉(zhuǎn)錄RNA。所用引物為:MaBTB5':5'-AAACGGCTAATGGTTACAAG-3'(10 pmol);MaBTB3':5'-GTGACGCACATCCACAACTC-3'(10 pmol),actin5':5'-CGAGGCTCAATCAAAGA-3'(10 pmol),actin3':5'-ACCAGCAAGGTCCAAAC-3'(10 pmol)。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 3 min,94℃變性7 s,55℃ 退火15 s,72℃ 延伸20 s,40個(gè)循環(huán)。Actin作為內(nèi)對(duì)照。

        1.2.4 MaBTB基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建與亞細(xì)胞定位 為了分析MaBTB基因在細(xì)胞內(nèi)的定位情況,構(gòu)建了帶有報(bào)告基因GFP的熒光植物表達(dá)載體。用NcoI和SpeI分別雙酶切植物表達(dá)載體pCAMBIA1302和MaBTB目的片段。然后將目的片段和表達(dá)載體進(jìn)行連接,獲得的即是pCAMBIA1302-MaBTB融合植物表達(dá)載體。亞細(xì)胞定位試驗(yàn)中用只攜帶GFP的空載體作為陽性對(duì)照,水作為陰性對(duì)照。最后利用基因槍將該基因?qū)胙笫[表皮,26℃暗處培養(yǎng)18 h后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

        2 結(jié)果

        2.1 香蕉采后果實(shí)乙烯釋放量的測(cè)定

        對(duì)香蕉果實(shí)采后不同處理下的乙烯釋放量進(jìn)行了測(cè)定。研究發(fā)現(xiàn)(圖1),在自然成熟的香蕉果實(shí)中,

        乙烯釋放量在采后8 d開始上升,到14 d時(shí)達(dá)到高峰,而后快速下降(圖1-A)。在乙烯處理的香蕉果實(shí)中,內(nèi)源乙烯在采后第1天開始產(chǎn)生,比自然成熟果實(shí)乙烯釋放量提早了7 d,并且在采后第3天達(dá)到高峰(圖1-B),比自然成熟果實(shí)的乙烯峰值提早了11 d,而且,乙烯處理的香蕉果實(shí)的乙烯釋放量最大值比自然成熟的香蕉果實(shí)的乙烯釋放量最大值高很多。1-MCP處理的香蕉果實(shí)的乙烯釋放量在采后14 d時(shí)開始釋放,并且沒有峰值出現(xiàn)(圖1-C)。

        圖1 乙烯釋放量的測(cè)定

        2.2 MaBTB基因在香蕉采后果實(shí)不同處理下的表達(dá)分析

        利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)MaBTB基因在香蕉果實(shí)采后不同處理下的表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果(圖2)發(fā)現(xiàn),在乙烯處理的香蕉果實(shí)中,MaBTB基因在采后0到3 d表達(dá)量急劇上升。在自然成熟的香蕉果實(shí)中,該基因的表達(dá)最高峰與乙烯處理的表達(dá)最高峰時(shí)間不同,自然成熟的在采后第14天(圖3),乙烯處理的在采后第3天(圖2)。在1-MCP處理的香蕉果實(shí)中,在0-12 d內(nèi)表達(dá)量逐漸上升,沒有明顯的峰值,這種情況持續(xù)到采后第14天(圖4)。

        圖2 MaBTB基因在香蕉果實(shí)乙烯處理下的表達(dá)

        圖3 MaBTB基因在香蕉果實(shí)自然成熟中的表達(dá)

        圖4 MaBTB基因在香蕉果實(shí)1-MCP處理下的表達(dá)

        2.3 MaBTB基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建與亞細(xì)胞定位

        以含有MaBTB基因全長(zhǎng)的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的即是目的基因片段MaBTB(圖5)。再利用NcoI和SpeI雙酶切重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定(圖6),

        結(jié)果表明目的片段已插入表達(dá)載體中,測(cè)序表明該序列與目的基因一致,且與GFP的閱讀框都未發(fā)生變化,這些都表明載體構(gòu)建成功。

        圖5 MaBTB基因PCR擴(kuò)增

        圖6 pCAMBIA1302-MaBTB 雙酶切鑒定

        為了分析MaBTB基因的定位情況,將帶有熒光標(biāo)記的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入洋蔥表皮。觀察發(fā)現(xiàn),陽性對(duì)照在洋蔥整個(gè)細(xì)胞中均有表達(dá)(細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中)(圖7-a,7-b),帶有MaBTB基因的GFP只在細(xì)胞核中表達(dá)(圖7-c,7-d)。而陰性對(duì)照則在細(xì)胞中沒有熒光出現(xiàn)(圖7-e,7-f)。

        3 討論

        在多數(shù)躍變型果實(shí)中,乙烯的釋放是在躍變時(shí)發(fā)生并且不斷增加,一直持續(xù)到果實(shí)成熟。香蕉作為典型的呼吸躍變型果實(shí),其乙烯生物合成與其它躍變型果實(shí)的乙烯生物合成不同,在整個(gè)呼吸過程中,乙烯的釋放量有一個(gè)快速上升和快速下降的過程[14]。本研究中,在自然成熟條件下香蕉果實(shí)的躍變?cè)缙冢蚁]有明顯的變化,在采后的10-14 d有一個(gè)快速升高的過程,在采后14 d達(dá)到高峰,在14-16 d有一個(gè)快速下降的過程。在乙烯處理的香蕉采后果實(shí)中,乙烯的生物合成立即被啟動(dòng),在整個(gè)成熟過程中均有乙烯的產(chǎn)生,且乙烯產(chǎn)生的高峰的出現(xiàn)比自然成熟的早了11 d。這表明外源乙烯加速了香蕉采后的成熟過程[14]。在1-MCP處理的香蕉采后果實(shí)中,乙烯的釋放幾乎完全被抑制。

        圖7 洋蔥表皮細(xì)胞GFP熒光的觀察

        用1-MCP處理的香蕉采后果實(shí)中,在呼吸躍變前MaBTB基因的表達(dá)量比在自然成熟中的表達(dá)量高,但其相對(duì)變化不明顯,這表明1-MCP沒有直接影響MaBTB基因的表達(dá),可能在香蕉成熟過程中影響了其它的路徑。Inaba等[18]研究發(fā)現(xiàn),在香蕉的綠熟期,1-MCP能抑制香蕉的成熟和推遲呼吸的到來。然而,當(dāng)香蕉由綠轉(zhuǎn)黃的過程中,用1-MCP處理香蕉對(duì)其成熟則沒有影響。

        MaBTB基因在3種處理下的表達(dá)分析表明該基因是受乙烯誘導(dǎo)表達(dá)的。在自然成熟的香蕉果實(shí)中MaBTB基因的最大表達(dá)量與乙烯高峰出現(xiàn)一致,同時(shí)該基因的表達(dá)量變化與乙烯釋放量的變化趨勢(shì)也是一致的。在乙烯處理的香蕉采后果實(shí)中,MaBTB基因的表達(dá)量迅速上升與乙烯的釋放趨勢(shì)一致。而在1-MCP處理的香蕉采后果實(shí)中,雖然乙烯的產(chǎn)生量幾乎被抑制,但MaBTB基因的表達(dá)量緩慢上升與乙烯的釋放趨勢(shì)相一致。這些結(jié)果都表明在香蕉果實(shí)采后成熟的過程中,MaBTB基因的表達(dá)是受乙烯調(diào)控的。MaBTB基因在乙烯處理、自然成熟和1-MCP處理的香蕉采后果實(shí)中的最大表達(dá)量分別為84.2%、17.1%和11.5%。外源乙烯處理下香蕉采后果實(shí)中MaBTB基因的最大表達(dá)量分別是自然成熟和1-MCP處理下的MaBTB基因的最大表達(dá)量的4.9和8.2倍。

        這些結(jié)果有力地證明了外源乙烯促進(jìn)了MaBTB基因的表達(dá)。雖然內(nèi)源乙烯的釋放量在第3天達(dá)到高峰,與MaBTB基因的表達(dá)量趨勢(shì)一致,但是在乙烯處理下的香蕉采后果實(shí)中MaBTB基因的表達(dá)量的變化趨勢(shì)比在自然成熟條件下的要迅速。前人研究表明[14],在自然成熟和乙烯處理的香蕉果實(shí)中,乙烯釋放量不同,可能是在乙烯合成中有不同的機(jī)制參與引起的。Weber和Hellma[19]研究表明BPM(BTB/POZMATH)蛋白可以與乙烯的反應(yīng)因子家族作用,這或許代表著另外一種轉(zhuǎn)錄機(jī)制。香蕉MaBTB基因在不同處理中的不同表達(dá)結(jié)果可能與不同的調(diào)控機(jī)制有關(guān),這需要進(jìn)一步的研究證明。

        利用洋蔥表皮進(jìn)行亞細(xì)胞定位觀察基因的定位情況是一種公認(rèn)的試驗(yàn)方法[20,21]。綠色熒光蛋白GFP在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)后,可在藍(lán)光或紫光的激發(fā)下產(chǎn)生明亮的綠色熒光。本研究以基因槍轟擊的方式將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體導(dǎo)入洋蔥表皮細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MaBTB-GFP融合蛋白在洋蔥細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)。這表明MaBTB基因編碼的蛋白作為一種轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞內(nèi)直接或間接參與一些功能基因的啟動(dòng)表達(dá)。

        本研究通過初步探究MaBTB基因的表達(dá)與乙烯的生物合成的關(guān)系,可以為進(jìn)一步研究該基因功能提供線索和思路。然而對(duì)于該基因的具體功能的闡述則需要進(jìn)行更深入的研究。

        4 結(jié)論

        本研究利用熒光定量PCR方法對(duì)在自然成熟,乙烯處理和1-MCP處理等條件下的香蕉采后果實(shí)中的MaBTB基因進(jìn)行表達(dá)分析,結(jié)果表明MaBTB基因在香蕉采后果實(shí)中是受乙烯誘導(dǎo)表達(dá)的。亞細(xì)胞定位分析,表明MaBTB基因是定位在細(xì)胞核上。

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        (責(zé)任編輯 狄艷紅)

        Expression Analysis and Subcellular Localization of the MaBTB Gene in Banana

        Chai Wenlong1Jin Zhiqiang3Jia Caihong2Liu Juhua2Miao Hongxia2Zhang Jianbin2Xu Biyu2
        (1. Department of Agriculture,Hainan University,Haikou 570228;2. Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops,Ministry of Agriculture,Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Haikou 571101;3. Haikou Experimental Station,Institute of Banana,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Haikou 570102)

        Real-time quantitative PCR of postharvest banana revealed that MaBTB exhibited differential expression patterns that are associated with ethylene biosynthesis. In naturally ripened bananas, expression of MaBTB was in accordance with ethylene biosynthesis. In contrast, for 1-methylcyclopropene-treated bananas, MaBTB expression levels remained constant. Following treatment with ethylene, MaBTB expression in banana fruit significantly increased with ethylene biosynthesis and peaked 3 d after harvest, which was 11 d earlier than that for naturally ripened banana fruits. These results suggested that MaBTB expression was induced by ethylene for regulation of postharvest banana ripening. Finally, subcellular localization assays showed that the MaBTB protein localizes to the nucleus.

        Banana(Musa acuminata L. AAA group) MaBTB gene Expression analysis Subcelluar localization

        2013-09-23

        中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)(ITBB110216),海南省重大科技項(xiàng)目子課題(ZDZX2013023-1)

        柴文龍,男,碩士研究生,研究方向:作物遺傳育種;E-mail:chaiwl2012@163.com

        徐碧玉,女,研究員,博士生導(dǎo)師,研究方向:香蕉生物技術(shù);E-mail:biyuxu@126.com

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