孫帆 羅朝兵 周燕妮 張凌云

（北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院 森林培育與保護教育部重點實驗室，北京 100083）

青杄生長素抑制蛋白基因PwARP-1的克隆及表達分析

孫帆 羅朝兵 周燕妮 張凌云

（北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院 森林培育與保護教育部重點實驗室，北京 100083）

從青杄的cDNA文庫中篩選出一個生長素抑制蛋白基因PwARP-1（Auxin-repressed protein 1），并通過RACE-PCR技術(shù)獲得PwARP-1 cDNA全長。生物信息學(xué)分析顯示，PwARP-1基因編碼155個氨基酸殘基的蛋白，分子量為17.1 kD，理論等電點為10.07，富含無規(guī)則卷曲。以多年生青杄和青杄幼苗為研究材料，通過RT-qPCR技術(shù)檢測PwARP-1的組織特異性表達、激素的響應(yīng)模式及種子萌發(fā)過程中的表達量模式。結(jié)果表明，PwARP-1在青杄各個組織中均有表達，在花粉中表達量最高，在種子中的表達量最低。PwARP-1在種子萌發(fā)過程中表達量呈先上升，在第10天表達量達到最高后開始下降。進一步試驗表明，PwARP-1能響應(yīng)多種逆境脅迫和激素處理。在赤霉素（GA）和生長素（IAA）處理下PwARP-1的表達量被抑制。在干旱脅迫和油菜素內(nèi)酯（BR）激素處理下PwARP-1的表達量逐漸升高，而在在鹽脅迫、茉莉酸甲酯（MeJA）和脫落酸（ABA）等激素處理下PwARP-1的表達量先下降后上升。這些結(jié)果顯示PwARP-1可能參與了植物種子萌發(fā)、多種逆境脅迫和激素響應(yīng)過程。

青杄 生長素抑制蛋白 表達分析 植物激素

生長素在植物的生長發(fā)育過程中具有重要的作用［1］。生長素在胚胎形成、細胞分裂伸長以及分化，側(cè)根形成和頂端優(yōu)勢的形成等過程中發(fā)揮重要的功能［2，3］。生長素調(diào)節(jié)下游基因表達的機理十分復(fù)雜，近年來生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑研究取得了較大的成果。

在生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，主要有兩類基因發(fā)揮了功能，包括生長素素結(jié)合蛋白（Auxin binding proteins，ABFs）以及受生長素調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子。生長素結(jié)合蛋白和生長素的結(jié)合，通過調(diào)控細胞周期參與了細胞的分裂和擴增［4，5］。在生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中有多種家族的基因（Auxin responsive gene）參與其中，包括生長素響應(yīng)因子（Auxin response

factors，ARFs）和AUX/ IAA轉(zhuǎn)錄因子等。ARFsN端DNA結(jié)合域識別受生長素調(diào)節(jié)基因啟動子中的生長素響應(yīng)元件（Auxin responding elements）而調(diào)節(jié)下游基因的表達［6-8］。AUX/ IAA是一種可被泛素蛋白酶體途徑（ubiquitin-proteasome pathway）降解，壽命很短暫的一種蛋白［9］。在較低的生長素濃度下，AUX/ IAA不與DNA直接作用，而是和ARFs形成異源二聚體，阻止ARFs調(diào)控下游基因的表達［10］。在較高的生長素濃度下，泛素化的AUX/ IAA被COP9信號（COP9 signalosome）招募到26S 蛋白酶體中水解，從而釋放出ARFs引起下游基因的表達［11］。

在植物的生長發(fā)育過程中，生長素抑制蛋白（Auxin repressed protein）具有重要的功能。在草莓中，隨著果實的生長ARP基因SAR5的表達被生長素抑制，而且抑制作用和果實的成熟呈現(xiàn)正相關(guān)［12］。在煙草花粉成熟的過程中，煙草ARP基因表達量上升，但在花粉萌發(fā)的過程中表達受到抑制［13］。在之前的文獻報道中，ARP基因使植物停止生長，維持休眠的狀態(tài)。但是ARP基因?qū)е轮参镄菝叩姆肿訖C制所知甚少。

青杄（Picea wilsoniiMast.），又名青皮云杉，為松科（Pinaceae）云杉屬（Picea）常綠喬木，是我國特有的樹種。青杄分布較廣，是一種優(yōu)良的用材和園林綠化樹種，對逆境環(huán)境具有較強的抵抗能力［14］。本研究在實驗室前期研究的基礎(chǔ)上通過RACE-PCR技術(shù)從青杄 cDNA文庫中克隆到一個生長素抑制蛋白基因，獲得其全長cDNA序列，通過生物信息學(xué)分析命名為PwARP-1；根據(jù)其核酸序列推導(dǎo)出其氨基酸序列，通過生物信息學(xué)軟件進行蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測。利用RT-qPCR技術(shù)測定PwARP-1在不同組織、種子萌發(fā)和不同激素逆境的響應(yīng)過程中表達量的變化。本試驗旨在為研究生長素抑制蛋白ARP-1在林木生長發(fā)育和抗逆過程中的功能，及林木遺傳育種和林木抗逆基因的篩選提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料和培養(yǎng)條件 組織特異性表達試驗參考李長江等試驗方法［15］，使用3年苗齡青杄幼苗根、莖及針葉和成年青杄的花粉及種子，青杄種子與花粉采集于中國科學(xué)院北京植物園。種子春化后播于濾紙上，保持濾紙濕潤。種子萌發(fā)后移苗至培養(yǎng)基質(zhì)中。青杄幼苗培養(yǎng)于室溫，空氣濕度50%，光周期為16 h光照，8 h黑暗的溫室，培養(yǎng)基質(zhì)為營養(yǎng)土和蛭石按1∶1混合，每周使用自來水充分澆灌一次。植物材料經(jīng)處理后液氮速凍于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試驗試劑 青杄cDNA文庫載體為pDONR222購自Invitrogen公司?？寺≥d體為pEASY-T1，購自Transgene公司。PCR Taq Mix、DNA Maker（DL2000）、熒 光 定 量PCR試 劑 盒（SYBR Green SuperReal Premix）和RNA提取試劑盒（RNAprep Pure Plant Kit）購自天根（北京）生化科技有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit）購自Fermentas公司。所用激素購自Sigma公司。其他試劑購自AMRESCO公司。

1.2 方法

1.2.1 RACE-PCR 獲取目的基因PwARP-1的全長以青杄cDNA文庫為模板［16］，從載體pDONR222接頭序列和目的基因的EST序列設(shè)計引物，使用引物5-F和5-R擴增5'方向，使用3-F和3-R擴增出3'方向的序列。5-F：CTGTTCGTTGCAACAAATTG A，5-R：TGGCAGAATTAGTAATAGTTG；3-F：AGTAATAAGTACAAAAATAAC，3-R：T TAAACAACGTTGCTTGTCCA。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 根據(jù)PwARP-1cDNA全長序列，利用DNAMAN推導(dǎo)出PwARP-1的開放閱讀框確定其蛋白氨基酸序列，運用clustalx軟件和DNAMAN軟件多序列比對，利用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，構(gòu)樹方法為鄰連法（Neighbor-joini ng），bootstap 檢測為1 000次。利用Expasy中的Compute pI/Mw工具來計算蛋白的理論等電點與分子量；利用Prot- Scale工（http：//web.expasy.org/prot scale/）進行疏水性分析；利用NCBI的保守域數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）對目的基因的結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測；利用GOR4（http：//npsa-pbil. ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automa t.pl?page=npsa_gor4.html）進行蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.2.3 激素和脅迫處理 激素和脅迫試驗參考Li等［17］處理方法，將處理的激素處理時間和濃度加以調(diào)整。具體處理方法如下：將8周苗齡的青杄幼苗根浸入激素溶液分別處理3、6和12 h，以水為對照。試驗中使用的激素包括ABA、IAA、GA、MeJA、SA、Br和Eth，濃度均為100 nmol/ L。鹽脅迫試驗中，使用100 nmol/ L的NaCl溶液模擬鹽脅迫。干旱脅迫試驗中，將8周苗齡的青杄幼苗干旱處理20 d，以正常澆水處理的青杄幼苗為對照。處理后的青杄幼苗液氮速凍，于-80℃保存?zhèn)溆?。用于該基因在不同外源激素和脅迫的響應(yīng)分析。

1.2.4 種子萌發(fā)試驗 參考李長江等［15］試驗方法將青杄種子春化1個月后，放置于濾紙上，保持濾紙濕潤，在室溫條件（25℃）下進行萌發(fā)試驗。從種子放置于濕潤的濾紙上的第1天開始取樣，每隔1 d取1次樣，每次取樣后液氮速凍，并于-80℃保存?zhèn)溆?，用于該基因在種子不同萌發(fā)時期表達量分析。

1.2.5 實時熒光定量PCR分析 通過艾德來公司植物RNA提取試劑盒提取青杄各個器官總RNA，利用Fermentas公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成PwARP-1的第一鏈cDNA。以青杄EF1-α［18］為內(nèi)參基因，根據(jù)PwARP-1的CDS序列設(shè)計特異性引物。F：CTCAGTTCTTATGG AGGA；R：GCATTCACAA CAATGTCA。利用天根公司的熒光定量PCR試劑盒在實時熒光定量PCR儀上（ABI Step One Plus）進行RT-qPCR試驗，分析PwARP-1組織特異性表達、不同激素和逆境脅迫的響應(yīng)模式。

2 結(jié)果

2.1PwARP-1的克隆

PwARP-1的全長cDNA序列共有956 bp，在第12 bp處發(fā)現(xiàn)起始密碼子ATG，在476 bp處發(fā)現(xiàn)終止密碼子TGA，共編碼155個氨基酸殘基。3'非編碼區(qū)包含477 bp，在序列末端發(fā)現(xiàn)Poly（A）21尾巴（圖1-A）。

圖1 PwARP-1的全長序列和氨基酸序列

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 理化性質(zhì)分析 利用Protpapram工具分析，PwARP-1分子量為17.1 kD，理論等電點為10.07。預(yù)測的分子式為C747H1215N223O227S5。PwARP-1蛋白中的氨基酸以絲氨酸（Ser）含量最多，為12.3%，其次精氨酸（Arg）為9.7%，丙氨酸（Ala）為9%，。

不穩(wěn)定系數(shù)為69.33，表明PwARP-1狀態(tài)不穩(wěn)定。疏水性分析結(jié)果顯示其疏水性最大值為1.244，親水峰最高是-3.122，平均疏水性為-0.610，顯示PwARP-1是一個親水性蛋白質(zhì)（圖 2-A）。Foldindex固有無序化分析顯示，PwARP-1蛋白無序化較大，推測目的蛋白在生理環(huán)境下動態(tài)活性較高（圖 2-B）。通過TMHMM工具對PwARP-1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)分析，未發(fā)現(xiàn)含有跨膜結(jié)構(gòu)。

圖2 PwARP-1的理化性質(zhì)分析

2.2.2 多序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹分析 運用NCBI的BLAST工具檢索PwARP-1的同源基因，發(fā)現(xiàn)白云杉（Picea glauca）、毛果楊（Populus trichocarpa）、蘋果（Malusx domestica）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）等物種中的同源基因（表 1）。利用ClustalX軟件對PwARP-1及其同源基因的氨基酸序列多序列比對后發(fā)現(xiàn)ARP家族基因的在N端和C端比較保守（圖3）。結(jié)合軟件Mega5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果（圖4-A）發(fā)現(xiàn)，在所比較的同源基因中，PwARP-1和PsDAAP-1（Dormancy/ Auxin association protein） 聚為一簇，親緣關(guān)系最近。

表1 PwARP-1的同源基因

2.2.3 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用GOR4對PwARP-1的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測后發(fā)現(xiàn)，PwARP-1含有無規(guī)則卷曲（58.71%）、α-螺旋（32.26%）和和延伸鏈（9.03%）。無規(guī)則卷曲含量在整個二級結(jié)構(gòu)中最高（圖 4-B，4-C）。利用NCBI網(wǎng)站的保守域數(shù)據(jù)庫預(yù)測，結(jié)果表明PwARP-1含有一個生長素抑制蛋白家族（Auxinrepressed superfamily）的保守域，E值2.03e-13。

2.3PwARP-1的表達分析

2.3.1PwARP-1的組織表達特異性分析 分別提取3年生青杄幼苗根、莖及針葉和成年青杄種子及花粉的RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA提取質(zhì)量良好，28S與18S條帶清晰，適合后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄以及RT-qPCR試驗。RT-qPCR結(jié)果（圖 5）分析顯示，PwARP-1在各個組織中均有表達，但在花粉中的表達量最高，依次為根、針葉、莖和種子。

2.3.2PwARP-1種子萌發(fā)過程中表達分析 提取不同萌發(fā)天數(shù)的青杄種子RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA提取質(zhì)量良好，28S與18S條帶清晰，可以進行后續(xù)的試驗。RT-qPCR結(jié)果（圖6）顯示，PwARP-1表達量隨著種子的萌發(fā)呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。種子萌發(fā)早期，PwARP-1表達量開始上升，在第10天表達量達到最高后，開始下降。

2.3.3PwARP-1對不同激素和非生物脅迫的響應(yīng)試驗 相對于對照，在100 nmol/ L的IAA處理6 h和12 h后，PwARP-1的表達量被明顯的抑制。在100 nmol/ L GA和Eth的處理下PwARP-1的表達量逐漸下降。在100 nmol/ LABA、MeJA和SA分別處理后，

PwARP-1的表達量先下降，在6 h降到最低后上升。ABA和SA處理12 h后PwARP-1表達量和處理3 h表達量差異不顯著。MeJA處理12 h后PwARP-1的表達量有所上升，但和處理3 h的表達量相比差異顯著。在100 nmol/L的BR處理下，PwARP-1的表達量逐漸上升（圖 7-A）。

圖3 不同物種ARP蛋白多序列比對

圖4 青杄PwARP-1進化樹分析和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用RT-qPCR測定PwAPR-1的表達量變化。以正常澆水的青杄幼苗為對照（Mock），將8周苗

齡的青杄幼苗干旱處理20 d后，發(fā)現(xiàn)PwARP-1的表達量上升（圖7-B）。100 nmol/ L NaCl處理青杄幼苗3 h、6 h和12 h后以水（Mock）為對照，檢測PwARP-1的表達量后發(fā)現(xiàn)PwARP-1的表達量先下降而后上升，處理 12 h表達量和處理3 h的表達量相比差異不顯著。

圖5 PwARP-1組織特異性表達分析

圖 6 PwARP-1在種子萌發(fā)過程中的表達分析

圖7 PwARP-1在不同外源激素和脅迫處理下的表達量

3 討論

本研究通過RACE-PCR方法成功獲得一個分子伴侶基因PwARP-1的cDNA全長序列。以青杄cDNA文庫為模板的RACE 試驗是基于 EST 保守序列和 pDONR-222載體上特異的引物進行的，cDNA全長是由PwARP-1的末端序列和 EST 序列進行拼接而來，進而獲得基因cDNA全長。相比之下，比傳統(tǒng)的通過同源植物保守序列設(shè)計兼并引物的方法更加便捷［18］。經(jīng)過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，PwARP-1基因編碼了一個包含155個氨基酸的蛋白，分子量約為17.1 kD，二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲所占比重最大，并NCBI保守域數(shù)據(jù)庫預(yù)測PwARP-1含有一個Auxin-repressed家族保守域。多序列比對以及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，PwARP-1和PsDAAP-1聚為一簇，顯示青杄（Picea wilsonii）的ARP-1蛋白和北美云杉（Picea sitchensis）DAAP蛋白的親緣關(guān)系最近。DAAP-1蛋白是一個休眠和生長素相關(guān)的蛋白，因此推測PwARP-1可能與植物的休眠相關(guān)。

組織特異性表達試驗顯示，PwARP-1在花粉中的表達量最高，依次為根、針葉、莖和種子。因此推測PwARP-1在花粉的休眠和萌發(fā)過程中發(fā)揮重要作用。種子萌發(fā)過程中，PwARP-1表達量在萌發(fā)前期呈上升趨勢，在第10天表達量達到最高值后開始下降。PwARP-1在青杄種子萌發(fā)過程中發(fā)揮重要作用。在進一步的激素響應(yīng)試驗中，在100 nmol/ L的IAA處理6 h和12 h后，PwARP-1的表達量被明顯的抑制。但有趣的是，并非所有的ARP家族基因都會被生長素抑制。在牛奶子（Elaeagnus umbellata）中發(fā)現(xiàn)的EuNOD-ARP1是ARP家族成員，但是生長素處理葉片后EuNOD-ARP1的表達量升高，顯示出ARP家族基因功能的多樣性［19］。在100 nmol/L GA和Eth的處理下PwARP-1的表達量逐漸下降。但在100 nmol/ L的ABA、MeJA、SA和NaCl分別處理后，PwARP-1的表達量先下降，在處理6 h后降到最低后上升。處理12 h后PwARP-1的表達量恢復(fù)或者部分恢復(fù)到3 h表達水平，推測PwARP-1在上述激素處理和鹽脅迫早期發(fā)揮作用。在100 nmol/ L的BR處理下，PwARP-1的表達量逐漸上升。在干旱脅迫處理后，PwAPR-1的表達量升高。Hwang等［20］研

究發(fā)現(xiàn)，白菜（Brassica rapa）在干旱、鹽、熱擊和冷害處理下BrARP-1的表達量升高。在之前的文獻報道中，非生物脅迫處理后，ARP基因會被誘導(dǎo)上升［21］。在本試驗中PwARP-1對多種激素和非生物脅迫處理都有不同響應(yīng)，顯示其在植物的生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮多種功能，尤其是PwARP-1在種子和花粉萌發(fā)過程以及激素早期響應(yīng)過程中的功能需要更深入的研究。

4 結(jié)論

從青杄cDNA文庫中克隆生長素抑制蛋白PwARP-1，含有155個氨基酸殘基，該蛋白分子量為17.1 kD，等電點為10.07，富含無規(guī)則卷曲。PwARP-1響應(yīng)多種激素和逆境處理。

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（責(zé)任編輯 李楠）

The Cloning and Expression Analysis of PwARP-1 in Picea wilsonii

Sun Fan Luo Chaobing Zhou Yanni Zhang Lingyu
（Key Laboratory of Forest Silviculture and Conservation of Ministry of Education，College of Forestry，Beijing Forestry University，Beijing 100083）

An auxin repressed protein gene PwARP-1 is cloned from Picea wilsonii. The full length cDNA of PwARP-1 is obtained by RACE-PCR assays based on the cDNA library of Picea wilsonii and EST fragment of PwARP-1. Bioinformatic tools are applied for the prediction of PwARP-1. PwARP-1 encodes a protein with 155 amino acids. The molecular weight is 17.1 kD and theoretical pI is 10.07 and the protein is rich in random coil. The tissue-specific expressions and the response to phytohormones of PwARP-1 were investigated by RT-qPCR assays. The tissue-specific expression assays suggested that the expression level in pollen was the highest among all tissues and the expression level in seed was the lowest. During seed germination, the expression of PwARP-1 was increased, peaked at the 10th day and then decreased. Furthermore, the expression of PwARP-1 was significantly inhibited by Auxin and Gibberellin. However, the expression level of PwARP-1 is up-regulated by Brassinolide and drought stress treatment. The expression level of PwARP-1 declined and then up-regulated under salt stress, methyl jasmonate, and abscisic acid treatments. These results indicate that PwARP-1 has a potential function in seed germination and responding to stresses and phytohormone treatments.

Picea wilsonii Auxin-repressed protein Expression analysis Phytohormone

2014-01-17

國家自然科學(xué)基金面上項目（31270663），國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項（2013ZX08009003-002-004）

孫帆，男，碩士碩士生，研究方向：植物抗逆基因克隆和功能；Email：sunfan0041@126.com

張凌云，女，博士，碩士生導(dǎo)師；研究方向：植物生殖與逆境生理；E-mail:lyzhang73@sohu.com