宋愷胡潔林文翰季宇彬

（1. 哈爾濱商業(yè)大學生命科學與環(huán)境科學研究中心，哈爾濱 150076；2. 國家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，哈爾濱 150076；3. 北京大學天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室，北京 100191）

海綿共附生真菌多樣性及其次級代謝產物的研究進展

宋愷1，2，3胡潔3林文翰3季宇彬1，2，3

（1. 哈爾濱商業(yè)大學生命科學與環(huán)境科學研究中心，哈爾濱 150076；2. 國家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，哈爾濱 150076；3. 北京大學天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室，北京 100191）

海綿由于其獨特的生理結構、進食方式使其體內部聚集了大量的微生物，這些微生物產生了多種結構新穎的生物活性物質，因此海綿及其共附生微生物的研究成為了海洋藥物研發(fā)的熱點。就海綿中共附生真菌的分布情況，新技術的應用及其生物次級代謝產物的生物活性展開綜述。

海綿 共附生真菌 次級代謝產物 化學防御 生物活性

1 海綿與其共附生微生物關系

海綿（Sponge）是地球上最原始的無脊椎生物，屬于多孔動物門（Porifera），共有1 000多種，占所有海洋動物總數的1/15。作為底棲生物，海綿附著于海洋底層，通過不斷振動體壁的鞭毛，使含有食餌的海水不斷從這些小孔滲入瓶腔，進入體內。當海水從瓶壁滲入時，水中的營養(yǎng)物質，如動植物碎屑、藻類、微生物等，便被領鞭毛細胞捕捉后吞噬。營養(yǎng)物質被消化吸收，廢物隨海水從出水口流出體外。在這個過程中，可以過濾70%以上的微生物。所以一株海綿中常常存有上百種微生物［1，2］。

這些共附生的微生物涵蓋了放線菌、細菌、真菌等。按分布位置可分成3類：（1）海綿體表附生的微生物，種類與外界微生物種類相似，隨著海洋環(huán)境的變化而變動；（2）沒有被海綿吞噬的微生物，會駐留在海綿中質層內，是海綿共附生微生物中數量最多的一類；（3）長期寄居在海綿細胞細胞核內的微生物，其具有宿主特異性［2］。

在長期共同進化的過程中，海綿與其共附生微生物之間形成了奇妙的關系。產生了許多具有特殊結構和生理學功能的活性物質、構建了強大的化學防御武器。早前的研究，一直將研究的重點集中在海綿個體上，沒有考慮到海綿與其共附生微生物的關系，忽略了微生物對于海綿的特殊意義。最近的

研究顯示，從海綿來源微生物發(fā)酵液中分離到的化合物結構與之前從其宿主中獲得的化合物結構十分相似，因此有人推測，在海綿中分離到的很多化合物可能都由附生在其中的微生物產生［3］。2004年，科學家們從Theonella swinhoei海綿中發(fā)現了兩種物質［4］，它們的結構中都包含了聚酮骨架結構。而編碼這一類結構的基因經測序、比對，發(fā)現是來源于一種原核生物，就此推測該化合物可能是由附著在海綿上的細菌產生的［4］。

雖然目前還不能明確海綿共附生微生物在海綿生活過程中所承擔的具體作用，但是有越來越多的證據顯示，它們是一個和諧的有機體。2004年Perovic-Ottstadt等［5］首次報道了Suberites domuncula海綿的細胞表面存在一種可以識別1，3-β-葡萄糖的受體，人們就此推測海綿就是依靠這種分子機制來辨別其周圍環(huán)境中的真菌。此外，2006年，Rot等［6］在海綿體內發(fā)現了具有內含子的線粒體，而海綿的線粒體基因組中不含有內含子。這說明海綿與其他物種之間出現了水平基因的轉移，此線粒體后被證實來源于一種真菌。這一發(fā)現提示，在微生物與其寄主之間可能存在某些特殊的交流方式。

2 新技術的應用

由于近些年來分子生物學技術的快速發(fā)展，許多新技術應用到了海洋微生物的研究領域。例如，PCR擴增技術、16S DNA文庫、限制性內切酶片段長度多態(tài)性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）、變性梯度凝膠電泳技術（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）和熒光原位雜交技術（Fluorescentin situhybridization，FISH）等的應用，使得許多不可培養(yǎng)的海綿共附生微生物的相關研究取得了進展，更多的菌種被發(fā)現，豐富了海洋微生物的多樣性［7］。

2.1 PCR聚合酶鏈反應

PCR是一種常用的分子生物學技術，是通過模擬生物體內的遺傳物質的復制過程，實現在體外對DNA或RNA片段進行擴增。PCR技術的特點在于可快速從微量樣品中得到我們所需要的基因信息，無需大規(guī)模的發(fā)酵培養(yǎng)，非常適合復雜微生物體系的研究，可以在分子水平對于共生微生物進行菌種鑒定，功能基因的篩選等。除此之外，PCR擴增也是克隆文庫建立、酶切試驗中的一個組成部分。

2.2 16S rDNA/18S rDNA

由于16S rDNA、18S rDNA的高度保守性，一直被廣泛地應用于菌種的鑒定分析及微生物遺傳性研究。科研人員可通過設計特定引物，應用PCR擴增得到目的片段，經測序后比對，得到未知菌種的生物學信息，這是目前公認的比較快速、有效的鑒定分類方法。關于海綿中共附生細菌16S rDNA的研究較多，相關真菌的信息報道較少。上海交通大學科研人員完成了我國永興島海域海綿共附生真菌的相關研究［8］，通過對保守區(qū)18S rDNA的研究建立了進化樹，分析了種屬間的親緣關系豐富了菌種的多樣性，確立了微生物的進化和分類關系。

2.3 DGGE

DGGE即變性梯度凝膠電泳，是根據DNA在不同濃度的變性劑中解鏈行為的不同而導致電泳遷移率發(fā)生變化，從而將片段大小相同而堿基組成不同的DNA片段分開。近些年來，海綿共附生微生物的研究中也應用了這一技術。

DGGE對微生物的分析通常包括：DNA提取，16S rRNA序列的PCR擴增以及DGGE指紋圖譜分析。也可通過基因克隆、建立16S rDNA文庫，通過系統發(fā)育樹的建立，分析微生物多樣性信息。 這項技術的優(yōu)勢在于，可以避免對與同一個生物體中存在的多個相似度高的菌株進行重復研究，最大程度上的降低試驗量。

2.4 RFLP

RFLP是一種利用限制性核酸酶切片段長度差異來檢測生物個體之間差異的分子標記技術。Lee等［9］為了研究濟州島海域海綿中微生物的種群信息，利用RFLP技術對分離自海綿的微生物進行酶切，將170株微生物分成了19個代表型。中科院大連化學物理所的研究人員利用巢式PCR和RFLP的方法對兩株海綿中的非培養(yǎng)的微生物進行研究，結果196株微生物被分成了46個代表型，證實了海綿中微生物的多樣性。這次試驗的成功也為日后設計分離不可培養(yǎng)微生物作出了嘗試［10］。

3 海綿共附生真菌多樣性及其分布情況

2008年，Li等［11］從海綿Gelliodesfibrosa、Haliclona caerulea和Mycalearmata中分離到可培養(yǎng)真菌235株，通過形態(tài)學分類并用分子生物學的方法對其保守區(qū)域進行擴增，將其歸為26個屬；同年，Gao等［12］對另外兩種海綿Suberiteszeteki和Mycalearmata展開共附生真菌種群多樣性的研究，略有不同的是，此次研究并沒有通過分離培養(yǎng)后抽取DNA的方法進行PCR擴增，而是將海綿及其共生微生物的基因組同時提取出來，建立基因文庫、利用 DGGE 的方法闡述共生微生物的多樣性，此方法將分離到的共生真菌歸為子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）下11個目下的44種。2011年，Zhou等［8］分離并鑒定了來源于我國南海的海綿共附生真菌177株并進行了RFLP酶切多態(tài)性分析，通過18S rRNA 的擴增、測序、BLAST比對發(fā)現，這些分別屬于子囊菌門（Ascomycota）下4個目的10個屬。其中青霉屬（Penicillium）和曲霉（Aspergillus）是優(yōu)勢種群。并利用分子探針對其PKS、NRPS基因簇進行篩選和測序比對。

2013年，巴西科學家從海綿等海洋生物中分離了得到了256株真菌，181株細菌［13］。利用PCR擴增真菌28S rDNA、細菌16S rDNA序列。并利用先進的擴增核糖體DNA限制性分析（Amplified ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA）技術選取不同的內切酶，對擴增得得到的保守序列進行酶切，最后通過酶切圖譜來分析菌間的多樣性。揭示了海綿中豐富的微生物資源，而ARDRA技術的應用也幫助人們更好地了解微生物種群多樣性。

4 共附生真菌相關代謝產物及其活性的研究

早在1950年就有報道說從海綿中分離到活性物質，此后陸續(xù)從海綿中發(fā)現許多結構新穎，活性特異的化合物。海綿及其共附生真菌中的活性物質具有易成環(huán)、不飽和程度高等特點。主要的生物學活性包括細胞毒、抗菌、抗病毒、生物毒素和酶抑制劑等［14］。

4.1 抗腫瘤、細胞毒活性

自從1997年，日本科學家第一次報道了海綿共生真菌產生的3種活性物質對于P388淋巴癌細胞具有顯著的細胞毒活性［15］以來，越來越多的海綿真菌來源的活性物質被發(fā)現具有抗腫瘤活性。

2011年，Cohen等［16］在地中海海綿Psammociniasp.的共生真菌Aspergillus insuetus的發(fā)酵液中提取到了7個化合物，其中4個化合物（1-4）屬首次發(fā)現（圖1）。

圖1 化合物1-7結構圖［16］

對這7種化合物進行抗真菌Neurospora crassa及對于MOLT-4人急性淋巴母細胞白血病細胞的藥理學試驗，結果顯示，化合物1、6、7的最低抑菌濃度分別為140、242和162 μmol/L?；衔?、4、7對于MOLT-4細胞的抑制率分別為51%、55%、72%。

2012年，Sun等［17］從Xestospongia testudinaria海綿中的Aspergillussp.的發(fā)酵液中分離到3個新化合物disydonols A-C（8-10），和一個已知化合物（S）-

（+）-sydonol（11）（圖2）。

圖2 化合物8-11結構圖［17］

通過MTT法對于HepG-2和人宮頸癌細胞進行測試，發(fā)現化合物1和3顯示出細胞毒活性，IC50值分別為9.31、2.40 μg/mL，2.91和10.20 μg/mL。而化合物2則沒有細胞毒活性IC50＞100 μg/mL）。

2013年，Amagata等［18］從海綿來源的真菌Gymnascella dankaliensis分離到了一種聚酮酪氨酸類的衍生物dankastatin C（12）和一種已知的類固醇化合物demethylincisterol A3（13），（結構見圖3），這種化合物第一次被發(fā)現是在Homaxinella 海綿中。Dankastatin C（12）顯示出對于淋巴細胞白血病P388有很強的抑制作用。陽性藥物五氟尿嘧啶作為陽性藥物，ED50值為78 ng/mL。

圖3 化合物12-13結構圖

4.2 抗菌

據統計，有微生物生物膜參與的感染占到人類感染性疾病的總數的80%，這已嚴重威脅到了人類的健康。表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）是一種寄居在人皮膚的正常菌群，一般情況下不會引發(fā)疾病，是一種機會致病菌，由于近年來臨床治療中越來越多的醫(yī)療設備器材的使用，有關表皮葡萄球菌致病的消息屢見不鮮，其引發(fā)的感染日益嚴重，目前已經成為臨床中最常見的病原體。加之近些年抗生素的過度使用，導致臨床上耐藥菌株大量產生，新型抗生素的研究成為藥物研究的熱點。2013年，Scopel等［19］從海綿來源的一株真菌Penicilliumsp. F37中分離到一種環(huán)二肽類化合物，藥理學試驗發(fā)現這種化合物可以通過抑制微生物生物膜的形成來影響致病菌的生長，對臨床常見致病菌表皮葡萄球菌的抑制率達到了85%，是一種很有潛力的抗菌先導化合物。

Kong等［20］在海綿的真菌Metarhizium anisopliae mxh-99發(fā)酵液中分離到的兩種化合物對于枯草分支桿菌的抑制作用，isochaetochromin B2（6）和ustilaginoidin D（7）的MICs值為50.0 μg/mL。對于肺結核致病菌有較強的抑制作用。

Subramani等［21］從Melophlussp.海綿中分離得到的Penicilliumsp.中分離到了桔霉素，此前的研究結果顯示，桔霉素對于多種多藥耐藥菌株具有很強的抑制作用。對鰓足蟲幼蟲也有細胞毒活性。

2010年，Meenupriya等［22］在科瓦藍海岸采集

到Callyspongiaspp.海綿樣品分離了海綿中可培養(yǎng)的共附生真菌，并對其進行ITS和5.8S區(qū)的分子水平鑒定。而后將待測的6株真菌與致病菌（金黃色葡萄球菌和大腸桿菌）共培養(yǎng)，通過測量抑菌環(huán)大小的方法來判斷抑菌活性強弱，結果顯示真菌Aspergillus flavus顯示出潛在的抗菌活性。對這金葡菌和大腸桿菌的抑菌圈分別為18和31 mm。而兩種真菌濾液的抑菌效果更強，對以上兩種的抑菌圈分別為27和42 mm，顯示出很強的抑菌活性。

4.3 抗病毒

海水中存在大量的致病菌群，而海綿為了免遭感染，在長期進化的過程中，與其共附生微生物形成很好的默契，產生了一系列具有抗微生物的活性物質。Peng等［23］在海綿來源的Epicoccumsp.JJY40中分離到一個新化合物（14）以及一個已知結構化合物（15）發(fā)現這類含有長鏈的結構，在天然產物中是很少見的。并對這兩種化合物進行抗H1N1病毒的活性試驗，結果顯示兩者的IC50值分別為91.5和 101.3 μmol/L。而傳統抗病毒藥利巴韋林作為陽性參考的IC50值為114.8 μmol/L。這兩種化合物下顯示出很強的抗病毒活性?；衔?還對NF-κB有抑制作用，是一種極具開發(fā)價值的先導化合物，結構見圖4。

圖4 化合物14-15結構圖［23］

4.4 抗瘧原蟲

Almeda等［24］在海綿Callyspongiasp. cf.C. flammea中分離到一種真菌Stachylidiumsp.分離得到4種化合物marilones A-C，silvaticol。其中marilones A B的骨架結構很少見。它們的生物學活性也特殊，其中marilones A可以抑制瘧原蟲肝期感染。其IC50值為 12.1 μmol/L，Marilone B（2）表現出對于5-HT的拮抗作用。

4.5 降解污染物

海綿生活在海洋中，而每天有大量的污染物被排放入海，這勢必會給海綿帶來傷害。不過我們采集到的海綿，體表都很光滑、潔凈。推測海綿中可能附生著可以降解油污的微生物。

Kirana等［25］在印度半島海域采集到的海綿Fasciospongia cavernosa中分離到了一種共附生真菌Aspergillus ustus MSF3，并在其中發(fā)現了一種生物表面活性劑20℃時，pH7.0時使用葡萄糖肉湯為培養(yǎng)基時，這種活性產物的產量最高。此課題組也報道了篩選具有表面活性劑潛力生產菌的方法。

4.6 其他

海綿生活在復雜的海洋中，經常要面對來自各方面的威脅，許多水生生物如壺藻，藻類等喜歡附著在其他生物體表面，掠奪其他生物的生存空間和食物。海綿共附生的微生物就會產生一些具有化學防御作用的活性物質來保護自己和宿主。趙琨等［26］在中國南海海綿中分離獲得一株真菌Pleosporaceaesp.［27］，發(fā)現，其發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物對豐年蟲具有較強的殺傷性，同時表現出對藤壺幼蟲的抑制作用。

5 小結

我國海域遼闊，海綿及其他底棲生物資源極為豐富。其中所富含的微生物資源更是天然寶藏。且微生物具有繁殖快，培養(yǎng)成本低廉等特點、可綜合利用發(fā)酵等現代技術進行大規(guī)模的工業(yè)化生產，因此海綿共附生微生物來源藥物具有極大的開發(fā)潛力。

本實驗室開展了海綿來源微生物多樣性及天然代謝產物性的研究工作，從海綿及珊瑚中分離可培養(yǎng)真菌400余株，在海綿來源真菌的發(fā)酵液分離到天然產物。運用現代分子生物學手段，通過PCR的方法擴增真菌ITS rDNA 進行分子水平的鑒定，已完成的工作發(fā)現這些可培養(yǎng)真菌分屬于30余屬，其中優(yōu)勢菌種為曲霉（Aspergillus）和枝孢菌（Cladosporium）。這與之前李志勇等的研究報道中有關海綿共附生微生物的種群分布情況有所不同，分

析原因可能是由于海綿所在海域及其種類不同造成的，而另一個主要的原因經推測可能是在研究中使用了不同的微生物篩選條件及鑒定方法產生了不同的結果。我們還對真菌18S rDNA進行RFLP酶切試驗及藥理活性篩選，研究其生物多樣性及活性。與此同時，根據分離得到的化合物結構進行了生物合成途徑的推測，利用功能酶基因作為探針在建立的Fosmid文庫中對合成相關基因簇進行篩選。其他相關工作也在同步進行中。

目前這一領域存在很多亟待解決的問題。首先，能夠進行實驗室人工分離到并可培養(yǎng)的共附生微生物僅占全部微生物的很小一部分，絕大多數微生物類群仍然未被分離和認識。其次，在千百年的進化過程中海綿與其共附生微生物構成了和諧的整體，為了應對海洋中捕食者的獵殺、競爭者的侵略、病原菌的侵害及環(huán)境脅迫等情況，產生了一系列獨特的化學防御物質，這些活性物質在抗炎、抗病毒、抗氧化發(fā)揮著特殊的作用。但是，很多特殊結構功能的次級代謝產物是在特殊環(huán)境中應激所產生的，而在實驗室培養(yǎng)的條件下，這些代謝通路可能關閉，如何使這些沉默基因表達值得人們思考。例如，進行菌種間的共培養(yǎng)、模擬生物體原本的生活環(huán)境等。再者，科學家們已經進行了大量微生物代謝產物的化學分離工作，新結構的化合物層出不窮，但相關藥理學篩選模型還比較單一，針對性不強。如果從化學生態(tài)學的角度分析這些活性物質的產生原因，或許可以認識這些結構各異的化學物質的獨特活性。除此之外，近年來基于分子生物學技術在海洋微生物代謝產物研究中的應用，一系列生物合成基因簇被發(fā)現，相關化合物的生源途徑的研究也有報道。不過相較于陸生微生物，人類對于海洋微生物的了解還知之甚少。如何優(yōu)化使用這些現代分子生物學技術，對于人們進一步認識、利用海洋微生物資源，開發(fā)海洋藥物有著極其重要的意義。

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（責任編輯 狄艷紅）

Studies on Diversity of Sponges-associated Fungi and Their Secondary Metabolites

Song Kai1，2，3Hu Jie3Lin Wenhan3Ji Yubin1，2，3
（1. Research Center on Life Sciences and Environmental Sciences，Harbin University o f Commerce，Harbin 150076；2. Engineering Research Center of Natural Anticancer Drugs，Ministry of Education，Harbin 150076；3. State Key Laboratory of Natural and Biommietic Drugs，Peking University，Beijing 100191）

Because of the unique physiological structure and digest system, marine sponges enrich large numbers of microorganisms. Lots of novel bioactive compounds were isolated and identified from sponges-associated fungi, which is highlight in marine drug discovery. The development on the distribution of fungi, the application of new technique, novel bioactive secondary metabolites and biological activities were reviewed.

Sponge Symbiotic-fungi Secondary metabolites Chemical defense Bioactivity

2013-09-29

國家“863”計劃項目（2011AA090701）

宋愷，男，碩士研究生，研究方向：海洋天然產物生物合成；E-mail：unochris1314@163.com

季宇彬，男，博士生導師，研究方向：抗腫瘤藥物；E-mail：jyb@hrbcu.edu.cn