張射兵 陸曉和 曲 清 段艷冰，

1.南京健友生化制藥股份有限公司，江蘇南京210061；2.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院，江蘇南京210012

依諾肝素鈉原料藥細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的研究

張射兵1陸曉和2曲 清1段艷冰1，2

1.南京健友生化制藥股份有限公司，江蘇南京210061；2.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院，江蘇南京210012

目的建立依諾肝素鈉原料藥的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法。方法按照《中國藥典》2010年版二部，確定合理的依諾肝素鈉細(xì)菌內(nèi)毒素限值，并研究依諾肝素鈉對細(xì)菌內(nèi)毒素與鱟試劑反應(yīng)的干擾情況，以確定其不干擾試驗濃度。結(jié)果確定依諾肝素鈉的細(xì)菌內(nèi)毒素限值為0.01 EU/U，使用2個廠家生產(chǎn)的鱟試劑試驗，本品配制成3 U/mL濃度對反應(yīng)均無干擾作用。結(jié)論細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法可用于依諾肝素鈉細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查。

依諾肝素鈉；細(xì)菌內(nèi)毒素；干擾試驗

肝素（heparin）是經(jīng)豬小腸提取的黏多糖類生化藥物，是臨床經(jīng)典的胃腸外系統(tǒng)應(yīng)用的抗凝劑，其主要作用機(jī)制是抑制凝血X因子和通過與抗凝血酶的相互作用間接抑制凝血酶。肝素與1916年被發(fā)現(xiàn)，并與1973年成功地應(yīng)用于臨床，肝素臨床上的應(yīng)用是醫(yī)學(xué)史上劃時代意義的事件，肝素的問世也推動了臨床介入工作的發(fā)展。目前肝素在臨床上仍廣泛地應(yīng)用于血栓栓塞性疾病、體外循環(huán)、血液透析、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療等領(lǐng)域。但是肝素由于其分子量大，而且只能通過注射給藥，會有一定比例的不良反應(yīng)發(fā)生。為了克服肝素的不足，臨床上有開發(fā)出一系列的低分子肝素（low-molecular-weight heparin，LMWH）品種，同肝素相比，低分子肝素具有療效明顯、半衰期長、出血不良反應(yīng)發(fā)生率小等優(yōu)點[1]。低分子肝素可皮下注射，不需要持續(xù)的靜脈滴注，其引起血小板減少的發(fā)生率相對較低[2]。

低分子肝素是由肝素經(jīng)過化學(xué)或者酶解的方法得到的分子量相對較低的肝素片段。其中依諾肝素是目前臨床使用最為廣泛的低分子肝素。依諾肝素鈉是肝素鈉的芐酯衍生物，經(jīng)堿裂解而得的低分子量肝素鈉鹽，其平均分子量在3800～5000之間[3]。由于依諾肝素為生物源性的產(chǎn)品，其粗品中帶有很多的生物源性的物質(zhì)，而且其注射液為無菌分裝產(chǎn)品，因此對于依諾肝素原料進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素的控制，十分有必要。本文參《中國藥典》2010年二部附錄中收載的“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”和相關(guān)文獻(xiàn)資料建立依諾肝素原料中細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法，并對方法可行性進(jìn)行了研究。

1 儀器與試藥

XW-80A型漩渦混合器（上海精科實業(yè)有限公司）；TZL-5004恒溫水浴鍋（蘇州珀西瓦爾實驗設(shè)備有限公司）；XS205型電子天平（瑞士Meltler公司）；DHG-9240A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；無熱原吸頭及封口膜（均購自江蘇康華醫(yī)藥科技實業(yè)中心）。

依諾肝素鈉：規(guī)格為原料藥，南京健友生化制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號分別為50211202、50211203、50211301，以干燥品計抗Xa效價分別為102、101、101 U/mg。

鱟試劑（TAL）：靈敏度（λ）為0.03 EU/mL，批號為0903130（湛江安度斯生物有限公司產(chǎn)品），批號為09110712（福州新北生化工業(yè)有限公司）。細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）：中國藥品生物制品檢定所，批號為150601-200861，150 EU/支。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET用水）：湛江安度斯生物有限公司產(chǎn)品，批號為10012210，細(xì)菌內(nèi)毒素含量小于0.003 EU/mL，規(guī)格為50 mL/支。

2 方法與結(jié)果

2.1 鱟試劑（TAL）靈敏度（λ）復(fù)核試驗

參照《中國藥典》2010年版二部附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[4]相關(guān)規(guī)定進(jìn)行TAL靈敏度復(fù)核試驗，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，所用的鱟試劑靈敏度均在0.5λ~2.0λ范圍內(nèi)，表明兩個廠家TAL的靈敏度均符合規(guī)定。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗

2.2 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）的確定

參照《中國藥典》2010年版二部附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法項下內(nèi)毒素限值的計算公式：L=K/M，式中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值以EU/mg表示；K為按規(guī)定的給藥途徑，人用每公斤體重每小時的最大供試品劑量，以EU/（kg·h）表示；M為人用每千克每小時最大劑量，以mg/（kg·h）表示。依諾肝素鈉應(yīng)用于臨床為注射劑皮下或者靜脈給藥，K值規(guī)定為5 EU/（kg·h）；查閱依諾肝素鈉注射液說明書[5]得知，人用每千克每小時的最大依諾肝素鈉劑量M為150 U/（kg·h），計算其細(xì)菌內(nèi)毒素限值L為0.03 EU/U?！睹绹幍洹?5版[6]規(guī)定依諾肝素原料及注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素限值均為0.01 EU/U。結(jié)合生產(chǎn)實際，為了嚴(yán)格控制產(chǎn)品質(zhì)量，并參照國內(nèi)報道的注射用細(xì)菌內(nèi)毒素的限值，本試驗最終擬定依諾肝素鈉原料藥細(xì)菌內(nèi)毒素的限值為0.01 EU/U。

2.3 供試品的最小有效稀釋濃度

最小有效稀釋濃度C=λ/L，其中：λ為鱟試劑的靈敏度（EU/U）；L為依諾肝素原料藥的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（EU/mg）。本品為原料藥，確定最小有效稀釋倍數(shù)（MVC），當(dāng)L=0.01 EU/U，取靈敏度（λ）0.03 EU/mL的鱟試劑，由公式C=λ/L計算出供試品的最小有效稀釋濃度為3 U/mL。

2.4 干擾預(yù)試驗[7]

取依諾肝素鈉（批號：50211202、50211203、50211 301），分別精密稱取適量，精密加BET用水依次制成濃度為24、12、6、3 U/mL的溶液，記為NPC系列；另制備含有2λ（0.06 EU/mL）細(xì)菌內(nèi)毒素的同一樣品濃度系列，記為PPC系列。用λ為0.03 EU/mL的2個廠家的TAL分別與上述NPC和PPC系列溶液進(jìn)行反應(yīng)[7]，每個濃度重復(fù)2管，并設(shè)陰性對照（NC）和陽性對照（PC）各2管。結(jié)果見表2。由干擾預(yù)試驗結(jié)果可初步了解，供試品溶液稀釋至24、12、6、3 U/mL濃度時，對2個廠家的TAL與細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng)均不存在干擾作用。其中鱟試劑靈敏度λ=0.03 EU/mL。

表2 干擾預(yù)試驗

2.5 正式干擾試驗（鱟試劑：靈敏度λ=0.03 EU/mL）

按限值L＜0.01 EU/U計算，用靈敏度λ=0.03 EU/mL的鱟試劑，最小有效稀釋濃度為3 U/mL。故選擇3 U/mL作為供試品溶液的配制濃度。為了進(jìn)一步確認(rèn)供試品溶液對λ=0.03 EU/mL的鱟試劑是否存在干擾作用，分別用BET水和濃度為3 U/mL的供試品溶液進(jìn)行實驗，將洗凈內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品配制成1λ、2λ、0.5λ、0.25λ濃度的系列內(nèi)毒素溶液。精密稱取依諾肝素鈉（批號：50211202、50211203、50211301）適量，分別用BET用水制成最終濃度為3 U/mL的溶液，用該溶液和BET用水分別將CSE稀釋成含內(nèi)毒素0.06（2λ）、0.03（1λ）、0.015（0.5λ）、0.0075（0.25λ）EU/mL的系列溶液，用2個廠家λ為0.03 EU/mL的TAL，按《中國藥典》2010年版二部細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行干擾試驗，結(jié)果見表3。

按公式E=antilg（∑X/4）計算并比較系列間的效價值（Es和Et）[8]。0.5λ≤Es（Es′）≤2λ，且0.5 Es（Es′）≤Et（Et′）≤2Es（Es′）。表明在此試驗條件下，依諾肝素鈉的細(xì)菌內(nèi)毒素限值為0.01 EU/U，供試品在濃度為3 U/mL下不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢測試驗。

表3 干擾試驗

2.6 供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

將3個批號的供試品，用BET水配制成濃度為3 U/mL供試品溶液，然后用λ為0.03 EU/mL的兩個廠家的TAL各8支實驗。參照《中國藥典》2010年版二部附錄[4]進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，均符合規(guī)定。結(jié)果見表4。

表4 干擾試驗

3 討論

依諾肝素鈉為生化類抗凝藥物，其起始原料為主小腸的提取物肝素，因此此類生化藥物中多含有較多的蛋白等雜質(zhì)，在產(chǎn)品生產(chǎn)過程中除蛋白是關(guān)鍵的步驟之一[9]。而依諾肝素鈉制劑是預(yù)充針的無菌分裝品種，制劑生產(chǎn)過程中往往不能再增加除熱原的步驟，因此在原料中指定細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是十分必要的。為提高藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，更有效地控制藥品質(zhì)量，依據(jù)《中國藥典》2010年版二部凡例二十二條“同一原料藥用于不同制劑時，需根據(jù)臨床用藥要求制訂相應(yīng)的質(zhì)量控制項目”的要求，制訂該原料藥的安全性檢查項目是非常必需的[10]。

將依諾肝素鈉原料藥細(xì)菌內(nèi)毒素限值定在0.01 EU/U與其注射劑限值[11]相同，這個限度可以很好地保證注射劑的生產(chǎn)和臨床使用上的安全性。采用2個廠家的TAL對3批樣品進(jìn)行干擾試驗及用不同廠家、不同靈敏度的TAL對3批樣品進(jìn)行方法學(xué)驗證試驗，結(jié)果表明，當(dāng)樣品稀釋至3 U/mL濃度時對TAL與細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng)無干擾作用，方法學(xué)驗證結(jié)果也符合細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法有效性的規(guī)定。因此，依諾肝素鈉原料藥采用內(nèi)毒素檢查法（鱟試劑法）是可行的，具體檢查方法：取本品，依照《中國藥典》2010年版二部附錄ⅪE方法[3]，每單位依諾肝素鈉中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于0.01 EU。因樣品獲取困難，本試驗僅使用了1家廠家的3批樣品，考慮到細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是一項復(fù)雜的酶促反應(yīng)過程[12]，影響因素多，如要真正將該品種的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法載入國家標(biāo)準(zhǔn)，還有待于積累更多的試驗數(shù)據(jù)。該方法目前可先在廠內(nèi)中間體的質(zhì)量控制中予以運用。

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Study on bacterial endotoxiin test method for Enoxaparin Sodium

ZHANG Shebing1LU Xiaohe2QU Qing1DUAN Yanbing1，2
1.Nanjing King-friend Biochemical Pharmaceutical Co.,LTD.,Jiangsu Province,Nanjing210061,China;2.Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command of PLA,Jiangsu Province,Nanjing210012,China

ObjectiveTo establish a method of examining bacterial endotoxin for Enoxapain sodium.MethodsThe reasonable limit of endotoxin was determined by using Chinese Pharmacopoeia(2010 edition,2 volume),and study on testing for bacterial endotoxin to determine the noninterference concentration for Enoxaparin Sodium.ResultsThe most suitable limit of bacterial endotoxin in preparation for Enoxaparin Sodium was 0.01 EU/U and the TAL of two manufacturers was used to test,and it was proved that the best noninterference concentration was 3 U/mL.ConclusionIt is showed that,the method is suitable for the Enoxaparin Sodium of bacterial endotoxin test.

Enoxaparin Sodium;Bacterial endotoxin test;Interference test

R331

A

1673-7210（2014）04（c）-0092-04

2013-11-14本文編輯：衛(wèi)軻）

江蘇省科技成果轉(zhuǎn)化專項資金項目（編號BA20 12033）。

張射兵（1985-），男，江蘇鹽城人，南京中醫(yī)藥大學(xué)2009級藥學(xué)專業(yè)在讀碩士研究生；研究方向：化藥研究和藥品注冊工作。

段艷冰（1978-），男，博士，副主任藥師；研究方向：創(chuàng)新藥的研究和管理工作。