張海, 李佳川, 胡泊楊, 王平

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué), 四川 成都 611137; 2.西南民族大學(xué), 四川 成都 610041）

ZHANG Hai1, LI Jia-chuan2, HU Po-yang1, WANG Ping1

（1. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, P.R.C.; 2.Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.）

巴馬汀對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞IL-6表達(dá)的影響

張海1, 李佳川2, 胡泊楊1, 王平1

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué), 四川 成都 611137; 2.西南民族大學(xué), 四川 成都 610041）

目的: 觀察巴馬汀對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的RAW264.7小鼠巨噬細(xì)白介素6(IL-6)表達(dá)的作用. 方法: 采用LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞建立細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型, 加入不同濃度的巴馬汀, 采用ELISA法檢測(cè)IL-6的生成量; 采用qRT-PCR法檢測(cè)IL-6 mRNA的表達(dá). 結(jié)果: 巴馬汀能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞IL-6的生成, 以及IL-6 mRNA的表達(dá), 并呈現(xiàn)出濃度依賴性. 結(jié)論: 巴馬汀可通過(guò)抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞IL-6的生成及IL-6 mRNA的表達(dá), 從而發(fā)揮抗炎作用.

巴馬汀; LPS; RAW264.7巨噬細(xì)胞; IL-6

內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁上的一種脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)和蛋白的復(fù)合物, 其中LPS是誘發(fā)炎癥反應(yīng)過(guò)程中的主要致病因素, 它可以誘導(dǎo)體內(nèi)單核-巨噬細(xì)胞合成并釋放多種炎癥介質(zhì), 參與機(jī)體免疫炎癥反應(yīng). IL-6是釋放的這些炎癥介質(zhì)中的核心成員之一, 具有廣泛的生物學(xué)活性, 它不僅是一種炎癥細(xì)胞因子,也是一種促炎介質(zhì)[1-2], 檢測(cè)IL-6對(duì)研究炎性疾病發(fā)病機(jī)制和治療具有重要意義. 巴馬汀(palmatine)系由毛茛科植物黃連(Rhizoma Coptidis)的干燥根莖中提取得到的生物堿精制而成, 具有抗菌[3-5]等廣泛的藥理作用. 動(dòng)物試驗(yàn)研究表明巴馬汀具有促ACTH釋放功能[6], 故具有抗炎作用, 但就其抗炎機(jī)制而言, 目前研究甚少. 本研究通過(guò)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞建立炎癥反應(yīng)模型, 觀察巴馬汀對(duì)IL-6的生成及IL-6 mRNA的表達(dá), 探討其體外抗炎機(jī)制.

1 材料

1.1 藥品及試劑

巴馬汀(HPLC≥98%), 成都曼思特生物科技有限公司; 胎牛血清, 北京元亨金馬生物技術(shù)開發(fā)公司; DMEM培養(yǎng)基, 賽墨飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司; 二甲基亞砜(DMSO), 成都市科龍化工試劑廠. Alarm-Blue細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)試劑, 上海生博醫(yī)學(xué)生物工程科技有限公司; 內(nèi)毒素(LPS), 美國(guó)Sigma公司, BAY 11-7082,碧云天生物技術(shù)研究所; 白介素6(IL-6) 酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒, Uscn Life Science Inc; qRT-PCR試劑盒SsoFastTM EvaGreen? SuperMix, Bio-Rad Laboratories.

1.2 細(xì)胞株

小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞株細(xì)胞, 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院.

1.3 儀器

SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái), 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司; MCO-15AC型CO2培養(yǎng); Multiskan MK3 酶標(biāo)儀, 美國(guó)Thermo公司; 倒臵顯微鏡, 日本Olympus公司; 分析天平, sartorius公司; Chromo4熒光定量PCR儀、My Cycler?PCR儀, 美國(guó)Bio-Rad公司.

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7細(xì)胞按常規(guī)方法復(fù)蘇, 培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青霉素(1×105U/L)及鏈霉素(100 mg/L)的DMEM高糖培養(yǎng)基中, 臵于37℃、5% CO2、95%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng). 倒臵顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況, 細(xì)胞貼壁率達(dá)到80%左右傳代, 傳代三次以上細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期, 即可用于實(shí)驗(yàn).

2.2 細(xì)胞增殖檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞, 按4×104/孔200 μl接種到96孔培養(yǎng)板, 臵于37℃、5% CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng). 培養(yǎng)過(guò)夜后, 加入終濃度為0.1μM、1μM、10μM、20μM、30μM、50μM的巴馬汀, 同時(shí)設(shè)臵空白對(duì)照組. 臵于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng), 細(xì)胞培養(yǎng)滿24h后每孔加入Alarm-Blue細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)試劑10μL并于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2-6h. 當(dāng)培養(yǎng)基的顏色由靛青藍(lán)變成粉紅色后用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定各孔相對(duì)熒光單位(RF值), 激發(fā)光波長(zhǎng)和發(fā)射光波長(zhǎng)分別設(shè)臵為560nm和590nm. 根據(jù)所測(cè)得的RUF值計(jì)算RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖抑制率:

細(xì)胞增殖抑制率=(1－實(shí)驗(yàn)組RFU值/空白對(duì)照組RFU值)×100%

2.3 巴馬汀對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞生成IL-6的影響

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的RAW264.7巨噬細(xì)胞, 用0.25%胰蛋白酶消化后加含10% FBS的無(wú)酚紅DMEM高糖培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液, 并稀釋細(xì)胞濃度至5×105個(gè)/mL接種到24孔培養(yǎng)板, 每孔1mL, 臵于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

實(shí)驗(yàn)分為巴馬汀組, 濃度分別為1μM 、10μM、30μM; 陽(yáng)性藥BAY 11-7082組, 濃度為10μM, 同時(shí)設(shè)臵LPS組(LPS: 1μg/mL)和空白對(duì)照組. 細(xì)胞融合后, 以上各組除LPS組和空白對(duì)照組外均先加入相應(yīng)的藥物預(yù)處理1h, 然后各組加入1μg/mL的LPS, 空白對(duì)照組加入相同體積的DMSO, 臵于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后取細(xì)胞培養(yǎng)上清液, 按試劑盒說(shuō)明操作, 用酶標(biāo)儀于450nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值.

2.4 巴馬汀對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞IL-6 mRNA表達(dá)的影響

細(xì)胞懸液稀釋至1×106個(gè)/mL, 2mL/孔接種至6孔培養(yǎng)板. 細(xì)胞融合后, 各組加入相應(yīng)藥物孵育1h, 然后除空白對(duì)照組外, 各組加入1μg/mL的LPS, 于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后終止培養(yǎng). TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA, 紫外分光光度計(jì)在260nm波長(zhǎng)處測(cè)定RNA濃度. 以O(shè)ligo(dT)18為引物, 用SuperScript III逆轉(zhuǎn)錄酶將新提取的等量細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA. 以cDNA為模板, 用SsoFastTM EvaGreen? SuperMix熒光定量反應(yīng)試劑盒進(jìn)行定量PCR反應(yīng), 以GAPDH為內(nèi)參. 熒光定量PCR所用引物見表1.

表1 熒光定量PCR所用引物序列Tab.1 Primers of qRT-PCR

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析. 組間差異比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA), 方差齊者采用LSD 檢驗(yàn), 方差不齊者采用Tamhane’s T2 檢驗(yàn), 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x_±s)表示, 以p<0.05認(rèn)為其組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

3 結(jié)果

3.1 巴馬汀對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖的影響

如表2所示, 巴馬汀50μM濃度對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用, 其他濃度對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的增殖沒(méi)有明顯的影響, 和空白對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異, 表明0.1μM、1μM、10μM、20μM和30μM的巴馬汀無(wú)細(xì)胞毒作用, 不影響細(xì)胞的生長(zhǎng), 所以選取濃度在50μM以下的巴馬汀用于實(shí)驗(yàn).

表2 巴馬汀對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖的影響Tab.2 Effect of palmatine on the cell proliferation of RAW 264.7 macrophage cells

3.2 巴馬汀對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞生成IL-6的影響

如圖1所示, 正常RAW264.7巨噬細(xì)胞上清液中IL-6含量很低, 給予LPS刺激后, 各組IL-6的生產(chǎn)量均顯著增加, 加入BAY 11-7082和不同濃度的巴馬汀能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的IL-6生成, 其中, 巴馬汀的抑制作用呈現(xiàn)出濃度依賴性.

3.3 巴馬汀對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞IL-6 mRNA表達(dá)的影響

如圖2所示, 和空白組比較, LPS可顯著誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞IL-6 mRNA的表達(dá), BAY 11-7082和不同濃度的巴馬汀均可顯著抑制IL-6 mRNA的表達(dá), 其抑制效應(yīng)隨著巴馬汀濃度的增加而增強(qiáng).

圖1 巴馬汀對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞生成IL-6的影響Fig.1 Effect of palmatine on IL-6 production in LPS-induced RAW264.7 cells

圖2 巴馬汀對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞IL-6 mRNA表達(dá)的影響Fig.2 Effect of palmatine on the expression of IL-6 mRNA in LPS-induced RAW264.7 cells

4 討論與結(jié)論

巨噬細(xì)胞(Macrophages)是調(diào)控炎癥反應(yīng)的主要細(xì)胞, 是體內(nèi)啟動(dòng)炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的中心細(xì)胞. 在參與炎癥反應(yīng)的各種介質(zhì)中, 最重要的是腫瘤壞死因子( tumor necrosis factor, TNF), 白細(xì)胞介素-1( interleukin-1, IL-1 )、IL-6、IL-8等促炎性細(xì)胞因子(pro-inflammatory cytokine), 與內(nèi)毒素休克發(fā)病和死亡的關(guān)系也最為密切[7-8]. IL-6又稱B細(xì)胞分化因子, 由單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞及纖維母細(xì)胞產(chǎn)生, 是重要的致熱性細(xì)胞因子, 可由IL-1和TNF-α誘導(dǎo)產(chǎn)生, 其在血漿中的水平常作為細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活的一個(gè)標(biāo)志, 反映出宿主炎癥反應(yīng)與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性[9].

巴馬汀存在于多種植物中, 是中藥黃連、黃柏、黃藤等的主要生物活性物質(zhì). 本研究中, 我們選取炎性細(xì)胞因子IL-6及其mRNA的表達(dá)來(lái)探討巴馬汀抗炎作用分子機(jī)制. 結(jié)果表明, 巴馬汀對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放IL-6有明顯的抑制作用, 且呈劑量依賴; qRT-PCR結(jié)果顯示, 巴馬汀能明顯抑制IL-6 mRNA的表達(dá), 表明巴馬汀可影響促炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá).

綜上所述, 巴馬汀可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞L-6生成, 表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗炎作用. 由于炎性細(xì)胞因子mRNA含量代表了轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平, 因此可得出巴馬汀的抗炎作用是通過(guò)抑制IL-6 mRNA的表達(dá)發(fā)揮作用. 研究表明, 核因子κB (NF-κB)和活化蛋白AP-1能從基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控IL-6和IL-1β等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)[10]; 巴馬汀的抗炎作用是否與NF-κB通路有關(guān), 即是否還存在其他靶點(diǎn)和環(huán)節(jié)仍需進(jìn)一步研究.

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Effect of palmatine on IL-6 expression induced by LPS in RAW264.7 macrophage cells

Objective:To investigate the effect of palmatine on IL-6 expression induced by lipopolysaccharide (LPS) in RAW264. 7 mice macrophage cells.Methods:An inflammatory response model was established using RAW264.7 macrophage cells induced by LPS. Doses of palmatine were used to treat RAW264.7 macrophage cells to evaluate the effects of palmatine. IL-6 concentration was measured with ELISA and IL-6 mRNA expression was tested by qRT-PCR.Results:Palmatine inhibited the production of IL-6 and IL-6 mRNA expreesion in LPS-stimulated RAW264.7 macrophage cells in a dose-dependent manner.Conclusion:The anti-inflammatory effects of palmatine may be mediated by inhibiting the production of IL-6 and the expression of IL-6 mRNA.

palmatine; LPS; RAW264.7 macrophage cell; IL-6

ZHANG Hai1, LI Jia-chuan2, HU Po-yang1, WANG Ping1

（1. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, P.R.C.; 2.Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.）

R285,R96

A

1003-4271(2014)04-0527-04

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.04.11

2014-04-22

張海(1986-), 男, 漢族, 四川巴中人, 助理實(shí)驗(yàn)師, 碩士. 研究方向: 中藥藥效與毒理. E-mail:haicheung@163.com.

王平(1979-), 男, 漢族, 陜西咸陽(yáng)人, 副教授, 碩士. 研究方向: 中藥藥效與藥代. E-mail:viviansector@aliyun.com.

四川省教育廳項(xiàng)目“黃連治療老年性癡呆（AD）作用與α7nACh受體相關(guān)性研究”(13ZB0314)和“民族藥娘孜澤苦寒傷肝量-時(shí)-毒復(fù)雜關(guān)系研究”(14ZB0467); 成都中醫(yī)藥大學(xué)科技發(fā)展基金面上項(xiàng)目“黃連堿體外抗炎及其潛在性治療阿爾茲海默癥作用的研究”(ZRMS201337); 國(guó)家自然科學(xué)基金“從‘痰-濁-毒’毒損腦絡(luò)病機(jī)基礎(chǔ)探討對(duì)酒蒸黃連石菖蒲組分抗糖尿病認(rèn)知障礙的配伍調(diào)控機(jī)制”(81302912).