仇麗穎, 嚴(yán)平, 沈安靜, 劉暉

（西南民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境保護(hù)工程學(xué)院, 四川 成都 610041）

豬去氧膽酸與BSA相互作用研究

仇麗穎, 嚴(yán)平, 沈安靜, 劉暉

（西南民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境保護(hù)工程學(xué)院, 四川 成都 610041）

目的: 采用熒光光譜法研究豬去氧膽酸(HDCA)與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用. 方法: 根據(jù)25℃及37℃溫度下HDCA對BSA的熒光猝滅作用, 通過Stern-volmer方程和Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程計(jì)算反應(yīng)的猝滅常數(shù)和形成常數(shù)以判斷熒光猝滅類型, 采用雙對數(shù)方程計(jì)算HDCA與BSA的結(jié)合常數(shù)(KA)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n), 最后采用熱力學(xué)公式計(jì)算反應(yīng)前后焓變和熵變確定兩者結(jié)合的主要作用力類型. 結(jié)果: HDCA對BSA的熒光淬滅作用屬于靜態(tài)熒光淬滅. 在溫度25℃和37℃時(shí), HDCA與BSA的結(jié)合常數(shù)分別為0.258×106L·mol-1和0.453×104L·mol-1, 結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別0.92和0.62. 由于熱力學(xué)參數(shù)焓變(ΔH=-258.72 KJ·mol-1)和熵變(ΔS=-0.76 J·mol-1·K-1)均小于零, 因此確定HDCA與BSA之間的作用力主要為氫鍵和范德華力作用. 結(jié)論: HDCA與BSA通過氫鍵和范德華力形成復(fù)合物, 經(jīng)靜態(tài)猝滅機(jī)制引起B(yǎng)SA內(nèi)源性熒光猝滅.

豬去氧膽酸; 牛血清白蛋白; 熒光光譜

豬去氧膽酸(Hyodesoxycholic Acid, HDCA, 3α, 6α-二羥基-5β-膽烷酸)是從豬膽汁中提取的一種膽烷酸, 具有降血脂、鎮(zhèn)痙、抑菌等作用[1], 是很多中成藥如清開靈系列產(chǎn)品、膽酸止咳片、膽黃片、霍膽丸、膽香鼻炎片的主要有效成分, 因此被作為含量測定的檢測對象, 以控制藥品的質(zhì)量. 然而, 藥品療效不僅與其外在質(zhì)量息息相關(guān), 更取決于藥物或其活性代謝物在體內(nèi)的存在狀態(tài)和濃度, 因此藥動學(xué)研究有助于對藥物療效或毒性做出正確評價(jià), 也是制定安全有效給藥方案的基礎(chǔ). 國內(nèi)有關(guān)豬去氧膽酸的藥動學(xué)研究極少, 僅見于清開靈注射劑的研究[2-3].

白蛋白是血漿中含量最高的載體蛋白, 主要與有機(jī)酸藥物結(jié)合. 藥物進(jìn)入體循環(huán)后與白蛋白結(jié)合, 將不能跨膜轉(zhuǎn)運(yùn), 儲存于血漿中, 暫時(shí)失去藥理作用. 因此, 藥物與血漿蛋白結(jié)合能力的高低直接影響藥物的臨床療效,是藥動學(xué)研究的一個(gè)重要方面. 但豬去氧膽酸是否能與白蛋白相互作用的研究尚未見報(bào)道.

為闡明豬去氧膽酸與白蛋白相互作用的特征, 本研究采用熒光光譜法探索豬去氧膽酸與牛血清白蛋白(BSA)熒光猝滅類型, 計(jì)算出兩者結(jié)合參數(shù), 確定了兩者結(jié)合的主要作用力類型. 研究結(jié)果可為探討豬去氧膽酸在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)、分配和代謝過程以及臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CARY Eclipse熒光分光光度計(jì)(美國, Varian公司), PHS-3D型PH計(jì)( 上海智光儀器儀表有限公司 ), HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司). 牛血清白蛋白(Roche, 含量98%), 豬去氧膽酸(四川正東制藥有限責(zé)任公司,含量95%), 三羥甲基氨基甲烷(Tris)(Bio-Rad, 含量99.9%). 除Tris為生化試劑外, 其余試劑均為分析純, 實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖溶液: 精密稱取NaCl及Tris 適量, 用去離子水配制成NaCl及Tris 濃度均為0.1 mol·L-1的溶液, HCl調(diào)節(jié)pH 7.4. 牛血清白蛋白(BSA)溶液: 精密稱取BSA適量, 用Tris緩沖溶液配成4.0×10-5mol·L-1儲備溶液. 豬去氧膽酸(HDCA)溶液: 精密稱取豬去氧膽酸適量, 用甲醇溶解配制成濃度為5.0×10-4mol·L-1的工作溶液.

1.2.2 熒光光譜法

系列容量瓶中各精密加入l mL 4.0×l0-5mol·L-1的BSA溶液, 依次加入0, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600 μL的5.0×10-4mol·L-1豬去氧膽酸工作溶液, 再加入0.1 mol·L-1Tris緩沖溶液定容至10 mL, 搖勻, 水浴(25℃或37℃)孵育20min, 測定熒光光譜. 固定激發(fā)波長為278nm, 測定290～500nm范圍內(nèi)的熒光光譜. 儀器測定溫度為25℃或37℃.

2 結(jié)果與討論

2.1 HDCA與BSA相互作用的熒光光譜變化

在激發(fā)波長為278nm時(shí), BSA結(jié)構(gòu)中的色氨酸殘基, 使其具有內(nèi)源性熒光, 發(fā)射波長在327nm左右(圖1A),而HDCA在此激發(fā)波長下熒光強(qiáng)度極弱(圖2B). 向一系列等量BSA溶液中分別加入不同量的HDCA溶液, 隨著加入量的增加(HDCA終濃度為0, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0×l0-7mol·L-1), BSA的內(nèi)源熒光逐漸降低(圖2), 最大發(fā)射峰的峰位略微發(fā)生藍(lán)移. HDCA使BSA發(fā)生熒光猝滅, 并呈現(xiàn)劑量依賴性, 說明兩者間產(chǎn)生了相互作用, 光譜的藍(lán)移現(xiàn)象可能是BSA結(jié)構(gòu)中的色氨酸的微環(huán)境發(fā)生了變化, 使其疏水性增強(qiáng)的結(jié)果[4-5].

圖1. BSA(A)和HDCA(B)的激發(fā)光譜及熒光光譜 a. 熒光波長=327nm時(shí)的激發(fā)光譜; b. 激發(fā)波長=278nm時(shí)的熒光光譜Fig.1 The excitation spectra and fluorescence spectra of the BSA (A) and HDCA (B). a. The excitation spectra at 327nm fluorescence ; b. The fluorescence emission spectra at 278nm excitation

2.2 HDCA對BSA的熒光猝滅類型

生物大分子的熒光猝滅可分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅 . 動態(tài)猝滅是由于熒光分子和猝滅劑之間的分子擴(kuò)散和碰撞引起的熒光強(qiáng)度減弱; 而靜態(tài)猝滅是由于兩者生成復(fù)合物而導(dǎo)致的熒光強(qiáng)度降低[6].

本文測定了常溫下(25℃)和正常生理溫度下(37℃), HDCA對BSA的熒光猝滅情況. 動態(tài)猝滅遵循Stem-volmer方程[7～9]:

F0和F分別表示猝滅劑(本文即HDCA濃度)不存在和存在時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度, [Q]是HDCA濃度, Kq為雙分子表觀動態(tài)猝滅速率常數(shù), Ksv為動態(tài)猝滅常數(shù), τo為猝滅劑不存在時(shí)生物大分子的平均熒光壽命(約為10-8s[7,9]). 將(F0/F-1)對[Q]作圖并進(jìn)行線性擬合(見圖3), 由直線的斜率可以求算出KSV, 進(jìn)一步求算出Kq(見表1):

計(jì)算結(jié)果顯示, 兩個(gè)溫度下HDCA對BSA的猝滅過程速率常數(shù)Kq遠(yuǎn)大于猝滅劑對生物大分子的最大碰撞猝滅速率常數(shù)2.0×1010mol-1·L·s-1[7,9], 說明HDCA對BSA的熒光猝滅不是動態(tài)猝滅, 而是靜態(tài)猝滅.

靜態(tài)猝滅可用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程[7,10]進(jìn)行描述:

F0、F 和[Q]意義同前, KLB為靜態(tài)猝滅過程中復(fù)合物的形成常數(shù). 應(yīng)用( F0- F)-1對[Q]-1作圖, 進(jìn)行曲線擬合可得到一條直線(見圖4), 由直線的斜率和截距求算KLB(表1).

圖2 不同濃度HDCA對BSA的熒光猝滅光譜 A. 25℃; B. 37℃Fig.2 quenching fluorescence spectra of BSA by HDCA A. 25℃; B. 37℃(CBSA: 4.0×l0-6mol·L-1; CHDCAfrom 1 to 9: 0, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0×l0-7mol·L-1)

表1 不同溫度條件下HDCA與BSA猝滅反應(yīng)參數(shù)Tab.1 quenching parameters of BSA reaction with HDCA at different temperatures

圖3. 不同溫度條件下HDCA對BSA熒光猝滅Stern-Volmer方程曲線Fig.3 Stern-Volmer piots of BSA fluorescence quenched by HDCA at different temperatures

圖4. 不同溫度條件下HDCA對BSA熒光猝滅Lineweaver-Burk方程曲線Fig.4 Lineweaver-Burk piots of BSA with HDCA at different temperatures

2.3 HDCA與BSA的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

靜態(tài)猝滅過程中的蛋白質(zhì)與藥物的結(jié)合常數(shù)(KA)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)可利用方程(3)計(jì)算[7,11]:

以lg(F0/F-1)對lg[Q]作圖后通過線性擬合可得到一條直線(見圖5), 根據(jù)直線的截距和斜率求得HDCA與BSA的KA和n, 結(jié)果見表1.

2.4 HDCA與BSA結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)性質(zhì)及作用力類型

有機(jī)小分子和蛋白質(zhì)生物大分子之間的結(jié)合力主要有疏水作用、力靜電作用力、范德華力、氫鍵作用等. 由以下熱力學(xué)參數(shù)關(guān)系式:

可以計(jì)算出HDCA與 BSA 相互作用的熱力學(xué)函數(shù)值, 結(jié)果見表2.

圖5. 不同溫度條件下HDCA對BSA熒光猝滅的雙倒數(shù)方程曲線Fig.5 Double logarithmic plots of BSA fluorescence quenched by HDCA at different temperatures

表2 不同溫度條件下熱力學(xué)參數(shù)Tab.2 The thermodynamic parameters at different temperatures

文獻(xiàn)報(bào)道[6,12]判斷生物大分子與有機(jī)小分子的結(jié)合性質(zhì)有一定的熱力學(xué)規(guī)律, 若ΔH>0, ΔS>0, 則表現(xiàn)為疏水作用力; 若ΔH<0, ΔS>0, 則表現(xiàn)為靜電作用力; 若ΔH<0, ΔS<0, 則表現(xiàn)為氫鍵和范德華力. 由表2結(jié)果可知, ΔH<0, ΔS<0, 表明HDCA與BSA之間的作用力主要為氫鍵和范德華力.

3 結(jié)論

本文采用熒光光譜法研究了豬去氧膽酸與牛血清白蛋白的相互作用關(guān)系. 結(jié)果表明, 豬去氧膽酸對牛血清白蛋白具有較強(qiáng)的熒光猝滅作用, 屬于靜態(tài)猝滅類型, 兩者之間主要以氫鍵和范德華力形成復(fù)合物, 因此豬去氧膽酸可被白蛋白貯存、運(yùn)載. 當(dāng)血漿蛋白含量受到一些生理、病理因素影響時(shí), 血中游離豬去氧膽酸的濃度變化很大, 將直接影響藥理作用強(qiáng)度, 此時(shí)應(yīng)合理調(diào)整用藥劑量.

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Study on interaction between hyodesoxycholic acid and bovine serum albumin

QIU Li-ying, YAN Ping, SHEN An-jing, LIU Hui,
(School of Chemistry and Environment Protection Engineering, Southwest University of Nationality, Chengdu 610041, P.R.C.)

Objective:To study the mechanism of interaction of Hyodesoxycholic acid (HDCA) and bovine serum albumin (BSA) by fluorescence spectroscopy.Method:At 25℃ and 37℃, quenching mechanism of the fluorescence of BSA was studied. Stern-volmer equation and Lineweaver-Burk double reciprocal equation were applied to determine the dynamic and static quenching constants. Double logarithmic equation was used to calculate the binding constants (KA) and the number of binding site (n). Thermodynamic equation was used to discuss the main binding force.Results:fluorescence quenching of BAS by HDCA belongs to static quenching type. At 25 ℃ and 37 ℃, the binding constants (KA) between HDCA and BSA were 0.258×106L·mol-1and 0.453×104L·mol-1, and the binding sites number (n) were 0.92 and 0.62, respectively. According to the thermodynamic parameters, enthalpy change (ΔH=-258.72 KJ·mol-1) and entropy change (ΔS=-0.76 J·mol-1·K-1), the interaction between HDCA and BSA was driven mainly by hydrogen bond and Van der Waals’ force.Conclusion:HDCA quenches the intrinsic fluorescence of BSA via static quenching mechanism, and the binding is mainly driven by hydrogen bond and Van der Waals’ force.

hyodesoxycholic acid; bovine serum albumin; fluorescence spectrometry; interaction

R917

A

1003-4271(2014)04-0504-05

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.04.06

2014-05-21

仇麗穎(1980-), 女, 漢族, 沈陽人, 講師, 博士, 研究方向: 生物藥物分析. E-mail: qiu7992@sina.com.