蘭道亮, 王永, 張誠民, 李鍵, 湯承

（1.西南民族大學青藏高原研究院, 四川 成都 610041; 2.西南民族大學生命科學與技術(shù)學院, 四川 成都 610041）

藏綿羊腸道乳酸菌的分離鑒定及系統(tǒng)進化分析

蘭道亮1, 王永1, 張誠民2, 李鍵1, 湯承2

（1.西南民族大學青藏高原研究院, 四川 成都 610041; 2.西南民族大學生命科學與技術(shù)學院, 四川 成都 610041）

為解藏綿羊腸道乳酸菌的菌群組成及其基本生物學特征, 無菌采集12頭健康藏綿羊新鮮糞便, 分離培養(yǎng)及純化乳酸菌株, 并通過16S rDNA 序列擴增和測序進行分子鑒定. 結(jié)果顯示: 從12個樣本中共分離純化出19株乳酸單菌,分屬于7個屬, 其中鶉雞腸球菌、海氏腸球菌、糞腸球菌及植物乳桿菌所占分離比例較多. 該結(jié)果為進一步了解藏綿羊腸道乳酸菌的菌群種類及藏綿羊益生菌制劑的開發(fā)提供了基礎(chǔ).

藏綿羊; 乳酸菌; 分離培養(yǎng); 16S rDNA

乳酸菌(Lactic acid bacteria, LAB)是指一類可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽性球菌或桿菌的統(tǒng)稱[1].目前LAB 已發(fā)現(xiàn)共有43個屬, 373個種和亞種, 其中常見的屬有乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、腸球菌屬(Enterooccus)、鏈球菌屬(Streptooccus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、片球菌屬(Pediococcus)等[2]. 作為動物體益生菌的重要成員, LAB 廣泛分布于動物體的口腔、泌尿生殖道及胃腸道內(nèi), 其中胃腸道中的LAB數(shù)量最為豐富, 且被證實具有排斥病原菌在腸壁的附著、抑制腐敗和有毒物質(zhì)的生成、分解毒物、降低膽固醇、調(diào)節(jié)機體免疫、促進排便及制造維生素等多種功能, 對人和畜禽的健康起著重要的保護作用[3-4], 同時也是微生態(tài)益生菌制劑研究的熱點菌種.

藏綿羊(Tibetan sheep)是我國三大原始綿羊品種之一, 長期繁衍生息在平均海拔3000米以上的青藏高原及其毗鄰的高寒牧區(qū), 其對空氣稀薄、嚴寒、牧草生長期短的高原惡劣生態(tài)環(huán)境具有良好的適應(yīng)能力, 并為當?shù)啬撩裉峁┲饕纳a(chǎn)生活資料, 是目前高原地區(qū)不可或缺的重要畜種之一[5-6]. 藏綿羊由于其獨特的生存環(huán)境及純天然飼養(yǎng)放牧方式, 是名符其實的無污染綠色食品. 然而由于受粗放式經(jīng)營管理的影響, 導致大多數(shù)高原地區(qū)的藏綿羊體格較小、體重下降、免疫力低下、疾病增多, 尤其是犢羊腹瀉疾病在高原牧區(qū)廣泛流行[7]. 盡管抗生素等藥物的使用在維持動物健康、治療個體疾病等方面發(fā)揮了重要的作用, 但其在疾病控制中所帶來的諸如耐藥性產(chǎn)生、有害殘留和環(huán)境污染等問題也越發(fā)受到關(guān)注[8]. 因此, 抗生素等藥物應(yīng)在藏綿羊養(yǎng)殖業(yè)中少用和慎用,而利用藏綿羊益生菌制劑代替抗生素將是解決以上問題的有效方法之一. 目前, 對藏綿羊腸道乳酸菌的分離鑒定及與其遺傳進化關(guān)系尚未見任何研究報道. 鑒于此, 本研究通過對藏綿羊腸道乳酸菌的分離鑒定及分子系統(tǒng)進化分析, 為進一步了解藏綿羊腸道乳酸菌的菌群組成及藏綿羊益生菌制劑的開發(fā)提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 樣品采集

自若爾蓋草原(平均海拔3500米, 東經(jīng)102°08′至103°39′、北緯32°56′至34°19′之間)隨機選取全天然放牧,健康, 生長發(fā)育正常的藏綿羊12頭, 無菌采集約2g新鮮糞便, 迅速臵于含有MRS液體培養(yǎng)基的試管中, 冷藏后送實驗室進行下一步分離.

1.2 菌株的分離與純化

將未稀釋的含糞便樣的液體培養(yǎng)基直接涂布于含2.5%CaCO3的MRS固體平板, 且經(jīng)30℃恒溫培養(yǎng)24h后再涂一次平板, 以確保原始菌群無損失. 將制備好的平板臵于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h左右, 定時觀察并記錄菌落特征, 挑取具有溶鈣圈, 形態(tài)較小的單個菌落進行革蘭氏染色鏡檢及初步生化反應(yīng). 選取革蘭氏染色呈陽性, 過氧化氫酶陰性的無芽孢桿菌、球菌均暫定為乳酸菌. 然后上述菌種再次接種于MRS液體培養(yǎng)基, 于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h左右, 重復幾次以純化分離的乳酸菌, 直至鏡檢結(jié)果為同一菌體形態(tài)后, 將其接種于MRS液體培養(yǎng)基中, 于30℃恒溫培養(yǎng)24h左右用以增菌, 最后進行甘油保種.

1.3 分離株16S rDNA 序列擴增

取對數(shù)期的菌液, 離心后收集菌體, 采用CTAB法提取菌株基因組DNA. 16S rDNA序列擴增引物采用本實驗室自行設(shè)計針對乳酸菌的通用引物: 16sTY3F-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG; 16sTY3R-GGCTACCTTGTTA CGACTT, 目的擴增片段1400bp左右. PCR反應(yīng)條件: 25 L的反應(yīng)體系中含基因組DNA200 ng、 dNTP 0.2mmol/L、正反向引物各1 mmol/L、 Mg2+1.5mmol/L、10PCRBuffer2.5 L、Taq酶2U, 94℃預變性5min后進入循環(huán): 94℃變性50s、 55℃退火45s 、72℃延伸90s, 30個循環(huán)后72℃延伸10min. 瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物的片段大小是否正確. 將檢驗正確的樣品進行膠回收, 并送測序公司(華大基因, 深圳)進行測序.

1.4 16S rDNA序列分析及遺傳進化樹的構(gòu)建

所得測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的16SrDNA序列進行相似性比較分析, 在分子水平確定分離菌株的種屬. 同時利用ClustalX2.0進行相關(guān)序列比對, 然后采用MEGA5.0軟件繪制N-J系統(tǒng)發(fā)育樹, 分析藏綿羊腸道乳酸菌的遺傳進化關(guān)系.

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

通過分離培養(yǎng)和純化, 我們從12個糞便樣本中共分離純化出19株單菌. 通過革蘭氏染色并鏡檢, 觀察到所分離的菌為革蘭氏陽性菌, 形態(tài)為球形或桿形, 呈單個成對或短鏈、長鏈狀排列, 無鞭毛無芽胞, 符合乳酸菌屬的基本形態(tài)特征.

2.2 16S rDNA序列擴增結(jié)果

對分離純化的乳酸菌株進行16S rDNA序列PCR擴增, 以進一步在分子水平確定分離菌的種屬. 擴增電泳檢測結(jié)果如圖1所示, 在1400bp處獲得特異性條帶, 與預期片段相符.

2.2 16S rDNA序列鑒定結(jié)果

進一步對分離純化出的19株單菌的16S rDNA序列測定表明, 此19株分屬于7個屬, 其中5株屬于鶉雞腸球菌,4株屬于海氏腸球菌, 4株屬于糞腸球菌, 3株屬于植物乳桿菌, 2株屬于巴氏鏈球菌, 1株屬于馬蹄鏈球菌(表1).

2.3 遺傳進化分析

參照序列比對結(jié)果, 從GenBank 中選取相關(guān)種屬模式菌株16S rDNA序列與各分離菌株序列進行遺傳進化樹的構(gòu)建, 結(jié)果如圖2顯示, 4株分離菌與海氏腸球菌聚為一類, 4株分離菌與糞腸球菌聚為一類, 5株分離菌與鶉雞腸球菌聚為一類, 3株分離菌與植物乳桿菌聚為一類, 2分離菌與巴氏鏈球菌聚為一類, 而剩余1株則與馬蹄鏈球菌聚為一個分支.此結(jié)果與序列比對鑒定結(jié)果相符, 進一步證明分離株所屬乳酸菌屬的正確性.

3 討論

藏綿羊作為我國三大原始綿羊品種之一, 長期繁衍生息在平均海拔3000米以上的青藏高原地區(qū),是目前高原地區(qū)分布最廣數(shù)量最多的畜種之一[5-6]. 然而由于粗放純天然的飼養(yǎng)放牧方式, 導致大多數(shù)高原地區(qū)的藏綿羊免疫力低下、易受疾病的侵襲, 特別是犢羊腹瀉疾病在高原牧區(qū)廣泛流行, 給藏綿羊養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失[7].盡管抗生素等藥物的使用在維持動物健康、治療個體疾病等方面發(fā)揮了重要的作用, 但其在疾病控制中所帶來的諸如耐藥性產(chǎn)生、有害殘留和環(huán)境污染等副作用也越發(fā)受到關(guān)注, 特別是對于無污染的青藏高原地區(qū)及綠色食品藏綿羊, 抗生素等藥物則更應(yīng)少用和慎用. 因此, 開發(fā)藏綿羊益生菌制劑顯得尤為重要.

圖1 16S rDNA 序列擴增電泳檢測結(jié)果Fig.1 The electrophoresis test result of 16S rDNA sequence amplification

表1 16S rDNA序列比對鑒定結(jié)果Tab.1 The identification result by alignment of 16S rDNA sequences

圖2 19株分離菌根據(jù)相關(guān)16S rDNA序列建立的遺傳進化樹Fig.2 The genetic evolutionary tree of 19 isolated bacteria strains in accordance with the 16S rDNA sequences

本實驗首次對藏綿羊腸道乳酸菌進行了分離鑒定, 結(jié)果表明鶉雞腸球菌、海氏腸球菌、糞腸球菌及植物乳桿菌在藏綿羊腸道乳酸菌中分離比例較多, 其中球菌種類比桿菌種類較為豐富. 鶉雞腸球菌是人、雞、豬等多種動物腸道中的正常菌群, 因首次在鶉雞的腸道中被分離出來而得名[9], 其產(chǎn)生的腸球菌素(enterocin)具有廣譜抑菌作用[10], 也可以通過黏附拮抗效應(yīng)有效維護宿主腸道健康. 但鶉雞腸球菌目前還尚未在羊?qū)賱游镏杏羞^研究報道, 本實驗首次證實鶉雞腸球菌在藏綿羊腸道中也廣泛存在. 海氏腸球菌與糞腸球菌廣泛存在于人和動物的糞便中, 是動物胃腸道正常菌群之一, 其生長代謝速度快, 能抑制有害菌繁殖, 促進動物消化機能, 是目前國內(nèi)外認可的飼用微生物[11-12], 此兩類菌群的分離鑒定說明這兩類菌也為藏綿羊腸道中的正常菌群之一. 除上述菌群外, 有趣的是我們發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌在藏綿羊腸道乳酸菌中也占有較高的分離比例, 植物乳桿菌是一種主要常見于奶油、肉類及許多蔬菜發(fā)酵制品中的乳酸菌, 能通過胃并定植于腸道發(fā)揮有益作用[13], 但在動物體內(nèi)并不常見, 而本實驗顯示藏綿羊腸道乳酸菌中的植物乳桿菌的分離比例較高, 但這是由于藏綿羊所食草類植物攜帶還是藏綿羊自身腸道具有, 還需進一步的實驗證明. 綜上研究結(jié)果為進一步了解藏綿羊腸道乳酸菌的菌群組成特征及藏綿羊益生菌制劑的開發(fā)奠定了基礎(chǔ).

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Isolation, identification and phylogenetic analysis of gut lactic acid bacteria from Tibetan sheep

LAN Dao-liang1, WANG Yong1, ZHANG Cheng-min2, LI Jian1, TANG Cheng2
(1.Institute of Qinghai-Tibetan Plateau Research, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.; 2.School of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.)

To understand the flora composition and their biological characteristics of gut lactic acid bacteria in Tibetan sheep, 12 stools from healthy Tibetan sheep were collected sterilely, then the isolation and purification of lactic acid bacteria were performed, and the molecular identification was further determined by the amplification and sequencing of 16S rDNA sequence. The result showed that the total of 19 strains of lactic acid bacteria belonging to 7 genera were isolated from 12 samples, in which the Enterococcus gallinarum, Enterococcus hirae, Enterococcus faecium, and Lactobacillus plantarum covered the advantage bacterium group. This study provides the basis for further understanding the gut lactic acid bacteria species in Tibetan sheep and value information for the development of probiotic preparations in Tibetan sheep.

Tibetan sheep; lactic acid bacteria; isolation; 16S rDNA

S858.26

A

1003-4271(2014)04-0481-04

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.04.01

2014-05-12

蘭道亮(1984-), 男, 畬族, 江西德興人, 副研究員, 博士, 研究方向: 胃腸道微生態(tài)、分子免疫學及動物功能基因組學.

湯承(1965-), 男, 教授, 博士, 研究方向: 病原微生物與分子免疫學; E-mail: tangcheng101@163.com.

國家科技支撐計劃課題(2012BAD13B06).