秦海斌 溫 海 賀星亮 陳 楊 張匯東

近幾年，伴隨著犬細小病毒(Canine parvovirus，CPV) 毒力、宿主嗜性(犬、貓)等生物學特性的變化，免疫犬感染不同亞型病毒的報告屢見不鮮，尤其在規(guī)?；畧鰞?nèi)，CPV的感染比例仍居高不下，一段時期內(nèi)甚至會出現(xiàn)急劇增高的趨勢，為調(diào)查這些異常的流行病學狀況，我們在本地區(qū)多個養(yǎng)殖場內(nèi)隨機選擇了514頭犬進行了抗體效價監(jiān)測，并結(jié)合其免疫日齡、疫苗種類等因素，從血清學角度分析了首免時間、疫苗品質(zhì)對免疫效果的影響，并對本地區(qū)的規(guī)?；B(yǎng)殖場的細小病毒免疫狀況進行了綜合分析，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

一、材料和方法

（一）主要材料

血凝抗原為犬細小病毒CPV-GN株，由公安部南京警犬研究所分子生物學實驗室分離、致弱、保存；F81細胞株，購自中科院上海細胞生物研究所，用于病毒株的傳代和培養(yǎng)；犬血清采集自南京地區(qū)多個規(guī)?；B(yǎng)殖場，供血犬至少用進口疫苗免疫過兩次，當年秋季免疫后采血分離，分裝保存于-20℃；豬紅細胞，采自6月齡健康長白豬，在阿氏液(Alsever’s)中4℃保存，實驗前以20倍量的0.2mol/L PBS洗滌3次，1000r/min離心10min后取紅細胞配成1%懸液備用。

（二）試驗方法

血凝/血凝抑制試驗:參照國標GB/T14926.53-2001與GB/T14926.54-2001進行。CPV-GN株病毒經(jīng)F81細胞株培養(yǎng)培養(yǎng)4天后收獲病毒，反復(fù)凍融3次后3000r/min離心30min去除細胞碎片，然后10000r/min離心30min，取上清液作為血凝抗原，血凝效價(HA)為29。犬血清在試驗前，以57℃恒溫震蕩30min滅活補體，然后用高嶺土處理血清去除非特異性凝集素。

為比較初免日齡對和不同商品化疫苗的免疫效果，隨機選擇24頭仔犬，分4組每組6頭，分別在35日齡、40日齡、45日齡、50日齡進行首次免疫，在28日后加強免疫一次，分別記錄第0、7、14、21、28、35、42天時的抗體效價，評價不同首免日齡的免疫效果。

選擇目前使用比較廣泛的商品化疫苗：W五聯(lián)（Ⅰ組）、IN二聯(lián)（Ⅱ組）、IN四聯(lián)（Ⅲ組）、H四聯(lián)苗（Ⅳ組）進行對比試驗，隨機挑選16頭仔犬分為四組，于45日齡進行首免，14天加強免疫，并自首免后的0、7、14、21、28、35、42天進行血清效價檢測，評價不同品牌疫苗的免疫效果。

在秋季免疫之后，隨機選擇不同犬場不同品種和年齡的犬共計514頭，采集靜脈血并分離血清， HA/HI試驗測定效價，總體評價犬群的免疫效果。

二、結(jié)果

（一）首免日齡的選擇

不同時間測定的血清效價數(shù)據(jù)以x±SE表示，用SPASS軟件進行Duncan’s方差分析和多重比較，顯著水平為P＜0.05。以45日齡首免作為參照組，在接種前D0，其他3組與參照組（45d）差異不顯著；D7天，50日齡免疫組效價顯著高于前兩組，與對照組（45d）無差異；D14天，前3組效價差異不明顯，但高于50日齡首免組；D21、D28,四組數(shù)據(jù)差異不明顯；D35天，參照組（45d）效價顯著高于其他組，其他組無差異；D42天，50日齡與參照組（45d）差異不顯著，但是明顯高于前兩組。綜合上述數(shù)據(jù)可以看出，以45日齡和50日齡作為首免時間，不同時期的效價明顯高于30和40日齡首免組，且50日齡組在加強免疫后效價高于參考組（45d），可作為最佳的首次免疫時間。

（二）疫苗種類的選擇

不同時間測定的血清效價數(shù)據(jù)以x±SE表示，用SPASS軟件進行Duncan’s方差分析和多重比較，顯著水平為P＜0.05。首免后7天（D7）進行第一次效價測定，Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ組效價升高但無顯著差異，Ⅲ組效價顯著低于其他組；D14天，Ⅱ、Ⅳ組效價顯著高于Ⅰ、Ⅲ組；D21天，加強免疫后Ⅰ、Ⅱ組抗體效價降低，Ⅲ、Ⅳ組效價升高；D28天，Ⅱ組效價顯著高于Ⅲ組，與Ⅰ、Ⅳ組差異不顯著；D35天，前三組效價無差異，第Ⅳ組效價明顯高于前三組；D42天，Ⅱ、Ⅳ組效價顯著高于Ⅰ、Ⅲ組。綜合上述不同時間的效價測定結(jié)果，可見Ⅱ組的免疫效果略優(yōu)于其他小組；另外，無論選用那種疫苗，在經(jīng)過二次加強免疫之后，抗體均能升高到保護效價之上，說明目前商品化疫苗的質(zhì)量優(yōu)良。

表1 幼犬不同首免日齡對CPV抗體效價（log2）的測量結(jié)果

表2 幼犬不同種類疫苗對CPV抗體效價（log2）的影響

（三）抗體監(jiān)測與評價

HA/HI結(jié)果顯示，514份樣本中，效價為27的樣本有2個，效價為28的樣本57個,效價為29的79個,效價為210的70個，效價為211的63個，效價為212的116個，效價為213的87個，效價為214的31個，效價為215的9個。最低效價27，最高效價215，加權(quán)感染CPV、首免后仔犬在免疫后窗口期內(nèi)發(fā)生CPV感染、個別二次免疫后的成年犬感染，排除疫苗質(zhì)量的因素，這與幼犬的母源抗體水平、疫苗首免后抗體的產(chǎn)生時間、加強免疫后抗體維持時間三個方面密切相關(guān)，因此，我們著重調(diào)查了疫苗的首免時間、疫苗種類對免疫效果的影響，并通過檢測514份血清的效價，總體評價了疫苗的免疫效果。數(shù)據(jù)顯示，現(xiàn)有商品化疫苗均能夠刺激犬體產(chǎn)生良好的體液免疫反應(yīng)；與現(xiàn)在常用的在45日齡首次免疫相比，在50日齡進行首次免疫效果更佳，證明幼犬體內(nèi)母源抗體維持時間較長，在45日齡時母源抗體仍能對初次免疫產(chǎn)生一定影響，從初次免疫前的幼犬進行的抗體效價檢測數(shù)據(jù)也可以得出相同的結(jié)論。另外， CPV感染只在HI低于1:80時發(fā)生，抗體高于1:160時犬有可能出現(xiàn)隱性帶毒而不表現(xiàn)明顯臨床癥狀；當效價高于1:640時能夠達到完全保護。本次對成年犬抗體平均效價為211.2。

表3 不同效價時的犬的數(shù)量

三、討論

過去30年，世界范圍內(nèi)的細小病毒雖然處于不斷進化之中，但其衣殼蛋白的主要抗原位點并未發(fā)生很大的變化。理論上講，不論哪種新毒株，現(xiàn)有的疫苗均可提供良好的保護力，而且不需要每年重復(fù)接種，數(shù)年后是否需要重復(fù)接種，則依賴于血清學檢測結(jié)果。但另一方面，疫苗免疫后的犬再次感染不同亞型病毒的病例也時有出現(xiàn)，歐洲以新型病毒株制造的疫苗已經(jīng)獲得許可，這說明無論在生產(chǎn)實踐還是在科學研究中，疫苗的保護效果并非高枕無憂，不斷進化的新型病毒必須依賴研發(fā)新的商品化疫苗進行防控。

我們對南京地區(qū)進行CPV血清學調(diào)查，是基于目前疫病防控中出現(xiàn)的一些異常狀況，例如未免疫幼犬整窩普查結(jié)果顯示，效價低于1:80的樣本數(shù)為零，低于1:160的樣本數(shù)為2，低于1:640的樣本數(shù)合計為138例，整體免疫合格率為100%，但仍有26.8%（138/514）的犬處于完全保護的抗體水平之下，存在一定的感染風險，尤其是新的亞型病毒出現(xiàn)之后，不同亞型病毒的交叉保護能力已經(jīng)發(fā)生了變化，感染風險也會逐漸增加。

另外，一種疫苗的保護力不可能達到100%的理想狀態(tài)，群體中個體免疫力差、免疫系統(tǒng)異常及其他免疫抑制因素都是存在的，這些因素均會造成一定比例的犬處于感染風險之中，通過合理的免疫程序、加強飼養(yǎng)管理、適時監(jiān)測抗體效價等方式對于提高犬群的整體免疫防控效果具有很好的作用。