馬曉建 張霞，2 常春

(1.鄭州大學化工與能源學院，河南鄭州450001;2.華北水利水電大學環(huán)境科學與工程研究所，河南鄭州450011)

丁醇不僅是一種重要的有機溶劑和化工原料［1］，還是一種新型的極具潛力的生物燃料.其熱值遠高于乙醇(與汽油相當)，腐蝕性小，蒸氣壓低，能與汽油以任意比互摻使用［2-5］.丙酮丁醇發(fā)酵是一項傳統(tǒng)的大宗發(fā)酵［6］，我國在建國初期已經以玉米淀粉為原料進行穩(wěn)定的丁醇工業(yè)化生產.隨著石化資源的耗竭、糧油的短缺以及溫室效應等環(huán)境問題的日益突出，利用可再生資源、農業(yè)廢棄物等生產化工原料和能源物質越來越受到重視［7］.

利用木質纖維素等生物質發(fā)酵丁醇已成為當前研究的一個熱點［8-12］.菌種、原料、原料預處理方式以及發(fā)酵條件等均會對溶劑產量產生顯著的影響.利用丙酮丁醇梭菌ATCC824(Clostridium acetobutylicum ATCC824)發(fā)酵糖楓樹水解液生產丁醇，丁醇濃度可達到7 g/L［10］.利用拜氏梭菌P260(Clostridium beijerinckii P260)對大麥和小麥秸稈的稀酸水解液進行發(fā)酵后，大麥秸稈水解液中的ABE(Acetone，Butanol，Ethanol)生成率僅為0.1 g/(L·h)，而小麥秸稈水解液中的生成率可達到0.6 g/(L·h)，但是大麥稈水解液經過Ca(OH)2脫毒并添加葡萄糖(葡萄糖濃度15.1 g/L)后，丁醇濃度可達17g/L［9］.丙酮丁醇梭菌 CICC8016(Clostridium acetobutylicum CICC8016)發(fā)酵玉米秸稈水解液，丁醇濃度為4.54g/L［13］.通過響應面法優(yōu)化丙酮丁醇梭菌CICC8008(Clostridium acetobutylicum CICC8008)發(fā)酵經氨水預處理的玉米秸稈生產丁醇的條件，丁醇濃度可以達到6.2g/L［14］.

水蒸氣爆破法是將生物質經高溫高壓水蒸氣處理一定時間，然后瞬間泄壓，從而實現(xiàn)原料組分的化學分離、機械分裂和結構重排［15］.文中以水蒸氣爆破的玉米秸稈酶解液為發(fā)酵原料，選擇適合水蒸氣爆破玉米秸稈酶解液發(fā)酵生產高濃度丁醇的菌種，優(yōu)化發(fā)酵條件，并嘗試少量加入煙酰胺，考察其對丁醇產量的影響，為合理利用農業(yè)廢棄物生產可再生能源、增加丁醇產量提供試驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

丙酮丁醇梭菌zzu-02(Clostridium acetobutylicum zzu-02)由鄭州大學化工與能源學院生物化工實驗室培養(yǎng)與優(yōu)化，在玉米醪(玉米淀粉與去離子水的質量比為1∶20，下同)中培養(yǎng)成孢子，4℃保存.

拜氏梭菌zzu-01(Clostridium beijerinckii zzu-01)由鄭州大學化工與能源學院生物化工實驗室保存，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)成孢子，4℃保存.

1.1.2 實驗原料

玉米秸稈，取樣于河南省南陽市郊區(qū)試驗田(長50m，寬80 m)，將水蒸氣通入密閉的放有自然風干的玉米秸稈(莖稈切成1～3cm的小塊)的汽爆罐，迅速升高罐壓至1.5MPa，5min后，迅速降壓，制得汽爆玉米秸稈(纖維素含量32.3%，半纖維素含量16.0%)，備用.

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

丙酮丁醇梭菌zzu-02種子培養(yǎng)基:市售玉米淀粉直接高壓滅菌(0.1MPa，121℃，15 min)，pH= 6.3，使用去離子水配制成玉米淀粉與去離子水質量比為1∶20的玉米醪.

拜氏梭菌zzu-01種子培養(yǎng)基:牛肉胰酶消化液500.0mL，牛肉浸液500.0mL，氯化鈉5.0g，葡萄糖5.0g，瓊脂1g，硫乙醇酸鈉0.5g，碎肉渣10g，pH= 7.2～7.4.

發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母抽提物0.8 g，磷酸二氫鉀0.5g，乙酸胺6 g，煙酰胺0.25 g，秸稈酶解液1 L，pH=6.3.

1.2.2 種子液的制備

取保存于冰箱中的丙酮丁醇梭菌zzu-02孢子，接種到玉米醪培養(yǎng)基中(接種后丙酮丁醇梭菌zzu-02孢子液體積分數(shù)為6%)，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)25h.

取保存于冰箱中的拜氏梭菌zzu-01孢子，接種到種子培養(yǎng)基中(接種后拜氏梭菌zzu-01孢子液體積分數(shù)為6%)，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)28h.

1.2.3 菌株的篩選

將兩種不同的菌種分別接種于篩選的培養(yǎng)基中，待發(fā)酵結束時檢測丁醇產量，丁醇產量高的菌株被選為實驗用菌株.

1.2.4 丁醇發(fā)酵的優(yōu)化

由于秸稈的主要成分是纖維素、半纖維素和木質素，經酶解后酶解液上清液的主要成分是糖，添加一些供菌體生長的營養(yǎng)成分，才能使菌體正常生長發(fā)酵.文中除了考察菌種、初始pH值，酶解液糖濃度對丁醇產量的影響，還通過正交試驗考察為菌體生長提供營養(yǎng)元素的乙酸銨(A)、酵母膏(B)、磷酸二氫鉀(C)和煙酰胺(D)對丁醇產量的影響，采用L9(34)正交設計表設計試驗，試驗重復3次.正交試驗因素水平如表1所示.

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.5 水蒸氣爆破玉米秸稈酶解液發(fā)酵

將300mL的發(fā)酵培養(yǎng)基裝在500 mL的三角瓶里，制備好的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中(接種后種子液的體積分數(shù)為6%)，38℃恒溫培養(yǎng)70h.

1.3 分析方法

1.3.1 還原糖含量測定

參照文獻［16-17］中的 DNS法測定還原糖含量.

1.3.2 丁醇含量測定

在上海析默分析儀器有限公司生產的GC7980型氣相色譜儀上用氣相色譜法測定丁醇含量.采用毛細管色譜柱，進樣口溫度220℃，F(xiàn)ID溫度230℃，柱溫70℃，運行時間6min;程序不升溫，不分流，進樣量1μL;H2流速30mL/min，空氣流速300mL/min，內標物為異丁醇.

1.3.3 轉化率計算

丁醇和總溶劑(丙酮、丁醇和乙醇)的轉化率按下式計算:

式中，丁醇產量、總糖和殘?zhí)呛繂挝痪鶠間/L.

2 結果與分析

2.1 菌株篩選結果

溶劑的主要成分是丁醇，因此菌株篩選的主要依據(jù)是丁醇的產量.通過分析發(fā)酵后丁醇的產量發(fā)現(xiàn)，丙酮丁醇梭菌zzu-02和拜氏梭菌zzu-01發(fā)酵還原糖含量為52 g/L的水蒸氣爆破玉米秸稈酶解液時，丁醇產量分別為6.925、5.238 g/L，丙酮丁醇梭菌的丁醇產量明顯高于拜氏梭菌，原因可能是高濃度的碳源對拜氏梭菌有明顯的抑制作用［18］.因此優(yōu)選丙酮丁醇梭菌zzu-02作為試驗用菌株.

2.2 酶解液糖含量對溶劑產量的影響

丁醇生產中的一個重要影響因素是生產強度.要提高生產強度，需在產物不抑制和產率不下降的情況下，盡可能提高發(fā)酵液中的糖含量.汽爆玉米秸稈與去離子水的質量比為3∶20的混合液經酶解后，離心，取其上清，糖含量為57.5g/L，糖含量較低.發(fā)酵后殘?zhí)呛康?，說明發(fā)酵液中的糖基本用完.為提高糖含量，嘗試將秸稈酶解上清液，分別濃縮至原液的75% (質量分數(shù)，余同)、67%和50%，濃縮后糖含量分別達到76.7、86.3和115.0g/L.不同濃縮液經發(fā)酵后的溶劑產量如圖1所示.不同濃縮度的濃縮液發(fā)酵前后的還原糖含量如表2所示.

由圖1可見:不同濃縮液經發(fā)醇后，丁醇產量和總溶劑產量差異較大;酶解原液丁醇產量和總溶劑濃度最高;酶解上清原液濃縮度越大，丁醇和總溶劑的產量越小.

同時，由表2可見，酶解上清原液濃縮度越大，發(fā)酵時被消耗的糖越少.這說明汽爆玉米秸稈酶解后，有抑制菌種生長的物質存在.隨著濃縮液濃度的提高，雖然糖含量提高了，但抑制物的含量也提高了，所以當酶解上清液質量濃縮到原液的50%時，發(fā)醇后丁醇的產量僅為1.13 g/L.故要想進一步提高生產強度，首先要做好秸稈酶解前的預處理.酶解過程中抑制丁醇生成的物質主要是甲酸和糠醛等，酶解前通過水洗預處理秸稈降低甲酸和糠醛的含量，可提高丁醇產量.

圖1 不同濃縮液經發(fā)酵后的溶劑產量Fig.1 Solvent yield of fermentated liquid with different concentrations

表2 不同濃縮度的濃縮液發(fā)酵前后的還原糖含量Table 2 Reducing sugar concentrations before and after fermentation of concentrated liquid with different concentration ratios

2.3 初始pH值及菌液接種量對溶劑產量的影響

影響丁醇產量的另一個關鍵因素是初始pH值，過低的初始pH值不利于菌體生長.普通的分批發(fā)酵分為產酸期和產溶劑期，當pH值降到一定值時，發(fā)酵液才會開始產生溶劑.所以過高的初始pH值不利于溶劑的生成.隨菌種發(fā)酵原料和發(fā)酵條件的不同，誘導溶劑產生的pH值范圍也有所不同.經脫毒后的水蒸氣爆破玉米秸稈酶解液的pH值范圍為5.95±0.05，通過氨水調節(jié)pH值，考察水蒸氣爆破玉米秸稈發(fā)酵時獲得最高丁醇產率的最適初始pH值.研究了初始pH值為5.9～7.0的水蒸氣爆破玉米秸稈的發(fā)酵情況，結果如圖2所示.由圖2可見，在這個范圍內，丁醇產量相差不大，初始pH值為6.3時丁醇產量略高一些.

圖2 初始pH值對丁醇產量的影響Fig.2 Effects of initial pH value on butanol yield

菌液接種量(接種后菌液的體積分數(shù))對丁醇產量也有一定的影響，不同接種量下的丁醇產量如圖3所示.由圖3可見，丁醇產量隨著接種量的增大逐漸增加，接種量增加到6%后，丁醇產量趨于穩(wěn)定，因此選擇6%作為發(fā)酵接種量.

圖3 菌液接種量對丁醇產量的影響Fig.3 Effects of microbial inoculation quantity on butanol yield

2.4 營養(yǎng)元素添加量對丁醇產量的影響

不同的營養(yǎng)元素添加量下，酶解液中丁醇的產量如表3所示.

表3 L9(34)正交試驗結果Table 3 Results of L9(34)orthogonal test

由表3所示結果可知，各因素對丁醇產量的影響程度為:A＞C＞B＞D，其中乙酸銨對丁醇產量影響最大.分析發(fā)現(xiàn)，A2B3C1D2為最佳方案，該條件下酶解液中丁醇濃度為9.726g/L.

以Clostridium beijerinckii為菌種、酵母膏為菌體營養(yǎng)成分時，小麥稈水解液中溶劑生成率可以達到0.6g/(L·h)［19］.酵母膏也適合于丙酮丁醇梭菌zzu-02對水蒸氣爆破玉米秸稈的發(fā)酵.添加乙酸銨，不僅為丙酮丁醇梭菌在秸稈酶解液中的生長提供了氮源，而且乙酸是ABE發(fā)酵中重要的化合物，與產酸過程和產溶劑過程中酶的有效表達有關系［20］，所以適量的乙酸胺有利于發(fā)酵，可提高丁醇產量和糖的利用率.微量營養(yǎng)元素中，K+是細胞生長必需的，當K+濃度為零時，發(fā)酵不產生溶劑，只能產酸，隨著K+濃度增大，溶劑產量也增大，但是當K+濃度增加到一定值時，溶劑產量保持不變，不會再增加［21］，所以適量的磷酸二氫鉀不僅提供了磷源，也提供了K+，有利于提高溶劑產量.

煙酰胺是形成輔酶NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)和輔酶NADP(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)的組成成分，二者是各種脫氫酶的輔酶.這兩種輔酶結構中的煙酰胺部分具有可逆的加氫與脫氫特性，在許多生物氧化、還原反應中起傳遞電子和質子的作用［22］.丁醇的代謝途徑中，從乙酰輔酶A到丁醇的過程中，伴隨著氧化還原反應，有4種脫氫酶(3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶、丁酰輔酶A脫氫酶、丁醛脫氫酶、丁醇脫氫酶)的參與，所以少量煙酰胺能促進代謝，有助于丁醇的生成.

2.5 優(yōu)化條件試驗結果的驗證

在最佳的發(fā)酵條件下，將水蒸氣爆破玉米秸稈與其他幾種糖原料(玉米淀粉、米糠酶解液和葡萄糖)發(fā)酵后的溶劑產量進行了比較，從而檢驗最佳發(fā)酵條件的可靠性，結果如表4所示.

表4 不同原料經Clostridium acetobutylicum zzu-02發(fā)酵后的溶劑產量Table 4 Solvent yield from different raw materials fermented by Clostridium acetobutylicum zzu-02

由表4可見，丙酮丁醇梭菌zzu-02發(fā)酵水蒸氣爆破玉米秸稈、米糠酶解液、玉米淀粉，丁醇產量都在10g/L左右，水蒸氣爆破玉米秸稈生產丁醇的產量僅次于玉米淀粉，略高于米糠.該結果說明優(yōu)化后的條件適合于Clostridium acetobutylicum zzu-02發(fā)酵水蒸氣爆破玉米秸稈生產丁醇.

3 結論與展望

文中篩選出了一株能發(fā)酵水蒸氣爆破玉米秸稈而且丁醇產量高的菌株 Clostridium acetobutylicum zzu-02，經過優(yōu)化與檢驗，確定了該菌株發(fā)酵水蒸氣爆破玉米秸稈生產丁醇的最佳條件如下:水蒸氣爆玉米秸稈酶解液糖含量57.5 g/L、初始pH值6.3，發(fā)酵液接種量6%，發(fā)酵溫度37℃，酵母膏、乙酸銨、磷酸二氫鉀、煙酰胺的添加量分別為0.8、6.0、0.5、0.25g/L，該條件下丁醇產量達到9.726g/L.根據(jù)丁醇的代謝途徑，加入少量煙酰胺能有效促進丁醇的生成.以玉米秸稈為原料生產丁醇，這對農業(yè)廢棄物再利用、農民增收以及提供清潔能源具有多重意義.但與糧食、木薯、菊竽相比，秸稈在酶解后，酶解液中還原性糖的濃度偏低，需要進一步提高，秸稈酶解前的脫毒技術也待繼續(xù)深入.圍繞提高發(fā)酵終點總溶劑中的丁醇比例及丁醇濃度，仍需要開展大量的研究工作.

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