史立君,王 靖,滕紅林,李 馳,朱旻宇

椎間盤內紊亂(internal disc disruption，IDD)是椎間盤內的病理改變，而椎間盤的外形沒有或僅有極小的改變，其作為椎間盤退變的主要過程，能引起盤源性腰痛。凋亡參與椎間盤退變過程并在此過程中起關鍵作用，抑制凋亡可能成為將來椎間盤退變性疾病的治療方法之一[1]。目前已有研究證明芍藥苷具有抑制Fas、Caspase-3、Caspase-8等的表達水平，降低纖維環(huán)細胞的凋亡率[2]。但芍藥苷在IDD發(fā)生的過程中，是否干預Fas介導的凋亡通路，影響髓核細胞的凋亡，減輕或延緩椎間盤退變，尚未明確。

本項動物實驗建立一個兔IDD模型，用中藥提取物芍藥苷對其進行干預，并將其與正常對照組進行比較研究，通過檢測多項相關指標，并進行統(tǒng)計學分析，以期能通過動物實驗闡明芍藥苷在兔IDD模型中的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

新西蘭大白兔96只，雌雄不限，體重(3.0±0.5) kg，由浙江省醫(yī)學科學院動物實驗中心提供，許可證號：SYXK(浙)2008-0114。

1.2 主要儀器

石蠟切片機(德國，LAICA)；OLYMPUS BH-2光學顯微鏡(日本，OLYMPUS)；OLYMPUS C5060攝像機(日本，OLYMPUS)；ZHJH-1214超凈臺(蘇州凈化儀器廠)；TGL-16C臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；Beckman Coulter流式細胞儀(美國，BECKMAN COULTER)。

1.3 主要試劑與藥物

SABC免疫組化染色試劑盒(福建，邁新)；Fas、FasL抗體(Abnova)；Caspase-8抗體(BioVision)。芍藥苷(寧波立華制藥有限公司，產品批號：國藥準字H20055058)。

1.4 造模與分組給藥

隨機分為4組，每組24只。其中3組行纖維環(huán)穿刺造模，造模后各組分別采用芍藥苷每日高劑量120 mg/kg、低劑量30 mg/kg及生理鹽水灌胃治療，正常對照組采用生理鹽水灌胃，分籠常規(guī)飼養(yǎng)。

1.5 取材與指標檢測

分別在術后的3周、6周和10周將各組大白兔處死取材，每組每個時間點8只，離斷腰椎，分離椎間盤。

組織在石蠟切片機上切片，片厚3～4 μm。組織片在展片機上展開后，貼于預先涂布10%多聚賴氨酸的載玻片上，貼好的切片在烤片機上63℃烘烤8 h，以利于組織牢固地貼在載玻片上。貼片經上述處理后，室溫防塵保存待染色。

流式細胞法觀察髓核細胞的凋亡情況。

免疫組化法檢測治療前后椎間盤組織中Fas、FasL、Caspase-8的表達。

1.6 組織學與免疫組化結果判斷

光鏡下觀察髓核組織變化情況。免疫組化染色所得結果由2名病理科醫(yī)師計數10個高倍鏡(×400)下的細胞總數及FasL、Fas與Caspase-8陽性細胞數，取兩者的平均值。最后求出陽性細胞的百分比。

1.7 統(tǒng)計學方法

所得數據均采用運SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件，行方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 Fas及FasL的陽性表達

3、6、10周時，各造模組的Fas及FasL表達均高于正常對照組(P<0.05)。低、高劑量組的Fas及FasL表達均低于生理鹽水組(P<0.05)。而低、高劑量組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表1,2)。

2.2 Caspase-8的表達

3、6、10周時，各造模組的Caspase-8表達均高于正常對照組(P<0.05)。3周時，低、高劑量組與生理鹽水組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；6、10周時，低、高劑量組的Caspase-8陽性細胞率均低于生理鹽水組(P<0.05)。而3、6、10周時，低、高劑量組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表3)。

表1 芍藥苷對Fas表達的影響Tab.1 Effect of paeoniflorin on the expression of Fas protein

表2 芍藥苷對FasL表達的影響Tab.2 Effect of paeoniflorin on the expression of FasL protein

表3 芍藥苷對Caspase-8表達的影響Tab.3 Effect of paeoniflorin on the expression of Caspase-8

2.3 細胞凋亡率

3、6、10周時，各造模組平均凋亡指數均高于正常對照組(P<0.05)；同時，低、高劑量組平均凋亡指數均低于生理鹽水組(P<0.05)，而兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表4)。

3 討 論

IDD是椎間盤內的病理改變，而椎間盤的外形沒有或僅有極小的改變，其作為椎間盤退變的主要過程，能引起盤源性腰痛。Crock[3]首先提出椎間盤內部結構的病變導致椎間盤源性疼痛的理論。凋亡是導致IDD發(fā)生的潛在機制。Gruber等[4]對手術取出的腰椎椎間盤進行細胞凋亡檢測，發(fā)現在退變的椎間盤標本中，椎間盤細胞的凋亡率高達53%～73%。

目前，Fas對髓核細胞的促凋亡作用已獲得共識。Fas/FasL信號途徑則通過一系列作用使Caspase-8寡聚化，自身裂解而活化Caspase-8，然后激活下游的Caspase-3導致細胞凋亡[5-6]。呂存賢等[7]通過對兔腰椎椎間盤退變模型中Fas/FasL基因表達的研究，發(fā)現Fas/FasL基因的過度表達是導致髓核細胞凋亡的主要因素之一。腰椎椎間盤在該基因過度表達的情況下可能導致超常的凋亡，最終導致椎間盤退變甚或突出。另有研究證實，在正常髓核中FasL與椎間盤免疫豁免機制有關，而髓核組織的免疫豁免效應是由生理學屏障與FasL共同維持的，當這一屏障受損時，髓核組織會與機體免疫系統(tǒng)接觸，FasL表達水平升高，髓核細胞凋亡增加，激發(fā)炎癥反應[8]。FasL能夠誘導白細胞介素-1b[9]及直接上調多種趨化因子的表達[10]。

表4 各組平均凋亡指數Tab.4 Apoptosis index of each group

有研究表明，椎間盤細胞在Fas蛋白表達較高的情況下，可進行超常的凋亡，體內外的諸多因素均可通過上調Fas的表達[11]，增強Fas /FasL 系統(tǒng)途徑介導的凋亡效應而產生超常的凋亡作用。

本研究在成功構建了兔IDD模型后，經芍藥苷干預的造模組，其Fas、FasL、Caspase-8的陽性表達率明顯低于未經芍藥苷干預的組別。通過檢測凋亡率發(fā)現各造模組平均凋亡指數均高于正常對照組(P<0.05)；同時，低、高劑量組平均凋亡指數低于生理鹽水組(P<0.05)。因此認為芍藥苷可以抑制Fas表達，進而抑制Caspase-8的激活，最終起到抑制髓核細胞凋亡的作用(死亡受體介導的信號傳導途徑)，上述研究為芍藥苷治療IDD提供了實驗依據。

參考文獻

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[4] Gruber HE, Hanley EN Jr. Analysis of aging and degeneration of the human intervertebral disc. Comparison of surgical specimens with normal controls[J]. Spine (Phila Pa 1976),1998, 23(7):751-757.

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[9] Miwa K, Asano M, Horai R, et al. Caspase 1-independent IL-1beta release and inflammation induced by the apoptosis inducer Fas ligand[J]. Nat Med, 1998, 4(11):1287-1292.

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