張峻山，王自立，施建黨，劉海濤，肖慧霞，牛寧奎

由于復合抗結(jié)核藥物的人工緩釋材料置入病灶清除術(shù)后的骨缺損部位之后既能提高脊柱結(jié)核病變部位的藥物濃度，又能充填骨缺損、完成病變部位的修復重建，近年在脊柱結(jié)核治療的研究中頗受關(guān)注。硫酸鈣/氨基酸聚合物因其具有較高的組織相容性、緩釋性能、成骨效果、無毒副作用而被廣泛應(yīng)用并取得了良好的臨床效果[1-2]。然而該人工材料復合抗結(jié)核藥物之后在病灶局部的抗結(jié)核效果到底如何目前尚未見報道。本研究復合三聯(lián)抗結(jié)核藥異煙肼(isonicotinyl hydrazide，INH)、利福平(rifampin，RFP)、吡嗪酰胺(pyrazinamide， PZA)硫酸鈣/氨基酸聚合物人工緩釋材料，采用BacT/ALERT 3D全自動結(jié)核分支桿菌快速培養(yǎng)系統(tǒng)，對載藥人工緩釋材料不同時間點浸提液與標準結(jié)核分枝桿菌共同培養(yǎng)并檢測，評價該載藥人工緩釋材料的體外抗結(jié)核性能。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

INH、RFP、PZA標準品(純度分別為99.5%、95.2%、99.5%，北京中科三捷公司)，硫酸鈣、聚氨基酸(四川國納科技有限公司)，標準結(jié)核分枝桿菌H37Rv(國家菌種保藏中心)，BacT/ALERT 3D全自動結(jié)核分支桿菌快速培養(yǎng)系統(tǒng)(法國梅里埃公司)，電子分析天平(梅特勒-托利爾儀器有限公司)，D-2000高效液相色譜儀(日本日立公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 載藥及未載藥人工緩釋材料的制備

按口服給藥劑量得出3種抗結(jié)核藥的比值及載藥人工緩釋材料力學性能檢測結(jié)果，按45∶5∶1∶1∶3的比例，分別稱取硫酸鈣0.45 g、氨基酸0.05 g、INH 0.01 g、RFP 0.01 g、PZA 0.03 g，制作載三聯(lián)抗結(jié)核藥硫酸鈣/聚氨基酸人工緩釋材料[3]。未載藥緩釋材料制作過程同上(見圖1)。

1.2.2 模擬體液的制備

取700 mL蒸餾水置于1 000 mL的塑料燒杯，緩慢攪拌，將水溫調(diào)至36.5°C。分別稱取一定質(zhì)量

圖1人工緩釋材料

Fig.1Artificial release material

的藥品，按照順序逐一加入燒杯中(見表1)，攪拌至藥品完全溶解，調(diào)節(jié)pH接近7.45。將配好的模擬體液轉(zhuǎn)移入1 000 mL定容瓶，待溶液溫度降至20°C時，定容后既得模擬體液。

表1 模擬體液中加入化學物質(zhì)的量

1.2.3 載藥及未載藥人工緩釋材料浸提液的制備及濃度檢測

取模擬體液10 mL加入15 mL EP管中，然后分別加入1.2.1項中制備的載藥與未載藥人工緩釋材料，采取避光措施后加入恒溫振蕩器中。分別于第4周、第8周、第12周取其浸提液，每取5 mL浸提液回補同樣體積。將所取得浸提液1 mL用濾器過濾后加入新的EP管中，置入-24℃環(huán)境中保存，待用。應(yīng)用高效液相色譜(high performance liquid chromatography , HPLC)法檢測剩余浸提液中INH、RFP、PZA濃度。采用色譜條件：CN(5 μm)，250 mm×4.6 mm色譜柱；流動相采用0.01 mol/L庚烷磺酸鈉(pH=2.2)，甲醇∶乙腈=55∶44；檢測波長270 nm；進樣體積10 μL。

1.2.4 實驗分組

實驗分為A、B、C 3組，A組為實驗組、B組為實驗對照組、C組為空白對照組。A組為第4、8、12周采集的載藥人工緩釋材料浸提液，分為3個亞組：4周組(A4W)、8周組(A8W)、12周組(A12W)，每個亞組20個樣本。B組為第4、8、12周采集的未載藥人工緩釋材料浸提液，分為3個亞組：4周組(B4W)、8周組(B8W)、12周組(B12W)，每個亞組20個樣本。C組為等量蒸餾水，分為C4W、C8W、C12W3個亞組，每個亞組均為20個樣本。

1.2.5 標準結(jié)核分枝桿菌的增殖培養(yǎng)

將標準結(jié)核分枝桿菌接種至L-J培養(yǎng)基培養(yǎng)。對通過培養(yǎng)所得菌落行抗酸染色涂片，按要求觀察300個視野尋找抗酸陽性結(jié)核桿菌。培養(yǎng)陽性者均以鑒別培養(yǎng)基對其菌種進行鑒定，將非結(jié)核分枝桿菌除外。

1.2.6 BacT/ALERT 3D系統(tǒng)培養(yǎng)

將A、B組浸提液及C組蒸餾水各1 mL分別加入BacT/ALERT 3D系統(tǒng)培養(yǎng)瓶，并加入0.5 mL營養(yǎng)液及100 μL結(jié)核菌液(1 mg/mL)，置入BacT/ALERT 3D系統(tǒng)培養(yǎng)，期間觀察結(jié)果，最終培養(yǎng)至第6周，全程嚴格無菌操作。

1.3 結(jié)果觀察方法

觀察培養(yǎng)瓶底部的CO2變色指示劑顏色變化，若指示劑顏色由綠色變?yōu)辄S色，則結(jié)果為陽性，表示培養(yǎng)瓶內(nèi)有細菌生長。若指示劑顏色無變化則結(jié)果為陰性，培養(yǎng)瓶中無細菌生長，記錄培養(yǎng)結(jié)果(見圖2)。

1.4 統(tǒng)計學方法

所統(tǒng)計數(shù)據(jù)均采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件處理，2組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 載藥人工緩釋材料體外緩釋藥物濃度

應(yīng)用HPLC法檢測載藥人工緩釋材料藥物濃，可見載藥人工緩釋材料第4周浸提液中INH、RFP、PZA濃度均高于其最低殺菌濃度。第8周載藥人工緩釋材料浸提液中INH、RFP仍顯著高于其最低殺菌濃度，然而PZA雖然高于其最低殺菌濃度，但是差距不大。第12周載藥人工緩釋材料浸提液中INH濃度高于其最低殺菌濃度，PZA濃度明顯低于其最低殺菌濃度，RFP濃度已測不到(見表2，圖3)。

a： 培養(yǎng)瓶底部顏色未見變化 b： 培養(yǎng)瓶底部由綠色變?yōu)辄S色

a： No significant changes in colour were observed at bottom of flasks b： Colour changes from green to yellow at bottom of flasks

圖2經(jīng)BacT/ALERT 3D系統(tǒng)培養(yǎng)后陽性與陰性結(jié)果對比

Fig.2Contrast of positive and negative results after cultured by BacT / ALERT 3D fast training instrument

表2載藥人工緩釋材料浸提液抗結(jié)核藥物濃度值

Tab.2Extracts concentration of calcium sulfate/ poly amino acids artificial release material compounded triple anti- tuberculosis drugs μg/mL，n=20

圖3載藥人工緩釋材料浸提液藥物濃度曲線

Fig.3Extracts concentration curve of calcium sulfate/poly amino acids artificial release material compounded triple anti-tuberculosis drugs

2.2 經(jīng)過BacT/ALERT 3D系統(tǒng)培養(yǎng)后各組陽性率及統(tǒng)計學結(jié)果

各組第4周、第8周、第12周的浸提液在BacT/ALERT 3D系統(tǒng)內(nèi)培養(yǎng)3周后陽性結(jié)果分別

為：A4W15%(3組)、A8W25%(5組)、A12W55%(11組)； B4W80%(16組)、B8W85%(17組)、B12W80%(16組)； C4W90%(18組)、C8W95%(19組)、C12W90%(18組)。繼續(xù)觀察至第6周，傳感器顏色始終沒有變化。

A、B各亞組對應(yīng)時間點比較P<0.05，2組間差異有統(tǒng)計學意義，說明載藥人工緩釋材料對結(jié)核桿菌具有殺菌作用。B、C各亞組對應(yīng)時間點比較P>0.05，2組之間差異無統(tǒng)計學意義，說明未載藥人工緩釋材料對結(jié)核桿菌生長無影響。

A組中，第4周、第8周、第12周浸提液培養(yǎng)陽性率分別為15%、25%、55%，說明載三聯(lián)抗結(jié)核藥人工緩釋材料隨時間的延長殺菌作用逐漸減弱。

3 討 論

抗結(jié)核藥物的濃度對殺滅結(jié)核分枝桿菌有著至關(guān)重要的作用，抗結(jié)核緩釋藥物可明顯提高局部的藥物濃度，增強局部抗結(jié)核桿菌的效果[4-5]。藥代動力學研究證明保持病灶周圍持續(xù)穩(wěn)定的有效殺菌濃度是殺滅結(jié)核桿菌的關(guān)鍵，INH、RFP、PZA在服藥后2 h左右血藥濃度幾乎都達到或接近峰濃度，而4～6 h進入藥物的清除相[6]。傳統(tǒng)的用藥方式使抗結(jié)核藥物在病灶局部難以起到持續(xù)的殺菌作用，是脊柱結(jié)核病療效不佳的原因之一，并容易產(chǎn)生藥物抵抗性[7-8]。保持病灶局部抗結(jié)核藥濃度大于最低殺菌濃度成為脊柱結(jié)核治療的關(guān)鍵，載有抗結(jié)核藥的緩釋材料由此被引入脊柱結(jié)核的治療。Makino等[9]將RFP包被于微球中，發(fā)現(xiàn)其釋放周期可達20 d。伍衛(wèi)剛等[10]研制出能承載多藥并有控釋特性的載藥人工骨，該控釋載藥人工骨具有藥物控釋和緩釋特性，可以同時實現(xiàn)藥物聯(lián)合治療與骨缺損修復的治療。然而這些研究存在載藥單一或未描述體外抗結(jié)核性能的不足。目前脊柱結(jié)核術(shù)后骨缺損重建的材料主要有自體骨、異體骨、骨修復材料等[11]，其中自體骨及異體骨在臨床應(yīng)用中取得了良好的效果[12]，然而由于來源有限、可能導致傳染病的傳播等問題使其應(yīng)用受到限制。骨修復材料縮短了成骨時間，提高了成骨質(zhì)量[13]，而以骨修復材料為藥物緩釋體系的載體，更能達到修復骨缺損和藥物治療的雙重目的。醫(yī)用硫酸鈣是普遍應(yīng)用的人工材料之一，具有極強的生物相容性、高效誘導成骨活性及骨爬行替代作用，降解吸收的速率與新骨形成基本一致[14-15]，是一種安全可靠的骨移植替代品。且本實驗結(jié)果證實本研究所研制材料可使抗結(jié)核藥在體外較長時間保持最低殺菌濃度，殺菌效果良好。

目前結(jié)核病的確診仍然依賴于病原學檢查，有無結(jié)核分枝桿菌生長是診斷結(jié)核病的“黃金標準”[16]。傳統(tǒng)的結(jié)核桿菌檢測方法有抗酸染色法(AFP)、改良羅氏法(L-J)分離培養(yǎng)、核酸擴增法、基因測序法等，方法眾多，但是均存在不同的缺點。BacT/ALERT 3D快培系統(tǒng)采用全封閉式的比色法原理，通過比色計傳感器和反射光感應(yīng)結(jié)核桿菌生長代謝產(chǎn)生的CO2，利用培養(yǎng)瓶底部的指示劑顏色變化來連續(xù)自動顯示培養(yǎng)瓶內(nèi)是否有細菌生長。其檢測速度接近被譽“金標準”的BACTEC 460系統(tǒng)[17]，陽性檢出時間為11.8～21 d[18]，陽性率為44%[19]。

本研究經(jīng)BacT/ALERT 3D系統(tǒng)對A、B各亞組培養(yǎng)，其結(jié)果差異均具統(tǒng)計學意義 (P<0.05)，證明A組各亞組均有效殺滅結(jié)核桿菌，且殺菌作用持續(xù)到第84天；A12W培養(yǎng)陽性率為55%，相較與A4W、A8W殺菌作用已變?nèi)?。C組為空白對照組，經(jīng)BacT/ALERT 3D系統(tǒng)培養(yǎng)后結(jié)核桿菌生長良好，說明此液體培養(yǎng)基適合結(jié)核桿菌生長，排除了結(jié)核桿菌及液體培養(yǎng)基對本實驗的影響。B組為實驗對照組，其生長狀況除取決于結(jié)核桿菌與液體培養(yǎng)基外，還受未載藥人工緩釋材料浸提液的影響。B、C各亞組之間差異無統(tǒng)計學意義，說明未載藥人工緩釋材料浸提液對結(jié)核桿菌的生長無影響，排除了其對本實驗的影響。文獻報道血液或細胞內(nèi)抗結(jié)核藥物濃度要達到最低抑菌濃度10倍以上才能殺滅結(jié)核桿菌，即最低殺菌濃度。目前已知INH、RFP、PZA的最低抑菌濃度為0.05 μg/mL、0.05 μg/mL、20 μg/mL，可得3種藥最低殺菌濃度為0.5 μg/mL、0.5 μg/mL、200 μg/mL。第4周時，INH、RFP、PZA濃度均顯著高于其最低殺菌濃度，經(jīng)BacT/ALERT 3D系統(tǒng)培養(yǎng)后亦能充分殺滅結(jié)核分枝桿菌。第8周時，INH、RFP濃度仍顯著高于其最低殺菌濃度，PZA濃度稍高于其最低殺菌濃度，經(jīng)BacT/ALERT 3D系統(tǒng)培養(yǎng)后其陽性率低于第4周，分析原因可能由于PZA濃度降低導致其殺菌效果減弱。第12周時，INH濃度稍高于其最低殺菌濃度，PZA濃度遠遠低于最低殺菌濃度，RFP濃度已測不到。理論上此浸提液殺菌效果應(yīng)低于第4、8周，經(jīng)BacT/ ALERT 3D系統(tǒng)培養(yǎng)的結(jié)果也驗證了此假設(shè)。

本研究表明復合三聯(lián)抗結(jié)核藥硫酸鈣/聚氨基酸人工緩釋材料在體外具有殺滅結(jié)核桿菌作用，其抗結(jié)核作用隨著3種藥在體外濃度的降低而降低。隨著抗結(jié)核藥的應(yīng)用，體內(nèi)結(jié)核桿菌含量減少，但同時可能誘導結(jié)核桿菌產(chǎn)生耐藥性，國內(nèi)李亮等[20]得出化療2個月內(nèi)及2個月以上標本培養(yǎng)陽性率有差異。因此該載藥緩釋材料在體內(nèi)是否能夠維持局部在最低殺菌濃度以上且能有效的殺滅結(jié)核桿菌，尚需進一步的體內(nèi)試驗證明。

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