鄔 均，胡運(yùn)玖，左 奕，李吉東，李玉寶，蔣電明

微球制劑是目前國(guó)內(nèi)外藥學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，用生物可降解材料作為藥物載體，通過(guò)注射或植入給藥，在局部緩慢釋放藥物，減少給藥次數(shù)，并能維持局部較長(zhǎng)時(shí)間的高藥物濃度。目前研究和應(yīng)用最廣泛的微球載體材料是聚乳酸-聚乙醇酸共聚物[Poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA]。PLGA具有良好的生物相容性及生物可降解性，無(wú)毒、無(wú)刺激性，被美國(guó)食品與藥物管理局批準(zhǔn)廣泛運(yùn)用于載藥系統(tǒng)研制[1]。利福噴丁與利福平同屬利福霉素家族，兩者抗菌譜及作用機(jī)制相似，同被美國(guó)Medical Letter治療指南(2007年)列為一線抗結(jié)核藥物，但利福噴丁抗結(jié)核桿菌作用明顯高于利福平，與異煙肼聯(lián)合用藥的作用更強(qiáng)，且利福噴丁半衰期更長(zhǎng)、不良反應(yīng)更輕微，與利福平相比具有高效、長(zhǎng)效、低毒的特點(diǎn)[2]。

本研究通過(guò)乳化-溶劑揮發(fā)法制備載利福噴丁/PLGA微球，通過(guò)形貌、粒徑及分布、載藥量及包封率等評(píng)價(jià)載藥微球質(zhì)量，并對(duì)載藥微球體外釋放特性進(jìn)行研究，以期獲得一種有效的抗結(jié)核制劑。

1 材料及方法

1.1 材料及試劑

PLGA(50∶50，平均分子量45 000，山東岱罡生物技術(shù)公司)；利福噴丁原藥(分裝，德國(guó)Ruibio公司)；Viskase透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量3 500，美國(guó)聯(lián)合碳化公司)。結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌毒株H37Rv(重慶市結(jié)核基因診斷中心實(shí)驗(yàn)室)。二氯甲烷、聚乙烯醇、甲醇(上海阿拉丁試劑公司)均為分析純級(jí)。

1.2 儀器

JJ-1型精密增力電動(dòng)攪拌器(常州國(guó)華電器有限公司)；FD-1A-50型冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；TE2000-U型倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)；JEOL-6500LV型掃描電鏡(日本電子公司)；JL-6000型激光粒度儀(四川成都精新粉體測(cè)試設(shè)備有限公司)；754型紫外分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 載利福噴丁微球/PLGA制備

采用乳化-溶劑揮發(fā)法(O/W法)[1,3]制備載利福噴丁/PLGA微球。準(zhǔn)確稱取1 g PLGA溶于10 mL二氯甲烷溶液，超聲溶解完全后，加入400 mg利福噴丁原藥，溶解混勻形成油相。將油液緩慢滴加至攪拌著的含有2%PVA的100 mL水溶液，高速攪拌乳化30 min，形成O/W乳液。攪拌速率下調(diào)為約250 r/min，持續(xù)均速攪拌至二氯甲烷揮發(fā)完全。靜置1 h后離心收集微球，用去離子水反復(fù)洗滌、離心3次。將所得微球轉(zhuǎn)移至西林瓶中，置于低溫冷凍干燥機(jī)中凍干。-20℃密封保存?zhèn)錂z。

1.3.2 形貌觀察

取少量載藥微球分散于蒸餾水中，滴加至載玻片，在光學(xué)顯微鏡下觀察微球形貌。另取適量載利福噴丁/PLGA微球用蒸餾水分散于導(dǎo)電膠上，蒸發(fā)干燥后鍍金，掃描電鏡下觀察微球形貌。

1.3.3 粒徑及其分布

將適量載利福噴丁/PLGA微球加入激光粒度儀，同時(shí)滴加2滴分散劑，激光粒度儀分析測(cè)定微球粒徑。微球平均粒徑以中值粒徑D50表示，采用跨距評(píng)價(jià)粒徑分布情況，跨距=(D90-D10)/D50。

1.3.4 載藥量及包封率測(cè)定

配制不同濃度梯度的利福噴丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，并在475 nm波長(zhǎng)處紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度，繪制利福噴丁紫外吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線。

準(zhǔn)確稱取載利福噴丁/PLGA微球10 mg，加入10 mL甲醇溶劑，(37±1)℃恒溫震蕩至載藥微球完全變白，離心，取上層液體2.5 mL，甲醇溶液稀釋至25 mL。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其吸光度值，并采用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算利福噴丁濃度。根據(jù)以下公式計(jì)算載利福噴丁/PLGA微球的載藥量及包封率：載藥量(%)=微球中所含利福噴丁質(zhì)量/微球質(zhì)量×100%；包封率(%)=微球中所含利福噴丁質(zhì)量/投入福噴丁質(zhì)量×100%

1.3.5 利福噴丁抗結(jié)核分枝桿菌最低抑菌濃度

結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌毒株H37Rv接種于改良羅氏培養(yǎng)基，37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)4周，選取單個(gè)較大菌落，配制成結(jié)核分枝桿菌菌懸液(1 mg/mL)，過(guò)濾后菌懸液分裝于無(wú)菌菌種保存管，-70℃保存?zhèn)溆肹4]。

將利福噴丁溶解于無(wú)菌去離子水，取不同量加入改良羅氏培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基含有利福噴丁濃度分別為32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0. 500 μg/mL、0.250 μg/mL、0.125 μg/mL和0 μg/mL。85℃凝固滅菌1 h后取出，無(wú)菌試驗(yàn)合格后備用。

將凍藏于-70℃的菌懸液室溫溶解，稀釋至0.01 mg/mL。用微量加樣器吸取0.1 mL分別接種于上述培養(yǎng)基上。5% CO2孵箱中37℃培養(yǎng)4周觀察結(jié)果，完全無(wú)結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)的利福噴丁最低濃度培養(yǎng)基為該藥物的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)。

1.3.6 體外釋放實(shí)驗(yàn)

精確稱取載利福噴丁/PLGA微球10 mg，裝入透析袋內(nèi)，扎緊并完全浸入10 mL PBS緩沖溶液(0.2 mol/L，pH=7.4)。37.1℃恒溫振蕩箱中，以100 r/min震蕩。于預(yù)設(shè)時(shí)間點(diǎn)取出PBS緩沖液，并加入10 mL新鮮PBS緩沖液。離心并取上層清液，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算利福噴丁濃度。每份樣品重復(fù)試驗(yàn)3次。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算利福噴丁累積釋放量及藥物累積釋放百分率，繪制時(shí)間-累計(jì)釋放百分率曲線。

2 結(jié) 果

2.1 微球形貌觀察

大體觀察，微球外觀呈橘紅色細(xì)粉狀，無(wú)聚集成團(tuán)。光鏡下微球呈橘黃色球狀，微球分散好，無(wú)粘連(見(jiàn)圖1a)。掃描電鏡下載藥微球呈圓球狀，均勻分散，無(wú)粘連成團(tuán)，大小較均一(見(jiàn)圖1b)；放大后觀察，微球表面致密、光滑(見(jiàn)圖1c)。

2.2 微球粒徑分布

載利福噴丁/PLGA微球粒徑分布情況采用激光粒度儀分析，結(jié)果如圖2所示。載藥微球體積平均粒徑D50為25.49 μm，跨距為1.59，粒徑分布范圍較窄，表明所制備的微球粒徑均勻。

2.3 微球載藥量及包封率測(cè)定

載利福噴丁/PLGA微球的載藥量及包封率分別為21.37%±0.16%和 74.79%±2.71%。

2.4 利福噴丁抗結(jié)核分枝桿菌最低抑菌濃度

觀察發(fā)現(xiàn)，在2 μg/mL及更高濃度的培養(yǎng)基中完全無(wú)結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)，而在更低濃度的培養(yǎng)基中可見(jiàn)數(shù)量不等的菌落。因此，利福噴丁抗結(jié)核分枝桿菌的最低抑菌濃度為2 μg/mL。

2.5 載利福噴丁/PLGA微球體外釋放實(shí)驗(yàn)

載利福噴丁/PLGA微球體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制時(shí)間-累計(jì)釋放百分率曲線，如圖3所示。

a: 光鏡 (×40) b: 掃描電鏡(×50) c: 掃描電鏡 (×1 000)

a: Light microscope (×40) b: Scanning electron microscope (×50) c: Scanning electron microscope (×1 000)

圖1光鏡及掃描電鏡觀察微球形貌

Fig.1Morphology of rifapentine-loaded PLGA microspheres

圖2載利福噴丁/PLGA微球粒徑分布

Fig.2Grain-size distribution of rifapentine-loaded PLGA microspheres

由表1和圖3可看出，利福噴丁原藥僅2 d釋藥量就為94.25%±3.74%，第3天釋藥量低于最低抑菌濃度。載利福噴丁/PLGA微球體外釋放存在明顯的兩相性，即突釋相和緩釋相。在最初12 h突釋相內(nèi)利福噴丁釋放量占載藥微球中藥物含量的37.08%±1.68%，12 h后載藥微球釋藥速度減慢，35 d后體外累積釋放量達(dá)80.67%±0.97%。載利福噴丁/PLGA微球在實(shí)驗(yàn)周期(0～35 d)內(nèi)任一時(shí)間點(diǎn)的藥物釋放濃度均高于利福噴丁抗結(jié)核分枝桿菌的最低抑菌濃度。由此可知，載利福噴丁/PLGA微球具有良好的緩釋性能，利福噴丁可從載藥微球中持續(xù)釋放。

表1利福噴丁及載利福噴丁/PLGA微球體外釋放

Tab.1In vitro release of pure rifapentine and rifapentine-loaded PLGA microspheres

時(shí)間點(diǎn)/dTime/d利福噴丁濃度/μg·mLConcentration of rifapentine/μg·mL利福噴丁Rifapentine載利福噴丁/PLGA微球Rifapentine-loaded PLGA microspheres0.17493.5±6.832.7±2.10.33233.8±3.423.1±0.90.50196.6±5.423.5±3.6115.4±0.510.5±1.923.3±0.213.9±1.830.9±0.210.1±1.27-?12.5±1.314-?13.9±0.821-?12.8±1.128-?9.8±0.835-?9.7±0.9

注：*利福噴丁原藥在第3天釋藥量低于其抗結(jié)核分枝桿菌的最低抑菌濃度，故未繼續(xù)測(cè)量

Note: *Release dosage of pure rifapentine below its minimum inhibitory concentration against Mycobacterium tuberculosis in the third day. So the meansurenent did not continue

圖3利福噴丁原藥及載利福噴丁/PLGA微球體外釋放曲線

Fig.3In vitro release profile of pure rifapentine and rifapentine-loaded PLGA microspheres

3 討 論

骨與關(guān)節(jié)結(jié)核是臨床上常見(jiàn)的肺外結(jié)核，約50%累積脊柱，脊柱結(jié)核占全部結(jié)核的3%～5%。脊柱結(jié)核易導(dǎo)致脊柱失穩(wěn)、后凸畸形及脊髓神經(jīng)功能障礙，約10%脊柱結(jié)核患者并發(fā)截癱，給患者健康和生活質(zhì)量造成巨大的影響[5]。脊柱結(jié)核治療主要包括全身治療(休息、營(yíng)養(yǎng)、支持治療)、抗結(jié)核藥物化療及外科手術(shù)治療[6]。藥物化療是脊柱結(jié)核治療的基礎(chǔ)，有效殺滅結(jié)核桿菌是治愈脊柱結(jié)核根本措施，化療應(yīng)嚴(yán)格遵循早期、規(guī)律、全程、聯(lián)合、適量的原則，具體治療方案可參考我國(guó)骨與關(guān)節(jié)結(jié)核標(biāo)準(zhǔn)化療方案和短程化療方案[7-8]。脊柱結(jié)核外科治療適用于脊柱穩(wěn)定性破壞、嚴(yán)重或進(jìn)行性后凸畸形、脊髓受壓伴神經(jīng)功能障礙，其目的是徹底清除病變組織，提高組織修復(fù)能力，解除脊髓神經(jīng)壓迫，矯正畸形，重建脊柱穩(wěn)定性。結(jié)核病灶的徹底清除是各種術(shù)式的基礎(chǔ),除了徹底清除死骨、干酪樣壞死物質(zhì)、膿腫、結(jié)核肉芽、被破壞的椎間盤等組織，應(yīng)特別注意徹底刮除病灶周圍硬化骨。硬化骨不僅不利于局部植骨融合，還是抗結(jié)核藥物進(jìn)入病灶的巨大屏障，而且硬化骨中含有較多的結(jié)核桿菌，如果不徹底清除，可能成為術(shù)后復(fù)發(fā)的根源[9]。但傳統(tǒng)的脊柱結(jié)核病灶清除術(shù)很難將病灶徹底清除，臨床醫(yī)生常規(guī)在病灶處空腔內(nèi)噴灑適量普通劑型的抗結(jié)核藥物，但普通劑型抗結(jié)核藥物容易被機(jī)體代謝，術(shù)后復(fù)發(fā)率高(1.28%～25%)[10]。因此，研發(fā)出一種能在病灶局部緩慢釋放，進(jìn)而發(fā)揮持續(xù)殺滅結(jié)核桿菌的新型制劑成為亟待解決的問(wèn)題。

微球制劑通過(guò)載體向患部持續(xù)和高濃度地釋放藥物以達(dá)到臨床治療目的，有利于提高藥物療效、降低毒副作用，對(duì)于提高臨床用藥水平來(lái)說(shuō)具有重大意義[11]。微球制劑的載體是高分子材料，按降解性分為不可降解生物材料(聚丙烯、乙基纖維素等)和可降解生物材料，后者包括天然高分子材料(白蛋白、明膠、殼聚糖、海藻酸鹽等)和合成高分子材料(聚乳酸、PLGA、聚己內(nèi)酯等)[12]。生物降解性合成高分子材料無(wú)毒性，生物相容性好，可完全生物吸收或降解，不需二次手術(shù)取出，并能通過(guò)調(diào)整聚合物的組成或分子量的大小調(diào)整降解速度和藥物釋放速度，以滿足臨床需求。PLGA是目前研究最為廣泛的可降解性合成高分子微球載體材料，截止到目前，已經(jīng)有8種PLGA可注射微球型劑被美國(guó)食品與藥物管理局批準(zhǔn)用于臨床[1,11,13]。

利福噴丁為半合成利福霉素類抗生素，通過(guò)與依賴DNA的RNA多聚酶的亞單位牢固結(jié)合，抑制細(xì)菌RNA的合成，在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮殺菌作用[14]。利福噴丁與利福平同為一線抗結(jié)核藥物，其最低抑菌濃度為0.12 ～0.25 mg/L，比利福平強(qiáng)2～10倍，且利福噴丁半衰期為18 h，明顯長(zhǎng)于利福平(3～5 h)。與利福平相比，利福噴丁能維持局部更長(zhǎng)時(shí)間的有效抑菌濃度和更加高效的抑菌效果。

本研究采用PLGA為微球載體材料，采用利福噴丁作為模型藥物，通過(guò)乳化-溶劑揮發(fā)法制備載利福噴丁/PLGA微球。形貌觀察及粒徑分析結(jié)果表明微球呈橘黃色，分散性好，無(wú)粘連現(xiàn)象，微球成球形態(tài)良好，微球表面致密、光滑，無(wú)凹凸現(xiàn)象，粒徑分布較均勻。

載藥量和包封率是衡量微球制備工藝的個(gè)重要指標(biāo)。載藥量是微球中所含目標(biāo)藥物的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)，提高的載藥量不僅可以節(jié)約所需載體材料量，還可以提高組織對(duì)目標(biāo)藥物的攝取效率。包封率是微球?qū)嶋H載藥量與理論載藥量的比值，包封率越高，在制備過(guò)程中所浪費(fèi)的目標(biāo)藥物就越少。因此，載藥量和包封率越高越好。影響微球載藥量及包封率的主要因素有PLGA的組成、目標(biāo)藥物的理化性質(zhì)、各溶劑相用量、微球制備方法和參數(shù)[15]。本研究所制備的利福噴丁/PLGA微球的載藥量及包封率分別為21.37%±0.16%和 74.79%±2.71%，高于Dutt等[16]報(bào)道的12%～14%載藥量。

載藥微球的藥物釋放動(dòng)力學(xué)特性是評(píng)價(jià)微球質(zhì)量的內(nèi)在指標(biāo)，是微球質(zhì)量控制的重要手段。隨著研究的不斷深入，對(duì)微球制劑的藥物釋放有了更高層次的要求，即從僅要求平穩(wěn)的血藥濃度提高到要求釋藥速度能使靶位在治療所需的時(shí)間內(nèi)維持合適的藥物濃度。本研究制備的載利福噴丁/PLGA微球體外藥物釋放可以分為突釋階段和緩釋階段。在突釋階段，載藥微球釋放利福噴丁速度較快，藥物釋放量約占微球藥物含量的40%，可能是表層吸附藥物的釋放。隨后藥物釋放速度減慢，呈現(xiàn)持續(xù)而緩慢的藥物釋放，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的利福噴丁釋放濃度均大于其最低抑菌濃度，35 d后體外累積釋放量達(dá)80%。這種2階段藥物釋放特性對(duì)脊柱結(jié)核的治療有重要作用，突釋階段的藥物快速釋放可使病灶快速達(dá)到有效的抑菌濃度，殺滅術(shù)后病灶殘留的結(jié)核桿菌，而后期穩(wěn)定的藥物釋放可使局部得以維持較長(zhǎng)時(shí)間有效殺菌藥物濃度，防止結(jié)核復(fù)發(fā)。

采用乳化溶劑揮發(fā)法制備的載利福噴丁/PLGA微球，載藥微球成球形良好，平均粒徑為25.49 μm，具有較高的載藥量及包封率，體外釋放結(jié)果顯示其具有穩(wěn)定的緩釋作用，35 d后利福噴丁釋放濃度仍是利福噴丁體外抗結(jié)核分枝桿菌最低抑菌濃度的5倍，可作為一種較為理想的抗脊柱結(jié)核藥物釋放系統(tǒng)。尚需進(jìn)一步對(duì)載藥微球生物相容性、體內(nèi)降解及體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)等進(jìn)行研究。

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